果蝇飞行肌肉是研究转录调节、替代拼接、代谢和肌生物学的有力模型。我们提出了从活pupae中解剖荧光标记飞行肌肉的协议,以生成高富集的样品,非常适合蛋白质组学和深度测序。这些样本可以提供重要的机械见解,肌肉发育的各个方面。
果蝇飞行肌肉是研究各种过程的有力模型,如转录调节、替代拼接、代谢和肌瘤生物学,这些过程都影响肌肉发育和肌血生成。Omics 数据(如质谱或深度测序生成的数据)可以为这些生物过程提供重要的机械见解。对于这些方法,分析组织特异性样本,提高组分指纹的选择性和特异性是有好处的。在这里,我们提出了一个协议,从活pupae解剖荧光标记飞行肌肉,为组学应用生成高度丰富的肌肉样本。我们首先描述如何在早期脓肿阶段(48 h APF)或成人的肌肉,当肌肉在解剖显微镜下可以区分时。随附的视频协议将使这些技术要求苛刻的解剖更容易为肌肉和果蝇研究社区。对于RNA应用,我们用不同时间点和不同方法测定可分离的RNA的数量和质量。我们进一步表明,Bruno1 (Bru1) 是肌苷重链(Mhc)拼接的时态变化所必需的,表明解剖的肌肉可用于 mRNA-Seq、质谱和逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)应用。这种解剖方案将有助于促进组织特异性组学分析,并通常可用于研究造血的多种生物学方面。
现代组学技术为肌肉发育和人类肌肉疾病背后的机制提供了重要的见解。例如,对转录组学数据的分析与动物模型中的遗传和生化验证相结合,发现由于对30多个沙科梅的目标网络进行调节,因此失去拼接因子RBM20会导致扩张性心肌病。以前与心脏病相关的基因,包括锡丁1,2,3。
在第二个例子中,来自细胞培养、动物模型和人类患者的研究表明,肌营养不良症是由肌肉盲(MBNL)的固存和CELF14,5的增强引起的RNA调节的中断造成的。MBNL 和 CELF1(也称为 CUGBP1 或 Bruno-Like-Like 2)之间的交叉调控和时间动力学有助于解释肌营养不良症患者持续的胚胎拼接模式。此外,大型错误控制的目标网络有助于解释疾病4、6、7、8的复杂性质。大多数此类研究利用基因模型生物体中的组学方法来了解人类肌肉疾病背后的机制。此外,他们强调首先了解健康肌肉中的时间和组织类型特定基因表达、蛋白质修饰和代谢模式的重要性,以了解患病或老化肌肉的变化。
果蝇黑色素是另一个成熟的遗传模型有机体。沙科梅的结构以及单个沙科梅成分从苍蝇到脊椎动物4、9、10的高度保存,间接飞行肌肉(IFMs)已成为研究的有力模型肌肉发育的多个方面11,12。首先,纤维肌在功能和形态上不同于管状体肌肉11,13,允许研究肌肉类型的特定发育机制。转录因子包括斯帕尔特主要(萨尔姆)14,外登(外联),和霍莫托拉克斯(Hth)15已被确定为纤维素命运调节器。此外,在萨尔姆下游,CELF1同源布鲁诺1号(Bru1,Aret)指导一个纤维素特拼接程序16,17。
其次,IFM是了解肌细胞生成过程的重要模型,从肌细胞融合和肌管附着到肌血生成和沙突成熟9、18、19。第三,果蝇遗传学允许调查单个蛋白质、蛋白质域和蛋白质等各形式对沙科梅形成、功能和生物物理特性的贡献 20、21、22 , 23.最后,IFM模型已经开发用于研究多种人类肌肉疾病,如肌营养不良症、肌营养不良症、肌退行性疾病、行为性病变等24、25、26 ,27,并提供了重要的见解疾病机制和潜在的疗法28,29,30。因此,果蝇是一个有用的模型,以解决肌生成领域的许多开放问题,包括肌肉类型特定转录机制,拼接和染色质调节,以及代谢在肌肉发育中的作用。现代组学技术的应用,特别是结合果蝇中种类繁多的遗传、生化和细胞生物测定,有可能极大地促进对肌肉的理解。发展、衰老和疾病。
IFM是苍蝇中最大的肌肉,在成人31、32的胸腔长度中跨越了近1毫米。然而,这种小尺寸产生挑战,以获得足够的样本,以组织类型特定的方式应用果蝇技术在果蝇。 此外,IFM 是成人肌肉的一部分,在阴极阶段形成。肌细胞引信形成肌管,在Puparium形成(APF)后24小时左右附着在肌腱上,并经历必要的压实步骤,以启动约30 h APF(图1A-D)18、33的肌张力发生。 34.
