Summary
여기에서는 Drosophila 애벌레 뇌의 실시간 준비에서 매우 운동성 수지상 필로포디아를 이미지화하기 위해 사용한 방법과 수상돌기의 정량적 평가를 위해 시간 경과 3D 이미징 데이터 세트를 정량화하기 위해 개발한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 개발에 역학.
Abstract
고도의 운동성 수지상 필로포디아는 초기 발달 단계에서 뉴런에 널리 존재합니다. 이러한 탐색 동적 분기 주변 환경을 샘플링 하 고 잠재적인 시 냅 스 파트너와 접촉을 시작. 수지상 분지 역학과 시냅토 발생 사이의 연결이 잘 확립되어 있지만, 개발 및 활동 의존적 인 프로세스가 수지상 분기 역학을 조절하는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 이것은 부분적으로 생체 내 시스템을 사용하여 이러한 미세 구조의 라이브 이미징 및 정량적 분석과 관련된 기술적 어려움에 기인한다. 우리는 개별적으로 유전 접근을 사용하여 표지될 수 있고 살아있는 화상 진찰을 위해 접근할 수 있는 Drosophila 애벌레 복부 측삭 신경세포 (LNvs)를 사용하여 수상돌기 역학을 공부하는 방법을 설치했습니다. 이 시스템을 활용하여 타임랩스 라이브 이미징을 통해 단일 라벨이 부착된 LNv의 전체 수지상 아버의 분기 역학을 포착하는 프로토콜을 개발했습니다. 그런 다음 드리프트 보정 및 디톤볼루션을 통해 이미지 품질을 개선하기 위해 후처리를 수행한 다음 모든 분기 단말의 공간 위치에 별칭을 하여 단일 분기 수준에서 분기 역학을 분석했습니다. 마지막으로 터미널 추적에 의해 생성된 좌표 정보를 사용하여 분기 역학을 정량화하기 위해 R스크립트(보충 파일)및 특정 매개 변수를 개발했습니다. 전체적으로, 이 프로토콜은 우리가 높은 시간및 공간 적 분해능을 가진 신경 수지상 아버의 가지 역학의 상세한 정량적 설명을 달성할 수 있게 한다. 우리가 개발 한 방법은 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 조건 모두에서 드물게 표지 된 뉴런에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
수상돌기는 감각및 시냅스 입력을 수신하고 처리하는 특수 신경 구획입니다. 수지상 아버의 복잡하고 고정 된 구조는 발견 이후 강도 높은 조사를 받고 있습니다. 제노푸스 광학 지각 신경세포, 병아리 망막 신경절 세포, 초파리 시스템의 수지상 수공(da) 뉴런을 포함한 다수의 모델 시스템이 개발, 리모델링 및 가소성을 연구하기 위해 설립되었습니다. 신경 모수석1,2,3,4. Drosophila 복부 측측 뉴런 (LNvs)은 비행 행동의 circadian 규칙에 있는 그들의 중요한 기능을 위해 처음에 확인된 시각적 투영 뉴런의 단5. 연구는 또한 애벌레 광수용체 (P)6,7의직접적인 후발성 표적으로 애벌레 LNvs의 역할을 밝혔다. 중요한 것은, 다른 빛 정권에서 개발 애벌레를 배양하는 것은 강하게 수지상 가소성 연구를위한 새로운 모델로 LNvs의 적합성을 입증, LNvs의 크기에 영향을 미친다7. 우리 그룹의 최근 연구는 더 LNv 덴드 라이트의 크기와 수지상 가지의 동적 동작 모두 경험 의존가소성표시8,9를나타냅니다. 이 작업의 일환으로, 우리는 2nd 또는 3rd instar 애벌레에서 LNvs의 수상 돌기 역학에 대한 분석을 수행하기 위해 새로운 라이브 이미징 및 정량화 프로토콜을 개발했습니다.
