이 프로토콜의 목적은 포유류 위장관에서 칸디다 알비칸스 세포 모양 및 국소화를 시각화하는 것입니다.
칸디다 알비칸스는 인간과 다른 많은 포유류에서 장내 미생물의 곰팡이 성분입니다. C. albicans는 대부분의 식민지 호스트에 있는 현상을 일으키는 원인이 되지 않더라도, 공생 저장소는 전염병을 위한 저장소역할을 하고, 창자에 있는 높은 진균 역가의 존재는 선동적인 장 질병과 연관됩니다. 여기서, 우리는 안정적인 위장 식민지의 마우스 모델에서 C. albicans 세포 형태및 국소화를 시각화하는 방법을 설명한다. 식민지는 경구 항생제로 처리 된 동물에서 C. 알비 칸의 단일 복용량을 사용하여 설립된다. 창자 조직의 세그먼트는 발광 내용체 (미생물 및 점액)뿐만 아니라 숙주 점막의 구조를 보존하는 방식으로 고정됩니다. 마지막으로, 실화에서 형광은 C. 알비칸및 하이픈에 대한 얼룩을 진균 rRNA에 대하여 프로브를 사용하여 수행된다. 이 프로토콜의 주요 장점은 C. albicans 세포 형태와 위장 식민지 동안 숙주 구조와의 공간 협회의 동시 관찰을 허용 한다는 것입니다.
칸디다 알비칸스는 곰팡이 공생뿐만 아니라 기회 인간 병원체입니다. 이 효모는 정의된 환경 틈새 시장이 결여되고 대신 인간과 그밖 포유동물의 위장관 (GI) 관, 피부 및 비뇨 생식기 내의전파1. C. albicans에 초기 연구는 그것의 독성 잠재력에 주로 초점을 맞춘 반면, 몇몇 최근 보고서는 창 자 내에서 유기 체를 전파 하는 것이 정상적인 건강에 중요 한 역할을 할 수 있습니다 제안, 의 면역 개발을 포함 하 여 호스트2,3,4. 포유류 장 내의 C. albicans 의 기원에 대한 조사를 용이하게 하기 위해, 우리는 안정적인 GI 식민지화의 마우스 모델을 개발하고 현장 혼성화 (FISH) 기반 의 형광 을 통해 곰팡이 효모 세포와 하이픈을 시각화하는 방법 장 내강자.
몇 가지예외5,실험실 에서 자란 마우스는 일반적으로 소화관의 곰팡이 식민지화에 대한 저항성을 나타낸다. 식민지 저항은 특정 세균성 종에 의해 중재 될 것으로 생각 된다; 그러나, 이것은 항생제6,7 또는 아마도 세균 종 조성물을 변경하는 화학적으로 정의 된 식이요법의 사용으로 동물의 치료에 의해 극복 될 수있다8,9. 유사하게, 인간에서, 광범위한 항생제의 사용은 C. albicans 과성장 및 보급 과성장과 연관되었습니다10. 우리의 뮤린 식민지 화 모델은 광범위한 항생제를 사용하여 C. albicans 면역 적격, 종래의 사육 된 마우스의 식민지화를 확립합니다. 페니실린과 스트렙토마이신은 C. 알비칸스의 108 개의 식민지 형성 단위 (CFUs)로 위장하기 전에 일주일 동안 동물의 식수에 제공됩니다. 항생제 주입 물이 계속되는 한, C. albicans는 10 6-108 CFU/g의 대변역가에 도달하여 위장관을 통해 전파됩니다. 곰팡이 식민지의 높은 수준에도 불구하고, 동물은 건강하게 유지하고 감염되지 않은 대조군과 같은 속도로 체중을 얻는다. 이 모델은 여러 C. albicans 의 비열성 요인11,12를스크리닝하고 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
곰팡이 왕국의 다른 구성원과 마찬가지로, C. albicans는 엄청난 형태 학적 가소성13할 수있다 . 시험관내 조건하에서, 적어도 6개의 단세포 효모 세포 유형들 사이에서 전이하는 것으로 나타났으며, 다세포 하이페 및 가성하이파뿐만 아니라. 효모-하이파 전이는 가장 잘 특징지어지는 독성 속성 중 하나이며, 대부분의 포유류 질병 모델뿐만 아니라 감염된 인간 조직에서 하이페와 슈도하이파가 우세하다. Murine 소화관 내의 C. albicans 현지화 및 세포 형태학을 결정하기 위하여, 우리는 고정된 조직학 단면도에 효모 및 hyphae를 염색하기 위한 FISH 기술을 개발했습니다. 프로브는 곰팡이 세포질 에 걸쳐 분포되는 곰팡이 23S 리보소말 RNA (rRNA)에 혼성화형형으로 표지된 DNA 올리고뉴클레오티드로 구성됩니다. 숙주 조직은 숙주 점막, 소화 물질, 세균성 미생물 및 장 내 점액을 포함한 장의 3 차원 구조를 보존하는 방식으로 고정되기 때문에이 기술은 곰팡이의 국소화를 허용합니다. 얼룩이 있을 때 이러한 랜드마크와 관련하여 세포를 제거합니다. FISH 기술은 주기산 Schiff (PAS) 또는 고모리의 메테나민 실버 (GMS)와 같은 곰팡이에 대한 전통적인 조직 학적 얼룩뿐만 아니라 시판되는 항진균 항체와 유리하게 비교됩니다. C. 알비칸스. 또한, 표준 고정제는 점액 층을 제거하고 창자 루멘14,15의다른 내용을 방해한다.
