Här beskriver vi den metod vi använde för att avbilda mycket rörliga dendritiska filopodia i en levande förberedelse av Drosophila larv hjärnan, och det protokoll vi utvecklat för att kvantifiera tidsförlopp 3D Imaging dataset för kvantitativa bedömningar av Dendrit dynamik i utvecklingen av nervceller.
Mycket rörliga dendritiska filopodia är allmänt närvarande i nervceller på tidiga utvecklingsstadier. Dessa undersökande dynamiska grenar prov den omgivande miljön och initiera kontakter med potentiella synaptiska partners. Även om sambandet mellan dendritiska grenen dynamik och synaptogenes är väl etablerad, hur utvecklings-och aktivitetsberoende processer reglera dendritiska gren dynamik är inte förstått. Detta beror delvis på de tekniska svårigheterna i samband med levande avbildning och kvantitativa analyser av dessa fina strukturer med hjälp av ett in vivo-system. Vi etablerade en metod för att studera Dendrit dynamik med hjälp Drosophila larv ventrala laterala nervceller (lnvs), som kan vara individuellt märkta med genetiska metoder och är tillgängliga för Live Imaging. Dra nytta av detta system, utvecklade vi protokoll för att fånga gren dynamiken i hela dendritiska Arbor av en enda märkt LNv genom time-lapse Live Imaging. Vi utförde sedan efter bearbetning för att förbättra bildkvaliteten genom avdrift korrigering och deconvolution, följt av att analysera gren dynamiken på en gren nivå genom att kommentera rumsliga positioner av alla gren terminaler. Slutligen utvecklade vi R-skript (kompletterande fil) och specifika parametrar för att kvantifiera filialens dynamik med hjälp av den koordinatinformation som genererats av terminalspårningen. Kollektivt, detta protokoll tillåter oss att uppnå en detaljerad kvantitativ beskrivning av gren dynamiken i neuronala dendritiska Arbor med hög temporala och rumsliga upplösning. De metoder vi utvecklat är i allmänhet tillämpas på glest märkta neuroner i både in vitro-och in vivo villkor.
Dendriter är specialiserade neuronala fack som tar emot och bearbetar sensoriska och synaptiska indata. Den komplexa och stereotypa strukturen av dendritiska arbors har varit under intensiv utredning sedan deras upptäckt. Ett antal modellsystem, inklusive Xenopus Optic tectal nervceller, chick retinal ganglion celler, och dendritiska arborization (da) nervceller i Drosophila systemet, har inrättats för att studera utveckling, ombyggnad och plasticitet av neuronala dendriter1,2,3,4. Drosophila ventrala laterala neuroner (lnvs) är en grupp av visuella projektion neuroner initialt identifierats för sina viktiga funktioner i dygns reglering av flyga beteenden5. Studier avslöjade också rollen av larv lnvs som direkt postsynaptiska mål för larv fotoreceptorer (PRS)6,7. Viktigare, odling utveckla larver i olika ljus regimer starkt påverkar storleken på LNvs dendritiska arbors, visar lämpligheten av LNvs som en ny modell för att studera dendritiska plasticitet7. Nyligen arbete från vår grupp ytterligare visar att både storleken på LNV Dendrit och det dynamiska beteendet hos dendritiska grenar displayen Experience-beroende plasticitet8,9. Som en del av detta arbete har vi utvecklat en ny Live Imaging och kvantifiering protokoll för att utföra analyser på Dendrit dynamiken i lnvs från 2nd eller 3RD INSTAR larver.
Den transparenta karaktären hos Drosophila larv Brain gör den idealisk för levande avbildning. Men den dendritiska arbors av lnvs är belägna i tätt innerverade larv Optic neuropil (Lon) i mitten av larv Brain LOB6. För att fånga bilder av fina Dendrit grenar och filopodia i intakt hjärnvävnad, vi använder två-Photon mikroskopi, vilket ökar djupet av ljus inträngning och minskar fototoxicitet under Live Imaging experiment10. Med hjälp av denna inställning, vi framgångsrikt utfört Live Imaging experiment på LNvs för över 30 min utan att observera uppenbara morfologiska försämring av neuron. Dessutom, genetiska manipulationer med hjälp av flip-out tekniken möjligt för oss att märka de enskilda lnvs med ett membran taggade GFP, som också är kritisk för övervakning av förflyttningar av enskilda grenar11,12,13 .
För att fånga det dynamiska beteendet hos alla grenar på LNV dendritiska Arbor med optimal optisk upplösning, utförde vi tidsförlopp 3D-avbildning på nyligen dissekerade larv Brain djur med en hög rumslig upplösning på 1 min per ram för 10 till 30 min. utveckla LNV dendriter är mycket dynamisk, med en stor andel av grenarna visar observerbara förändringar inom 10 min fönster. Detta leder till en av de viktigaste tekniska utmaningarna i att studera Dendrit dynamik, kvantifiera gren beteende baserat på 4D bild datauppsättningar. Tidigare etablerade metoder har olika begränsningar, inklusive bristande noggrannhet och överdriven tid krav. Därför har vi utvecklat en semi-automatisk metod som kombinerar bild efter bearbetning, manuell märkning av grenterminaler, och automatisk 4D spot tracing med hjälp av en bild anteckning programvara. Vi beräknar Förflyttningar av grenterminaler vid olika tidpunkter baserat på 3D-koordinaterna för fläckarna. Data exporteras sedan och analyseras för att producera kvantitativa mätningar av filialens dynamik. Denna metod bedömer noggrant varaktigheten och omfattningen av förlängning och återgående händelser av befintliga grenar, samt bildandet av nya grenar, vilket gör att vi kan övervaka Dendrit dynamik i ett stort antal nervceller.
Här beskriver vi ett protokoll som vi utvecklat för att registrera och kvantifiera det dynamiska beteendet hos dendritiska grenar i individuellt märkta neuroner i Drosophila larv hjärnor. Särskilt vår Live Imaging-protokollet innehåller specifika parametrar som gör det möjligt för oss att fånga hela dendritiska Arbor av en larv LNV och ge en global bild av det dynamiska tillståndet i dess Dendrit grenar. Men eftersom våra kvantifieringsmetoder starkt förlitar sig på anteckningen av filial terminal…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av intramural forsknings program för nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke, National Institutes of Health. Projektnummer 1ZIANS003137.
Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Software | |||
Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
Reagents | |||
Glucose | |||
HEPES | |||
KCl | |||
MgCl2 | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
PBS | |||
Sucrose | |||
TES |