Drosophila 애벌레 두뇌의 투명한 본질은 살아있는 화상 진찰을 위해 이상적입니다. 그러나, LNvs의 수지상 아버는 애벌레 뇌 엽6의중심에 조밀하게 내심이 있는 애벌레 시신경제(LON)에 위치한다. 손상되지 않은 뇌 조직에서 미세 한 모수석 가지와 필로포디아의 이미지를 캡처하기 위해 2 광자 현미경을 사용하여 빛 침투깊이를 높이고 라이브 이미징 실험10동안 광독성을 감소시킵니다. 이 설정을 사용하여, 우리는 성공적으로 뉴런의 명백한 형태 학적 악화를 관찰하지 않고 30 분 이상 LNvs에 라이브 이미징 실험을 수행했다. 또한, 플립 아웃 기술을 사용하여 유전자 조작은 우리가 또한 개별 지점의 움직임을 모니터링하기위한 중요한 멤브레인 태그 GFP로 개별 LNvs를 라벨 수있도록 11,12, 13 .
최적의 광학 해상도로 LNv 수지상 아버의 모든 가지의 동적 거동을 포착하기 위해 프레임당 1분에서 10~30분 동안 높은 공간 해상도로 새로 해부된 애벌레 뇌 이식에 대한 타임랩스 3D 이미징을 수행했습니다. 수상돌기는 매우 동적이며, 분기의 큰 비율은 10 분 창 내에서 관찰 가능한 변화를 표시합니다. 이것은 4D 이미지 데이터 세트를 기반으로 분기 동작을 정량화, 수상 돌기 역학을 공부의 주요 기술적 과제 중 하나에 이르게. 이전에 설정된 메서드에는 정확도 부족 및 과도한 시간 요구 사항을 비롯한 다양한 제한 사항이 있습니다. 따라서 이미지 후처리, 지점 단자의 수동 마킹 및 이미지 주석 소프트웨어를 사용하여 자동 4D 스팟 추적을 결합한 반자동 방법을 개발했습니다. 점점의 3D 좌표를 기준으로 서로 다른 시점에서 분기 터미널의 움직임을 계산합니다. 그런 다음 데이터를 내보내고 분석하여 분기 역학의 정량적 측정을 생성합니다. 이 방법은 기존 가지의 확장 및 철회 이벤트의 지속 기간 및 범위뿐만 아니라 새로운 가지의 형성을 정확하게 평가하여 많은 수의 뉴런에서 수상 돌기 역학을 모니터링 할 수 있게합니다.
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Protocol
주의 사항: 이 프로토콜은 클래스 IV 레이저의 사용을 포함하고 적절한 교육 및 안전 지침을 따라야합니다. 직접 또는 산란된 레이저 광에 눈이나 피부에 노출되지 않도록 하십시오.
참고: 프로토콜에는 6단계가 포함되어 있습니다. 워크플로는 그림 1A에표시됩니다.
1. 플립 아웃 기술을 사용하여 개별 뉴런에 라벨링
참고: LNvs의 단일 라벨링은 플리타제-매개 형루 라벨링을 사용하여 단일 LNvs에서 mCD8::GFP를 표현함으로써 달성됩니다. 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같은 것입니다. PDF-갈4; UAS-FRT-CD2-스톱-FRT-mCD8::GFP11,12,13. 단일 라벨이 부착된 LNv를 얻는 빈도는 약 10%입니다. 플라이 스톡은 일주기 및 습도 제어 25°C 인큐베이터에서 표준 매체로 유지됩니다.
- 효모 보충과 포도 주스 접시에 2 시간 창 후 수정 내에서 100-200 계란을 수집합니다. 배아를 24시간 동안 25°C에서 배양하고 다음 단계를 위해 새로 부화한 첫 번째 무스타 애벌레를 수집합니다.
- 열 충격은 37.5°C에서 37.5°C에서 새로 부화된 유충을 40분 동안 두 번, 그 사이에 40분 의 회복 기간을 갖는다.