이 문서에서는, 우리는 마우스 위장관의 고급 C. albicans 식민지를 확립하기위한 자세한 지침을 제공합니다, 안락사 동물에서 소화 관의 해부, 발광을 보존하는 방식으로 조직 고정에 대한 FISH를 사용하여 숙주 조직 내에서 C. 알비칸스를 검출할 수 있습니다. C. albicans의 야생 모형 그리고 돌연변이 긴장 이외에, gavage 기술은 그밖 미생물을 전달하기 위하여 이용될 수 있습니다. 고정 기술은 창자 내용물의 보존이 요구되는 모든 연구에 유용 할 것입니다. FISH 절차는 하루 안에 완료될 수 있으며 여러 개의 차별화된 프로브를 사용하여 여러 곰팡이 종을 현지화하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에 기술된 방법은 어떤 성또는 균주의 공동식민지화된 마우스의 기관에서 C. 알비칸스 효모 및 하이픈의 시각화를 허용한다. FISH 프로브는 곰팡이 세포질 에 걸쳐 분포되는 23S rRNA로 혼성화됩니다. 우리의 방법은 창자 박테리아를 시각화하기 위한 이전에 보고된 프로토콜에서 적응되었습니다20. C. albicans는 호스트 내의 그것의 형태를 바꾸기 때문에, 방법은 진균 세포 모양 뿐만 아니라 현지화를 감시하기 위하여 유용합니다. 예를 들어, 우리는 효모가 소화관 전체에 우세하다는 가설을 반증하고, 특정 “필라멘션-결함” 돌연변이체의 생체내 표현형과 체외 표현형 사이의 불일치를 드러내기 위해 이 방법을 사용하였다12.
C. albicans 공존 식민지에 대 한 여러 마우스 모델 존재. 실험실 마우스와 인간의 microbiota는 구별 하 고, 쥐에서, 항생제 또는 전문된 다이어트의 사용 안정적인 식민지를 설정 하는 데 필요한. 항생제를 가진 처리는 또한 C. albicans 인간을 강화하고 전파한 질병10를위한 중요한 위험 요소입니다. 이 연구에서 사용된 항생제는 상대적으로 저렴하고 세균성 미생물의 신뢰할 수 있는 감소를 산출한다. 항생제는 동물에서 모든 박테리아를 제거 하지, 길 항 성 세균 종의 부담을 줄이기 위해 사용 됩니다. 연구원은 C. albicans-박테리아의부재에 호스트 상호 작용을 공부 하고자 하는 경우 또는 항생제 또는 특별 한 다이어트의 사용을 피하기 위해, 세균 없는 동물 은 전통적으로 사육 동물에 대 한 대체 될 수 있다; 그러나, gnotobiotic 마우스 전시 특정 면역 및 해부학 이상 및 따라서 모든 목적에 적합 하지 않을 수 있습니다.
