Summary
Aqui, nós descrevemos o método que nós empregamos à imagem filopódia dendríticas altamente motile em uma preparação viva do cérebro larval da Drosophila , e o protocolo que nós desenvolvemos para quantificar conjuntos de dados da imagem latente do lapso de tempo 3D para avaliações quantitativas do dendrito dinâmica no desenvolvimento de neurônios.
Abstract
O filopódia dendríticas altamente motile é extensamente atual nos neurônios em estágios desenvolventes adiantados. Essas ramificações dinâmicas exploratórias amostram o ambiente circundante e iniciam contatos com potenciais parceiros sinápticos. Embora a conexão entre a dinâmica do ramo dendrítico e a sinaptogênese esteja bem estabelecida, como os processos de desenvolvimento e dependentes da atividade regulam a dinâmica do ramo dendrítico não é bem compreendido. Isto é em parte devido às dificuldades técnicas associadas com a imagem latente viva e análises quantitativas destas estruturas finas usando um sistema in vivo. Nós estabelecemos um método para estudar a dinâmica do dendrito usando os neurônios laterais ventral da Drosophila larval (lnvs), que podem individualmente ser etiquetados usando aproximações genéticas e são acessíveis para a imagem latente viva. Aproveitando-se deste sistema, nós desenvolvemos protocolos para capturar a dinâmica do ramo de todo o mandril dendrítico de um único rotulado LNv através de imagens ao vivo de lapso temporal. Em seguida, realizamos pós-processamento para melhorar a qualidade da imagem através da correção de deriva e deconvolução, seguido pela análise dinâmica de ramo no nível de filial única, anotando posições espaciais de todos os terminais de filial. Por fim, desenvolvemos scripts R (arquivo suplementar) e parâmetros específicos para quantificar a dinâmica de ramificação usando as informações de coordenadas geradas pelo rastreamento do terminal. Coletivamente, este protocolo permite-nos alcançar uma descrição quantitativa detalhada da dinâmica do ramo do mandril dendrítico neuronal com alta resolução temporal e espacial. Os métodos que nós desenvolvemos são geralmente aplicáveis aos neurônios escassamente etiquetados em condições in vitro e in vivo.
Introduction
Os dendrites são compartimentos neuronais especializados que recebem e processam a entrada sensorial e sináptica. A estrutura complexa e estereotipada de mandris dendríticos tem sido intensa investigação desde a sua descoberta. Um número de sistemas do modelo, incluindo neurônios tectal de Xenopus ótico, pilhas retinal do gânglio do pintainho, e os neurônios dendríticas da arborização (da) no sistema de Drosophila , foram estabelecidos para estudar o desenvolvimento, a remodelação e a plasticidade de dendritos neuronal1,2,3,4. Os neurônios laterais da Drosophila ventral (lnvs) são um grupo de neurônios de projeção Visual inicialmente identificados por suas importantes funções na regulação circadiana de comportamentos de mosca5. Os estudos igualmente revelaram o papel de lnvs larval como o alvo pós-sináptica direto dos FOTORRECEPTORES larval (PRS)6,7. É importante ressaltar que a cultura do desenvolvimento de larvas em diferentes regimes de luz afeta fortemente o tamanho dos mandris dendríticos do LNvs, demonstrando a adequação dos LNvs como um novo modelo para o estudo da plasticidade dendrítica7. O trabalho recente do nosso grupo indica ainda que tanto o tamanho do dendrito LNV quanto o comportamento dinâmico dos galhos dendríticos exibem a plasticidade dependente da experiência8,9. Como parte deste trabalho, desenvolvemos um novo protocolo de imagem e quantificação ao vivo para realizar análises sobre a dinâmica dendrito de lnvs de larvasde 2 ou 3RD instar.
A natureza transparente do cérebro de Drosophila larval fá-lo ideal para a imagem latente viva. No entanto, os mandris dendríticos de lnvs estão situados no neurópilo óptico larval densamente inervado (lon) no centro do lobo cerebral larval6. Para captar imagens de galhos de dendrito finos e filopónicos no tecido cerebral intacto, utilizamos microscopia de dois fótons, o que aumenta a profundidade da penetração da luz e reduz a fototoxicidade durante experimentos de imagem ao vivo10. Usando esta configuração, realizamos com sucesso experimentos de imagem ao vivo em LNvs por mais de 30 min sem observar a deterioração morfológica óbvia do Neuron. Além disso, as manipulações genéticas utilizando a técnica flip-out permitiram-nos rotular os lnvs individuais com uma membrana etiquetada GFP, que também é fundamental para o monitoramento dos movimentos de ramos individuais11,12,13 .