- 유충을 25°C에서 배양하고, 원하는 발달 단계에 대한 습도 조절을 한다.
2. 애벌레 뇌 이식을 해부하고 장착
- 생리적 외부 식염수 용액에서 애벌레 뇌를 해부 (120 mM NaCl, 4 mM MgCl2,3 mM KCl, 10 mM NaHCO3,10 mM GM 포도당, 10 mM 수크로오스, 5 mM TES, 10 mM HEPES, 2 mMCa2 +, PH 7.2) 디스현미경 (4 mm. 두 쌍의 #5 표준 팁 해부 집게(11cm)를 두 쌍으로 처리합니다. 애벌레의 몸을 제자리에 고정하기 위해 한 쌍의 집게를 사용하고 다른 하나는 조심스럽게 뇌를 해부하십시오. 눈 디스크, 뇌 엽 및 복부 신경 코드를 보존합니다. 이미징 중에 샘플 움직임을 최소화하기 위해 부착된 근육을 제거합니다.
- 유리 슬라이드 (25 x 75 x 1.0 mm3)를준비하고 주사기를 사용하여 진공 그리스로 사각형 챔버를 그립니다.
- 그리스 장벽이 있는 사각형 챔버에 외부 식염수 20μL을 추가합니다.
- 포인을 사용하여 유리 슬라이드의 챔버로 해부 된 애벌레 뇌를 전송합니다. 등쪽이 위를 향하도록 해부 범위 아래의 뇌의 위치를 조정합니다.
- 유리 커버 슬립으로 챔버를 덮습니다 (22 x 22 x 0.15mm3). 애벌레 뇌는 이제 외부 식염수로 채워진 챔버 내의 슬라이드에 장착됩니다(그림 1B).
참고: 커버슬립을 부드럽게 누르면 뇌가 제한되고 후속 이미징 세션에서 샘플 표류가 줄어듭니다.
3. 타임랩스 라이브 이미징
참고: 우리는 다광자 레이저가 장착 된 공초점 현미경을 사용하여 시간 경과 이미징 실험을 수행합니다. 다른 이미징 설정에 대해 수집 매개변수를 조정해야 합니다.
- 40X 수지 목표(NA 1.3)와 에피인젝션 광원을 사용하여 개별적으로 표지된 뉴런을 포함하는 뇌 이식체를 식별합니다. 이미지 수집의 경우 920nm로 튜닝된 2광자 레이저와 비데스칸(NDD) 검출기를 사용합니다.
- 프레임당 512 x 512 픽셀, Z 스택당 1분 동안 10분 동안 이미지를 수집합니다. 1).설정은 0.11 x 0.11 x 0.25 μm3의일반적인 x-y-z 해상도로 이미지를 생성합니다.
- 뇌 해부 30 분 이내에 타임 랩스 이미지 시리즈를 수집합니다. 과도한 드리프트 또는 명백한 형태학적 열화가 있는 데이터는 사후 처리 및 정량화에서 제외되어야 합니다.
4. 드리프트 보정 및 데선볼루션
참고: 이미지 품질에 따라 두 단계 모두 선택 사항이지만 권장됩니다.
- 드리프트 보정 소프트웨어로 획득한 이미지 파일을 엽니다. 실험에 사용된 매개 변수와 일치하도록 미세한 매개 변수를 편집합니다. 소프트웨어(재질 표 참조)의경우 | 편집을 클릭합니다. 현미경 매개 변수를 편집합니다. 2광자 옵션이 없는 경우 현미경 유형을 2광자 이미지의 와이드필드로 설정하고 소프트웨어에서 정의한 워크플로우를 따릅니다. 예를 들어, 탭 을 엽니 다 Deconvolution | 개체 안정기및 시간 프레임 안정화를 선택합니다.