성공적인 FISH 염색을 위해 몇 가지 단계가 중요합니다: 권장되는 고정 방법은 GI 조직의 구조적 무결성, 특히 점액 층 및 3차원과 같은 장 루멘의 깨지기 쉬운 내용체를 보존하는 데 중요합니다. 곰팡이와 박테리아의 조직16. 물을 포함하는 많은 일반적으로 사용되는 고정 솔루션은 발광 아키텍처에 매우 손상을 입힙니다. 이 프로토콜에서 권장하는 고정식 세차용 고정식 및 솔루션에는 물이 포함되어 있지 않으며, 물에 대한 오염을 피하는 것이 중요합니다. 또 다른 중요한 단계는 혼성화 오븐에서 슬라이드의 배양 동안 혼성화 용액의 증발을 피하는 것이 중요한 혼성화 단계이다. 이 문제를 피하기 위해 슬라이드를 방수 용기에 넣는 것이 좋습니다. 양자택일로, 하나는 마이크로어레이의 혼성화를 위해 원래 사용된 것과 같은 방수 혼성화 챔버를 사용할 수 있습니다.
C. 알비칸스-특정FISH 프로브는 이 프로토콜에 설명되어있다. 그러나, 많은 실험실 사육 마우스 그들의 자연적인 창 자 microbiota의 일환으로 C. albicans 또는 다른 곰 팡이 포함 하지 않기 때문에, panfungal 프로브 는 실험적으로 식민지 동물에서 C. 알비칸스를 구체적으로 얼룩 수 있습니다. 판곰팡이 프로브의 치환은 우수한 혼성화 특성과 더 높은 신호 대 잡음 비 로 인해 바람직할 수 있습니다. panfungal 프로브가 C. albicans에대한 의사 특이적 프로브로 사용되는 경우, 감염되지 않은 동물 (즉, 항생제로 치료하지만 C. albicans)에서염색의 부족을 문서화하는 것이중요합니다. 비식민지화된 대조군 동물의 염색은 또한 FISH 프로브를 식품 미립자까지 준수함으로써 발생할 수 있는 배경 염색을 평가하는 데에도 유용합니다. 전반적으로, FISH 프로브의 사용은 칼코플루어 백색 (키틴, 세포 모형 사이에서 다를 수 있는 세포벽 분대), GMS, 또는 상업적으로 이용가능한 항진균성 항체와 같은 곰팡이염색의 대부분의 다른 방법에 비해 향상된 특이성을 제공한다. 또한, 물고기 염색은 종 특정 rRNAs에 차별화 표지 된 물고기 프로브를 사용하여 여러 유기체의 코스타링을 허용합니다.
이 기술의 한 가지 주의점은 특정 C. albicans 효모 세포 유형이 FISH (예 : 불투명 및 GUT 세포 유형)에 의해 매우 유사하다는 것입니다. 이러한 세포 유형 사이에서 구별하기 위해, 세포 유형 별 곰팡이 mRNA에 혼성화 프로브를 개발하는 것이 유용 할 것이다. 그럼에도 불구하고, 현재의 형태로, FISH 기술은 이미 두 조건 하에서 평가된 C. albicans 돌연변이체의 생체 내 행동과 체외 행동 사이의 놀라운 불일치를밝혀냈으며,이는 기존 시험관 내 검사법에 의해 적절히 모방되지 않은 자연 적인 환경. 추가 야생 유형 및 돌연변이 호스트에 다른 C. albicans 얼룩의 추가 연구 곰 팡이 호스트 상호 작용에 추가 통찰력을 얻을 가능성이. 특히, 인간21에서 C. 알비칸스의 높은 적분과 연관되는 염증성 장 질환의 모델에서 C. albicans를 프로파일화하는 것이 유익할 것이며, 다른 모델인 C. albicans 과성장 및 질병의 다른 모델이다. FISH 기술은 또한 특정 숙주 세포를 얼룩화하기 위하여 면역성화학과 결합될 수 있습니다. 전반적으로, 여기에 제시된 방법은 포유류 기관 내의 C. 알비칸스 국소화 및 형태를 결정하는 합리적으로 빠르고 신뢰할 수 있는 수단을 제공한다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 FISH 기술 개발에 지도에 대한 캐롤라이나 트로피니, 캐서린 Ng, 저스틴 소넨 버그, KC 황에게 감사드립니다. 테레사 오메라(Teresa O’Meara)는 원고에 대한 유용한 의견을 제공했고, 미리암 레비는 사진 촬영을 도왔다. 이 작품은 NIH 교부금 R01AI108992, R01DK113788, 및 감염증의 병인에서 버로우 환영 상에 의해 지원되었다.
1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
LB | can be substituted from any vendor | ||
Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
YEPD | can be substituted from any vendor |