Para capturar o comportamento dinâmico de todas as filiais no mandril dendríticas de LNV com definição ótica óptima, nós executamos a imagem latente do tempo-lapso 3D em explantes de cérebro larval recentemente dissecados com uma definição espacial elevada em 1 minuto por o frame para 10 a 30 minutos. desenvolvendo LNV dendritos são altamente dinâmicos, com uma grande percentagem dos ramos exibindo mudanças observáveis dentro da janela de 10 min. Isso leva a um dos principais desafios técnicos no estudo da dinâmica dendrito, quantificando o comportamento do ramo baseado nos conjuntos de dados de imagem 4D. Os métodos previamente estabelecidos têm várias limitações, incluindo a falta da exatidão e a exigência de tempo excessiva. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um método semiautomático que combine o borne-processamento da imagem, a marcação manual dos terminais da filial, e o traçado 4D automático do ponto usando um software da anotação da imagem. Calculamos os movimentos dos terminais de filial em diferentes pontos temporais com base nas coordenadas 3D das manchas. Os dados são então exportados e analisados para produzir medições quantitativas da dinâmica da filial. Este método avalia com precisão a duração e extensão dos eventos de prorrogação e retração das ramificações existentes, bem como a formação de novos ramos, permitindo-nos monitorar a dinâmica dendrito em um grande número de neurônios.
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Protocol
Atenção: Este protocolo envolve o uso de lasers de classe IV e exigirá orientações adequadas de treinamento e segurança a serem seguidas. Evite a exposição dos olhos ou da pele à luz laser direta ou dispersa.
Nota: O protocolo inclui seis etapas. O fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1a.
1. rotulagem neurônios individuais usando a técnica flip-out
Nota: A única rotulagem de LNvs é conseguida expressando mCD8:: GFP em únicos LNvs usando a rotulagem estocástica mediada por flippase. O genótipo da linha de mosca é: HS-FLP; PDF-Gal4; Uas-FRT-CD2-Stop-FRT-mCD8:: GFP11,12,13. A frequência de obter um único rotulado LNv é de cerca de 10%. Os estoques da mosca são mantidos no meio padrão em incubadoras de 25 ° c Circadian-e umidade-controladas.
- Colete 100-200 ovos dentro de um 2 h janela pós fertilização em uma placa de suco de uva com suplemento de levedura. Incubar os embriões a 25 ° c por 24 h e coletar larvas de primeiro instar recém-eclodidas para a próxima etapa.
- Choque térmico as larvas recém-eclodidas do primeiro instar a 37,5 ° c por 40 min duas vezes, com um período de recuperação de 40 min no meio.
- Cultura das larvas a 25 ° c com controles circadianos e umidade para o estágio de desenvolvimento desejado (s).
2. dissecação e montagem explantes cerebrais larval
- Dissecar os cérebros larvares na solução fisiológica salina externa (120 mM NaCl, 4 mM MgCl2,3mm KCl, 10 mm NaHCO3, 10 mm de glicose, 10 mm de sacarose, 5 mM tes, 10 mm HEPES, 2 mm CA2 +, pH 7,2) um microscópio de dissecção (ampliação de 4,5 x de alimentação) com dois pares de #5 pinça de dissecção de ponta padrão (11 cm). Use um par de fórceps para prender o corpo larval no lugar e o outro para dissecar com cuidado o cérebro. Preserve os discos oculares, lóbulos cerebrais e o cordão nervoso ventral. Remova os músculos anexados para minimizar os movimentos da amostra durante a imagem.
- Prepare uma lâmina de vidro (25 x 75 x 1,0 mm3) e use uma seringa para desenhar uma câmara quadrada com graxa a vácuo.
- Adicionar 20 μL de solução salina externa à câmara quadrada com barreiras de graxa.