- 데톤볼루션 소프트웨어에서 드리프트 보정 이미지를 열고 워크플로우를 따릅니다. 소프트웨어(재료 표 참조)의경우 안정화된 이미지를 선택한 다음 Deconvolution | 데시온볼루션 익스프레스. 더 나은 결과를 얻으려면 Deconvolution 마법사를사용하여 매개 변수를 미세 조정합니다.
- 4D 데이터를 분석하고 이미지에 정의된 점의 공간 좌표를 보고할 수 있는 후속 이미지 부수 소프트웨어에 의해 지원되는 파일 형식에 디톤브이드 이미지를 저장합니다(재료 표참조).
5. 이미지 어노미
- 이미지 어노미그 소프트웨어에서 데톤브이드 이미지를 엽니다. 3D로 모든 시점에서 분기 팁을 검사하고 표시합니다. 이미지 추가 소프트웨어는 표시된 분기 팁의 공간 및 시간 좌표를 보고하고 저장합니다. 좌표 정보를 후속 계산을 위해 .csv 파일로 내보냅니다.
참고: 다음 두 단계는 사용한 부어구이 소프트웨어와 관련이 있습니다(재료 표참조). 워크플로는 다른 소프트웨어에 따라 다를 수 있습니다. - 스팟 모듈 내에서"자동 생성 건너뛰기, 수동으로 편집"및 하단을 확인합니다" 선택한 스팟 " 확인란에자동 연결(그림3A). 타임계의 프레임을 넘어가서 부침을 위한 분기를 선택합니다. Shift 키를 길게 누를 때 분기 터미널 팁을 클릭하여 스팟을 추가합니다. 모든 시간 포인트를 클릭합니다.
참고: 이미지 부고 소프트웨어는 프레임 사이의 스팟을 연결하고 자동으로 궤적을 생성합니다. 이제 분기 팁의 공간 및 시간 적 정보가 표시된 지점과 연결됩니다. 모든 분기 팁에 추가될 때까지 이 단계를 반복합니다(그림3B). - 스팟 모듈 에서 통계 탭을 클릭하고 상세값을 선택하고 특정 값을 선택 | 위치. 기록된 공간 및 시간 좌표 정보가 표시됩니다. 아래쪽 저장을 클릭하여 해당 정보를 .csv 파일로 내보냅니다(그림3C).
6. 수지상 분기 역학 계산
참고: 좌표 정보를 사용하여 3D로 분기 팁의 변위를 쉽게 계산할 수 있습니다. 우리의 연구에서, 모든 수지상 분기 운동은 확장 또는 철회로분류됩니다. 아래 단계는 사용자 지정 작성된 R스크립트(보충 파일)를사용하고 수동 편집을 통해 방향 정보를 추가하여 .csv 파일을 처리하는 방법을 설명합니다.
- .csv 파일을 스프레드시트로 엽니다. 트랙 ID 열을 선택하고 가장 작은 항목에서 가장 큰 크기로 정렬 옵션을 클릭하고 선택 확장을수락합니다. 정렬 후 Track ID는 각 고유 수지상 분기를 식별하고 동일한 분기의 스팟은 동일한 트랙 ID를 공유합니다. 시간 열은 서로 다른 시간 프레임의 정보를 저장합니다.
- 스프레드시트에 거리 열을 추가합니다. 좌표를 사용하여 일시적으로 인접한 두 점의 거리를 계산하고 거리 열에 값을 넣습니다(그림4A).
- 단일 복셀 레벨에서 의 사소한 움직임. 이미징 설정에 따라 0.3 μm은 일반적으로 수정되지 않은 표류 또는 불완전한 이미지 어노팅의 아티팩트입니다. 0.3 μm에서 0으로 작은 모든 거리 값을 재설정하여 이러한 움직임을 필터링합니다. 여러 .csv 파일을 수동으로 처리하거나 R 스크립트 배치 열 필터링을 사용합니다. R (보조 파일).
