Transformación de raíz de tomate Seguida de inoculación con Ralstonia Solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de Wilt

Resumen

Aquí, presentamos un método versátil para la transformación de la raíz de tomate seguido de la inoculación con Ralstonia solanacearum para realizar un análisis genético sencillo para el estudio de la enfermedad bacteriana de la enfermedad de wilt.

Resumen

Ralstonia solanacearum es un patógeno vascular devastador que puede infectar a una amplia gama de especies vegetales, causando una amenaza importante para la agricultura. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae en Arabidopsis. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción en las plantas anfitrionas nativas. En este escenario, hemos desarrollado un método para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia de tomate, un huésped natural de Ralstonia. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, seguida de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI. Como prueba de concepto, utilizamos este método para demostrar que el silenciamiento mediado por ARNi de SlCESA6 en raíces de tomate confirió resistencia a Ralstonia. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.

Introducción

Ralstonia solanacearum, agente causal de la enfermedad bacteriana de wilt, es un patógeno vascular devastador transmitido por el suelo con una distribución mundial que puede infectar una amplia gama de especies vegetales, incluyendo papa, tomate, tabaco, plátano, pimienta y berenjena, entre otros^1,2. Las pérdidas de rendimiento causadas por Ralstonia pueden alcanzar el 80-90% de la producción en tomate, patata o plátano, dependiendo del cultivar, clima, suelo y otros factores^3. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparaci....

Protocolo

NOTA: Las partes importantes de este método implican la manipulación de materiales vegetales in vitro, y por lo tanto es importante mantener las condiciones estériles durante todos estos procedimientos, incluida la visualización de la fluorescencia DsRed. Durante todo el proceso de transformación, las plántulas de tomate crecen a 25 o28 oC y 16 h/8 h de luz/oscuridad (130 mmol fotones m^-2s^-1 luz). Las placas están selladas con cinta adhesiva de microporos para facilitar el intercambio y la transpiración de gas.

1. Preparación de plantas de tomate y Agrobacterium rhizogenes

1. Esteriliz....

Resultados

La Figura 5 muestra el desarrollo de síntomas de enfermedad de plantas de tomate con raíces transformadas con un vector vacío (EV), y plantas con raíces transformadas con una construcción de ARNi dirigida a SlCESA6 (Solyc02g072240). Los datos del índice de la enfermedad(Figura 5A)se recopilan de la misma unidad experimental (cada planta) a lo largo del tiempo de acuerdo con una escala arbitraria.......

Discusión

Ralstonia solanacearum representa una amenaza importante para la agricultura; sin embargo, su interacción con los huéspedes naturales de importancia agrícola todavía se entiende mal en comparación con otros patógenos bacterianos, especialmente en especies de plantas de cultivo. En la mayoría de los casos, el análisis genético se ve obstaculizado por el tiempo y los gastos necesarios para modificar genéticamente las plantas anfitrionas. Para abordar este problema y facilitar el análisis genético de la infección p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			de Petri cuadradas de 90 mm
Polvo de agar	Sigma-Aldrich
Bacto peptona	BD (Becton y Dickinson)
Ácidos Casamino	Sigma-Aldrich
Papel
Sistema de imagen de plantas in vivo NightShade LB 985	Berthold Technologies
Jiffy	pots Jiffy Products International A.S.
Cinta de microporos	3M
Murashige y medio Skoog (M519)	Phytotechlab
Sustrato Pindstrup	Pindstrup Mosebrug A/S
Bisturí y cuchilla
sodio	Sigma-Aldrich
Banco de limpieza
Pinzas
de papel Wahtman Wahtman	International Ltd. Maldstone
Extracto de levadura	OXOID

Placas de filtro Hipoclorito de estéril