- Transferência de cérebros larval dissecados para a câmara na lâmina de vidro usando fórceps. Ajuste a posição dos cérebros o âmbito de dissecção para garantir que o lado dorsal virado para cima.
- Cubra a câmara com um deslizamento de cobertura de vidro (22 x 22 x 0,15 mm3). O cérebro larval é montado agora na corrediça dentro de uma câmara enchida com a solução salina externa (Figura 1B).
Nota: Pressionando suavemente na lamínula limita o cérebro e reduz a deriva de amostra na sessão de imagem subseqüente.
3. tempo-lapso de imagem ao vivo
Nota: Realizamos experimentos de imagem de lapso de tempo usando um microscópio confocal equipado com um laser multifóton. Os parâmetros de aquisição precisam ser ajustados para outras configurações de imagem.
- Identifique explantes cerebrais contendo neurônios individualmente rotulados usando um objetivo de imersão de água 40X (NA 1,3) e uma fonte de luz epifluorescente. Para a coleta de imagem, use um laser de dois fótons sintonizado para 920 nm e um detector não-descanned (NDD).
- Colete imagens em 512 x 512 pixels por quadro e 1 min por Z-Stack por 10 min. Ajuste o zoom óptico e digital para obter uma resolução x-y-Z suficiente, assegurando a cobertura de todo o mandril dendrítico dentro de 1 min (Figura 2, vídeo complementar 1). as configurações geram imagens com uma resolução típica x-y-z de 0,11 x 0,11 x 0,25 μm3.
- Colete a série da imagem do lapso de tempo dentro de 30 minutos da dissecção do cérebro. Os dados com desvio excessivo ou deterioração morfológica óbvia devem ser excluídos do pós-processamento e da quantificação.
4. correção de deriva e deconvolução
Nota: Dependendo da qualidade da imagem, ambas as etapas são opcionais, mas fortemente recomendadas.
- Abra um arquivo de imagem adquirido com um software de correção de drift. Edite parâmetros microscópicos para corresponder àqueles usados para o experimento. Para o software (consulte a tabela de materiais), clique em Editar | Edite parâmetros microscópicos. Defina o tipo de microscópio como Widefield para imagens de dois fótons se não houver opção de dois fótons e siga o fluxo de trabalho definido pelo software. Por exemplo, abra a guia deconvolution | Estabilizador de objetoe escolha estabilizarprazos.
- Abra a imagem corrigida por deriva no software deconvolução e siga seu fluxo de trabalho. Para o software (consulte a tabela de materiais), selecione a imagem estabilizada e clique em deconvolução | Deconvolução Express. Para obter um resultado melhor, ajuste os parâmetros usando o Assistente de deconvolução.
- Salve a imagem descomplicada em um tipo de arquivo que é suportado pelo software de anotação de imagem subseqüente capaz de analisar dados 4D e relatar as coordenadas espaciais de pontos definidos na imagem (ver tabela de materiais).
5. anotação de imagem
- Abra a imagem seções no software de anotação de imagem. Examine e marque dicas de ramificação em todos os pontos de tempo em 3D. O software de anotação de imagem relata e armazena as coordenadas espaciais e temporais das dicas de ramificação marcadas. Exporte as informações de coordenadas como um arquivo. csv para cálculos subsequentes.
Nota: As duas etapas a seguir são específicas para o software de anotação que usamos (consulte tabela de materiais). O fluxo de trabalho pode ser diferente para outro software. - Dentro do módulo spots, clique em "pular criação automática, editar manualmente" e marque a caixa de seleção inferior "conectar automaticamente ao Spot selecionado" (Figura 3a). Vá sobre os quadros na série temporal e selecione uma ramificação para anotação. Segure a tecla Shift e clique na ponta do terminal de ramificação para adicionar um ponto. Clique em todos os pontos de tempo.
Nota: O software de anotação de imagem conecta os pontos entre quadros e gera uma trajetória automaticamente. As informações espaciais e temporais das dicas de ramificação agora estão associadas a pontos marcados. Repita essas etapas até que todas as dicas de ramificação sejam anotadas (Figura 3B). - Dentro do módulo spots, clique na guia estatísticas , escolha detalhado e selecione valores específicos | Posição. As informações de coordenadas espaciais e temporais gravadas serão exibidas. Clique na parte inferior salvar para exportar essas informações como um arquivo. csv (Figura 3C).