- 스프레드시트에서 변위라는 새 열을 수동으로 생성합니다. 거리 열에서 변위 열로 값을 복사합니다. 각 분기 팁에 대해 확장 및 철회 이벤트를 수동으로 할당합니다. 확장인 경우 변위 값을 변경하지 않고 유지합니다. 후퇴인 경우 해당 변위 값을 음수 값(예: 0.35 ~ -0.35)(그림4B)으로변경합니다.
- Event라는 새 열을 생성 합니다. 이 열에서 개별 확장 및 철회 이벤트에 대한 변위 값을 수동으로 합산합니다(그림4B).
- R 스크립트 일괄 처리 열 합계를 사용하여 수정된 스프레드시트를 처리하고 변위 값을 기반으로 확장 및 철회 이벤트를 정량화합니다. R (보조 파일). 출력 매개 변수에는 확장 이벤트 수, 철회 이벤트 수, 누적길이 연장, 누적 길이 철회, 순 길이 변경및 총 이동 길이가 포함됩니다. .
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Representative Results
위에서 설명한 라이브 이미징 프로토콜을 사용하여 후속 분석 및 정량화를 위해 고해상도 이미지 스택을 캡처합니다. 보조 비디오 1은 LNv. 도 2B가 개별적으로 라벨이 붙은 대표적인 로부터 수집된 최대 강도 투영(MIP) 이미지 시리즈를 도시하며, 이미지 시리즈의 8프레임에 상응하는 몽타주를 나타낸다. 두 패널에서 화살촉은 철회 이벤트를 표시하고 화살표는 확장 이벤트를 표시합니다.
다음으로, 우리는 이미지 분석 소프트웨어(재료표)를사용하여 지점 단자의 반자동 4D 추적을 수행합니다. 그림 3 B는 LNv라는 대표자로부터 동적 분기 단자의 주석을 보여줍니다. 시간을 통해. 이 소프트웨어는 수지상 아버의 동적 이벤트를 시각적으로 표현하는 역할을 하는 모든 별이 추가된 분기 터미널에 대해 타임스탬프가 찍힌 궤적을 생성합니다.
그런 다음 추가된 분기 팁의 좌표 정보를 사용하여 각 지점의 분기 이동 방향과 거리를 계산합니다. 그림 4A, B의 스크린 샷은 이것이 어떻게 달성되는지 보여줍니다. 처리된 스프레드시트는 동적 분기 백분율, 새 분기 수, 이동 누적 거리 및 분기 이동 이벤트 수를 포함하여 4개의 매개 변수로 수상돌기 역학을 정량화하는 데 사용하는 출력 파일을 생성합니다. 그림 4 C는 상이한 발달 단계에서 개별적으로 표지된 LNvs에 대한 수지상 분기 역학의 비교를 나타낸다. 포유류 뉴런 및 제브라피시 지각 세포에서의 연구 결과와 일치하는 LNv 수상돌기 역학은14,15를발달적으로 조절한다. 젊은 애벌레에서 LNv 수상돌기, 48-72 시간 후 계란 누워 (AEL), 이전 애벌레에 비해 훨씬 더 동적, 96-120 h AEL, 모든 네 가지 매개 변수에 의해 측정, 그리고 동적에서 안정 상태로 의 발달 전환 사이 발생 72 받는 사람 96 h AEL8.
그림 1: 수상돌기 역학 이미징 및 정량화 프로토콜의 워크플로우. (A)프로토콜에는 샘플 준비, 이미지 수집, 이미지 처리 및 모수석 역학의 반자동 정량화를 포함하는 6단계가 포함되어 있습니다. (B)등쪽쪽으로 장착된 애벌레 뇌 이식을 포함하는 이미징 챔버를 예시하는 회로도 도면. 뇌 이식은 각 엽에 개별적으로 라벨이 부착된 LNv를 가지며 외부 식염수 용액에 침지됩니다. 진공 그리스 장벽은 커버슬립의 무게를 지탱하고 뇌가 움직이지 못하게 하는 작은 챔버를 형성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수지상 분기 역학의 타임랩스 이미징을 3D로. (A)3rd instar 애벌레로부터 개별적으로 라벨이 붙은 LNv의 수지상 아버. (B)(A)의 해당 몽타주 이미지는 대표 지점의 움직임을 설명합니다. 화살촉(녹색) 마크 후퇴 이벤트; 화살표(빨간색)는 확장 이벤트를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미지 어노미 소프트웨어에서 수지상 분기 단자의 수동 항문 및 자동 추적. (A)스크린샷은 스팟 모듈을 사용하여 분기 터미널 추적 설정을 보여줍니다. 빨간색 타원은 수동 추적 옵션의 윤곽을 잡아입니다. (B)개별적으로 라벨이 붙은 LNv. 스케일 바 = 5 μm에서 이미지 별표 소프트웨어에 의해 생성된 별이 찍힌 분기 단말(노란색 반점)의 대표적인 타임스탬프 궤적(C) 스크린샷은 보기 용 인터페이스를 나타내고 스팟 모듈에서 좌표 정보를 내보냅니다. 그림 3B는 Sheng, C. et al. 20188에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 분기 단자의 좌표 정보를 사용하여 수지상 분기 역학의 정량화. (A)스크린샷은 인접한 프레임에서 스팟의 변위를 계산하는 데 사용되는 X, Y 및 Z 좌표, 트랙 아이디 및 수식을 포함하는 스프레드시트를 보여줍니다. (B)스크린샷은 하나의 분기를 추적하여 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 사소한 움직임(<0.3 μm)을 걸아 냈다. 후퇴는 값을 음수(거리 열)에 할당하여 표시됩니다. 인접한 양수/음수 값을 합산하면 각 생물학적 확장/후퇴의 변위가 계산됩니다(이벤트 열). (C)모수석 역학의 발달 조절을 나타내는 결과의 대표적인 정량화. 데이터는 도트 플롯(개별 데이터 점)으로 중첩된 상자 플롯(상자, 25-75%, 중심선, 중앙값)으로 표시됩니다. 그림 4C는 Sheng, C. 외. 20188에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 비디오 1: 초당 2프레임의 속도로 재생되는 최대 강도 프로젝션(MIP) 이미지 10개. 전체 수지상 아버는 Z 스택 당 1 분에서 이미지되었다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
보충 파일 1: 일괄 처리 열 필터링.R 스크립트입니다. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
보충 파일 2: 일괄 처리 열 Sum.R 스크립트입니다. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
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Discussion
여기에서, 우리는 우리가 기록하고 Drosophila 애벌레 두뇌에 있는 개별적으로 표지된 뉴런에 있는 수지상 가지의 동적 행동을 정량화하기 위하여 개발한 프로토콜을 기술합니다. 특히, 우리의 라이브 이미징 프로토콜은 우리가 애벌레 LNv의 전체 수지상 아버를 캡처하고 그 수상 돌기 지점의 동적 상태의 글로벌 뷰를 제공 할 수 있도록 특정 매개 변수를 포함하고 있습니다. 그러나, 우리의 정량화 방법은 분지 말단의 부현에 크게 의존하기 때문에, 복잡한 수지상 구조 및 응축된 수공체를 가진 뉴런은 이 분석에 적합한 과목이 아닙니다.
샘플 준비, 이미지 수집 및 후처리는 이 프로토콜의 중요한 단계입니다. 단일 LNvs의 고품질 원시 이미지는 수상 돌기 역학의 정확한 정량화에 필수적입니다. 우리의 데이터는 LNv 수상돌기 형태와 생리적 반응이 해부 30 분 이내에 신중하게 준비 된 애벌레 뇌 이식에서 잘 보존되어 있음을 나타냅니다. 관찰 가능한 뇌 조직 악화, 길쭉한 수지상 아버 및 분기 파손이 있는 샘플은 이미징 및 정량화에 사용해서는 안 됩니다. 배경이 낮고 움직임이 없는 데이터 세트의 경우 선택 사항이지만, 분기 단말 및 자동 부호에 중요한 이미지 품질을 개선하기 위한 드리프트 보정 및 디톤볼루션 단계를 포함하는 것이 좋습니다. 스팟 추적. 우리의 연구에 사용되는 상용 소프트웨어 외에, ImageJ / 피지의 올바른 3D 드리프트 (플러그인 | 등록 | 올바른 3D 드리프트) 또한 드리프트 보정에 잘 작동합니다.