6. calculando a dinâmica do ramo dendrítico
Nota: Usando as informações de coordenadas, o deslocamento das dicas de ramificação em 3D pode ser facilmente calculado. Em nosso estudo, todos os movimentos do ramo dendrítico são categorizados como extensão ou retração. As etapas abaixo descrevem como processar os arquivos. CSV usando scripts R personalizados (arquivo complementar) e adicionando as informações direcionais por meio da edição manual.
- Abra o arquivo. csv como uma planilha. Selecione a coluna Track ID , clique na opção classificar menor para maior e aceite expandir a seleção. Após a classificação, o Track ID identifica cada ramificação dendrítica exclusiva e os pontos da mesma ramificação compartilham a mesma ID de faixa. A coluna de tempo armazena as informações de diferentes períodos de tempo.
- Na planilha, adicione uma coluna de distância . Calcule a distância de cada dois pontos temporalmente adjacentes usando suas coordenadas e coloque os valores na coluna de distância (Figura 4a).
- Movimentos menores no nível de VOXEL único. Com base nas configurações de imagem, 0,3 μm geralmente são artefatos de uma anotação de imagem não corrigida à deriva ou imperfeita. Filtre esses movimentos, redefinindo todos os valores de distância menores que 0,3 μm a 0. Processe vários arquivos. csv manualmente ou use nossa filtragem de coluna de lote de script R . R (arquivo complementar).
- Gere manualmente uma nova coluna denominada deslocamento na folha de cálculo. Copie os valores da coluna Distance para a coluna de deslocamento . Atribua manualmente os eventos de extensão e retração para cada dica de ramificação. Se for uma extensão, deixe o valor de deslocamento inalterado, que é um valor positivo. Se for uma retração, altere o valor de deslocamento correspondente para um valor negativo (por exemplo, 0,35 para-0,35) (Figura 4B).
- Gere uma nova coluna denominada Event. Nesta coluna, soma manualmente os valores de deslocamento para eventos de extensão e retração individuais (Figura 4B).
- Processe a planilha modificada e quantifique os eventos de extensão e retração com base em seus valores de deslocamento usando a soma de coluna do lote de script R . R (arquivo complementar). Os parâmetros de saída incluem o número de eventos de extensão, o número de eventos de retração, o comprimento cumulativo estendido, o comprimento cumulativo recolhido, o comprimento líquido alteradoe o comprimento total viajado .
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Representative Results
Usando o protocolo de imagem ao vivo descrito acima, capturamos pilhas de imagens de alta resolução para as análises e quantificação subsequentes. O vídeo complementar 1 mostra a série da imagem projetada da intensidade máxima (MIP) coletada de um representante individualmente etiquetado LNV. a Figura 2B mostra a montagem correspondente de oito quadros da série de imagens. Em ambos os painéis, os setas marcam eventos de retração e as setas marcam eventos de extensão.
Em seguida, realizamos o rastreamento semiautomatizado 4D dos terminais de filial usando um software de anotação de imagem (tabela de materiais). Figura 3 B mostra as anotações dos terminais de ramificação dinâmicos de um representante individualmente rotulado LNV. usando este software, nós visualizamos as pilhas de imagem em 3D, marcaremos manualmente todos os terminais de filial e usaremos o módulo spots para rastrear os movimentos dos terminais através do tempo. Este software gera trajetórias com carimbo de tempo para cada terminal de filial anotado, servindo como representações visuais dos eventos dinâmicos no mandril dendrítico.
Em seguida, usamos as informações de coordenadas das dicas de ramificação anotadas para calcular a direção e a distância dos movimentos de ramificação em cada ponto de tempo. Capturas de tela na Figura 4A, B mostram como isso é conseguido. As planilhas processadas geram arquivos de saída que usamos para quantificar a dinâmica de dendrito com quatro parâmetros, incluindo a porcentagem de ramificações dinâmicas, o número de novas ramificações, a distância cumulativa percorrida e o número de eventos de movimento de ramificação. Figura 4 C mostra comparações da dinâmica do ramo dendrítico para os lnvs individualmente rotulados de diferentes estágios de desenvolvimento. Consistente com os achados em neurônios de mamíferos e células tectais de zebrafish, a dinâmica dendrito do LNV éregulada de formadesenvolvimental14,15. Os dendritos de LNv em larvas mais jovens, 48-72 h após a postura de ovos (AEL), são significativamente mais dinâmicos em comparação com aqueles em larvas mais velhas, 96-120 h AEL, medido por todos os quatro parâmetros, e a transição do desenvolvimento do estado dinâmico para estável ocorre entre 72 a 96 h AEL8.
Figura 1: fluxo de trabalho da dinâmica de dendrito e protocolo de quantificação. (A) o protocolo contém seis etapas que abrangem a preparação da amostra, a coletade imagens, o processamento de imagens e a quantificação semiautomatizada da dinâmica dendrito. (B) um diagrama esquemático ilustrando uma câmara de imagem contendo um explante cerebral larval montado com o lado dorsal para cima. O explante cerebral tem um LNv individualmente rotulado em cada lobo e está imerso na solução salina externa. As barreiras da graxa do vácuo apoiam o peso do lamela e dão forma a uma câmara pequena que impeça que o cérebro se mova. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem temporal da dinâmica do ramo dendrítico em 3D. (A) o mandril dendrítico de um LNV individualmente rotulado de uma larva de 3RD instar. (B) a imagem de montagem correspondente de (a) ilustrando os movimentos representativos do ramo. ARROWHEADS (verde) marcam eventos de retração; setas (vermelho) marcar eventos de extensão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: anotação manual e rastreamento automático de terminais de ramo dendríticos em um software de anotação de imagem. (A) uma captura de tela mostra as configurações para rastreamento de terminal de filial usando o módulo spots. O oval vermelho descreve a opção de rastreamento manual . (B) trajetórias com carimbo de tempo representativas de terminais de filial anotados (manchas amarelas) geradas pelo software de anotação de imagem em um LNV individualmente rotulado. barra de escala = 5 μm. (C) uma captura de tela mostra a interface para visualização e exportar as informações de coordenadas do módulo spots. A Figura 3B foi modificada de Sheng, C. et al. 20188. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: quantificação da dinâmica do ramo dendrítico utilizando a informação coordenada dos terminais da filial. (A) uma captura de tela mostra a planilha contendo as coordenadas X, Y e Z, Track IDs e fórmula usada para calcular o deslocamento de manchas nos quadros adjacentes. (B) uma captura de tela mostra resultados representativos obtidos de rastrear uma ramificação. Os movimentos menores (< 0,3 μm) foram filtrados. As retrações são marcadas atribuindo seu valor a negativo (coluna distância). Somando-se valores positivos/negativos adjacentes, o deslocamento de cada extensão/retração biológica é calculado (coluna eventos). (C) quantificação representativa dos resultados mostrando a regulação do desenvolvimento da dinâmica dendrito. Os dados são apresentados como um gráfico de caixa (caixa, 25-75%; linha central, mediana) sobrepostos com um gráfico de pontos (ponto de dados individuais). A Figura 4C foi modificada de Sheng, C. et al. 20188. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo complementar 1: dez imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) tocadas a uma velocidade de 2 frames por segundo. O mandril dendrítico inteiro foi imaged em 1 minuto por Z-pilha. Por favor, clique aqui para ver este vídeo (clique direito para baixar).
Arquivo complementar 1: script de filtragem. R de coluna de lote. Por favor, clique aqui para ver este arquivo (clique direito para baixar).
Arquivo complementar 2: script Sum. R de coluna de lote. Por favor, clique aqui para ver este arquivo (clique direito para baixar).
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Discussion
Aqui, nós descrevemos um protocolo que nós desenvolvemos para registrar e quantificar o comportamento dinâmico de filiais dendríticas em neurônios individualmente etiquetados no cérebro larval da Drosophila . Notavelmente, nosso protocolo de imagens ao vivo contém parâmetros específicos que nos permitem capturar todo o mandril dendrítico de um LNV larval e fornecer uma visão global do estado dinâmico de seus ramos dendrito. No entanto, como nossos métodos de quantificação dependem fortemente da anotação de terminais de filial, os neurônios com estruturas dendríticas complexas e Arborizações condensadas não são sujeitos adequados para essa análise.