우리의 프로토콜과 기존 방법 사이의 주요 차이점 중 하나는 개별 분기 팁의 움직임을 추적하지만 전체 수지상 아버가 아니라는 것입니다. 전체 수지상 아버의 재구성은 전체 수지상 길이와 아키텍처를 측정하는 데 유용하지만 3D 이미징 데이터 세트를 사용하는 동적 연구에는 적합하지 않습니다. 연속된 Z 스택 슬라이스의 경우 자동 추적 프로그램은 종종 "분기"의 서로 다른 조합을 생성하고 수지상 아버를 다르게 재구성하여 특히 서로 다른 시간 지점 사이의 단일 분기 수준에서 비교합니다. 어려운. 또한, 전체 수지상 아버를 추적하는 것을 비교하여, 단말 추적은 처리 시간과 계산 전력에 대한 요구 사항을 현저히 감소시킨다.
몇 가지 수정을 통해 당사 방법의 효율성과 분석 기능을 잠재적으로 향상시킬 수 있습니다. 타임랩스 이미지 계열에서 정량적 위치 정보를 추출하려면 모든 시점에서 분기 팁의 정확한 부침이 매우 중요합니다. 이 단계는 현재 수동으로 수행되며 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 가변성을 제공합니다. 오픈 소스 3D 시각화 소프트웨어의 새로운 개발은 잠재적으로 현재의 기술적 한계를 해결하고 이 중요한 단계의 자동화를 가능하게 할 수 있습니다. 최근에 개발된 몇 가지 소프트웨어 도구는 filopodia16,17,18,19,20,21에 대한 연구를위한 자동 정량화 기능을 제공하며, 잠재적으로 테스트 및 수상 돌기 분기 역학에 대한 연구를 위해 채택.
현재 수동으로 수행되는 또 다른 단계는 확장 대 철회 이벤트를 식별하는 것입니다. 이 단계를 자동화하려면 분기 분기 사이트의 3D 좌표가 필요합니다. 두 시점에서 분기 대지까지의 거리를 비교하여 터미널 변위의 방향성을 할당하기 위해 사용자 지정 작성된 스크립을 개발할 수 있습니다. 동일한 논리에 따라 분기를 따라 추가 3D 좌표가 분기 내에서 발생하는 확장 및 후퇴 이벤트를 분석하는 데 사용될 수도 있습니다. 이러한 추가 기능을 통해 프로토콜의 워크플로우를 최적화할 뿐만 아니라 다른 시간적 스케일에서 수지상 아버의 구조적 변화에 관한 정보 내용도 증가합니다.
요약하자면, 경험에 의존하는 모수석 가소성에 대한 연구를 지원하기 위해, 우리는 뉴런 개발에서 빠른 분기 역학의 평가를 수행하기 위해 타임 랩스 라이브 이미징 프로토콜과 반자동 정량화 방법을 개발했습니다. 여기에 설명 된 방법에 의해 생성 된 결과에 따라, 우리의 연구는 Drosophila 중앙 뉴런에서 높은 운동성 수지상 filopodia를 확인하고 높게 한 모수석 역학과 시냅스 발생 사이의 개발 조정을 밝혔다. 이미지 수집 및 자동화 수준에서 향후 개선은 이 프로토콜의 잠재력을 크게 향상시키고 수상 돌기 역학 및 구조적 가소성에 대한 연구를 용이하게 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다, 건강의 국립 연구소. 프로젝트 번호 1ZIANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
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