A preparação da amostra, a aquisição de imagens e o pós-processamento são as etapas críticas neste protocolo. Imagens RAW de alta qualidade de lnvs único são essenciais para a quantificação exata da dinâmica dendrito. Nossos dados indicam que a morfologia dendrito do LNV e suas respostas fisiológicas estão bem preservadas em um explante cerebral larval cuidadosamente preparado dentro de 30 min de dissecção. Amostras com deterioração do tecido cerebral observável, mandris dendríticos alongados e ruptura do ramo não devem ser utilizadas para a imagem e quantificação. Embora seja opcional para conjuntos de dados com baixo plano de fundo e sem movimentos observáveis, é altamente recomendável incluir as etapas de correção de deriva e deconvolução para melhorar a qualidade da imagem, o que é importante para a anotação de terminais de filial e automático rastreamento local. Além do software comercial utilizado em nossos estudos, ImageJ/Fiji ' s deriva 3D correta (plugins | Registo | Deriva 3D correta) também funciona bem para a correção de deriva.
Uma das principais diferenças entre o nosso protocolo e os métodos existentes é que nós rastreamos os movimentos de pontas de ramificação individuais, mas não todo o mandril dendrítico. A reconstrução de mandris dendríticos inteiros, embora útil para medir o comprimento e a arquitetura dendríticas totais, não é ideal para estudos dinâmicos usando conjuntos de dados da imagem latente 3D. Para fatias de pilha Z consecutivas, os programas de rastreamento automáticos geralmente geram diferentes combinações de "ramificações" e reconstroem o mandril dendrítico de forma diferente, fazendo a comparação no nível de ramificação única entre diferentes pontos de tempo, particularmente Difícil. Além, comparando a traçar o mandril dendríticas inteiro, o seguimento terminal reduz significativamente o tempo de processamento e as exigências no poder da computação.
Várias modificações podem potencialmente melhorar a eficiência e as características analíticas do nosso método. Para extrair informações posicionais quantitativas da série de imagens de lapso de tempo, anotação exata de dicas de ramificação em todos os pontos de tempo é extremamente importante. Esta etapa é executada no momento manualmente, o que não é apenas demorado, mas também introduz variabilidade. Novos desenvolvimentos em software de visualização 3D de código aberto poderiam potencialmente abordar as limitações técnicas atuais e tornar a automação deste passo crítico possível. Diversas ferramentas de software recentemente desenvolvidas fornecem a função automática da quantificação para estudos em filopódia16,17,18,19,20,21 e podem ser potencialmente testados e adotados para estudos sobre a dinâmica da filial dendrito.
Outra etapa que é atualmente executada manualmente é a identificação de eventos de extensão versus retração. A automatização desta etapa exige as coordenadas 3D de locais da bifurcação da filial. Comparando distâncias ao local de ramificação em dois pontos do tempo, um scrip costume-escrito pode ser desenvolvido para atribuir a direcionalidade dos deslocamentos terminais. Seguindo a mesma lógica, coordenadas 3D adicionais ao longo da ramificação também podem ser usadas para analisar os eventos de extensão e retração que ocorrem dentro da ramificação. Estes add-ons não só irá otimizar o fluxo de trabalho do nosso protocolo, mas também aumentar o conteúdo de informação sobre as mudanças estruturais dos mandris dendríticos em diferentes escalas temporais.
Em resumo, para apoiar os nossos estudos sobre a plasticidade da dendrito dependente da experiência, desenvolvemos protocolos de imagens ao vivo com lapso de tempo e métodos de quantificação semiautomatizados para realizar avaliações da dinâmica de ramificação rápida no desenvolvimento de neurônios. Baseado nos resultados gerados pelos métodos descritos aqui, nosso estudo identificou filopódia dendrítico altamente motile em neurônios centrais da Drosophila e revelou uma coordenação desenvolvente entre a dinâmica aumentada do dendrito e o synaptogenesis. Melhorias futuras no nível de aquisição e automação da imagem melhorarão consideravelmente o potencial deste protocolo e facilitarão estudos sobre a dinâmica de dendrito e a plasticidade estrutural.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo programa de pesquisa intramural do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC, institutos nacionais de saúde. Número do projeto 1ZIANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
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