肌纤维然后生长到跨越整个胸腔的长度,与肌纤维进入初始生长阶段集中在沙科雷添加,直到约48 h APF,然后过渡到成熟阶段,其中沙科梅里增长的长度和宽度,并改造后,通过 72 h APF(图1A-D)32、35建立拉伸激活。纤维成熟开始至少部分由Salm和E2F32、36、37和多个IFM特异性沙科梅蛋白等形体控制,其拼接由Bru1控制。阶段16,17.成熟苍蝇从90-100 h APF关闭。这意味着,为了研究肌肉发育,IFM必须从多个普帕尔时间点中分离出足够的数量、质量和纯度,以便使用omics方法进行分析。
已发布IFM解剖的若干协议。虽然这些协议非常适合其预期应用程序,但没有一种是组学方法的理想选择。保留IFM形态的表扑和成人IFM19、分离IFM纤维进行机械评价31,或利用从低温节38中微分泌的PUpal IFM的表征,其特殊性和时间性和时间性大量人力为组学应用合理获取足够数量的IFM组织。已开发其他协议,用于快速解剖特定成人IFM38,39,因此不适用于普帕尔阶段, 并使用不理想或与RNA分离不兼容的缓冲液.因此,有必要开发新的方法来分离用于生物化学或组学应用的pupalIFM。
在这里,我们提出了一个协议,在pupal阶段解剖IFM,已经成功地用于mRNA-Seq分析从16 h APF到成人阶段16,32。该协议采用绿色荧光蛋白(GFP)标签来识别在普陀和成人发育的所有阶段的IFM,允许在荧光解剖显微镜下进行活体解剖。该方法的劳动密集型程度较低,其吞吐量高于现有的IFM解剖协议。这允许快速分离和冷冻保存样品,经过几轮解剖后产生足够的材料,用于组学方法以及标准逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 或西方印迹。
我们将协议分为两部分,演示如何在 48 h APF 之前(在早期变形期间,当IFM附件更脆弱时)和 48 h APF 之后(当 pupal 体计划和IFM附件定义明确时)快速剖析 IFM。我们证明,我们可以在所有时间点从解剖IFM中分离出高质量的RNA,并呈现关于RNA分离和逆转录的不同方法的数据。最后,我们以CELF1同源布鲁诺1为例,演示了解剖方案在mRNA-Seq、质谱和RT-PCR中的应用。在布鲁诺1突变IFM的蛋白质组学数据中,我们显示了沙科梅蛋白异种的误读,并检查了Myosin重链(Mhc)的C端拼接事件的布鲁诺1调控。这些结果说明了组学数据如何有助于更深入地理解生物现象,补充遗传和生化实验。
在此协议中,我们提出了从早期和晚期对蛋白质、DNA、RNA 或其他大分子进行下游分离的果蝇IFM解剖的基本技术。该协议可以很容易地调整,以解剖从成年苍蝇IFM。我们演示了我们对于mRNA-Seq、蛋白质组学和RT-PCR应用的解剖协议的效用。随着组学技术的不断改进,能够分析起始材料较少且输入浓度较低的样品,这些解剖可能对于许多附加应用变得有价值。由于IFM是人类肌病的既定模型4,24和肌肉类型特定发展9,12,我们设想,例如,IFM丰富的代谢组,染色质构象的研究通过 3C 或 4C,通过 CLiP 相互作用或肌血生成磷-蛋白质组学拼接网络评估。
请务必考虑,这些解剖会产生一个为IFM而不是纯IFM样本富集的样本。由于运动神经元内侧运动、肌腱附件和肌肉纤维的气管入侵,这是不可避免的。生物信息学分析可用于识别IFM富集基因或蛋白质,但需要进一步的实验来证明它们实际上是IFM特异性的。样品纯度可以使用已公布的组织特定标记进行检测,如条纹45(肌腱)、Act79B4、44(管状肌肉)、Act88F15 (IFM) 或 syb46(神经特定)。可能可以使用此类标记将数据集规范化为IFM特定内容,但用户需要注意,用于规范化的基因表达的时态变化,例如IFM特异性基因或图布林,可能会偏袒这种方法。
基因编码的组织特异性标记方法,例如EC标记47,48或PABP标签49,50分离RNA近年来已经开发,这可能有助于获得一个真正的组织特异性RNA样本。然而, EC 标记需要不断喂养苍蝇 47 ,因此不适用于在阶段。PABP标记转录的灵敏度和完整性可能有限制51。FACS分离单个肌肉纤维的方法由于IFM的体积大和合质而变得复杂。INTACT52,53型方法可应用于从IFM中分离特定的亚细胞腔,这可能证明对分离IFM核或线粒体的纯种群有用。对于大多数下游应用,手动解剖仍然是获得完整IFM组织的当前标准。
样品质量取决于解剖过程中的几个关键步骤。解剖技术要求很高,解剖速度和样品纯度随着经验的提高而增加。在没有洗涤剂的情况下在冷冻缓冲液中进行短时间(20-30分钟)的解剖有助于保持样品的完整性,正如之前观察到的小鼠肌腱分离54。IFM在从颗粒中去除所有缓冲液后可以成功干冷冻,但特别用于RNA分离,在隔离缓冲液中冷冻样品往往能产生更好的结果。在RNA或蛋白质分离之前,将多达20个单独解剖的IFM组合起来,允许放大和收集足够的材料,即使从早期时间点或突变体16,32进行下游分析。
对于RNA应用,最关键的步骤可能是RNA本身的分离。二恶亚硝基苯酚-氯仿分离(上述方法1)优于大多数经测试的商业试剂盒,如前所述,55便宜得多。商业试剂盒在RNA分离产量中观察到的变异性与以前的观察结果56,57一致。我们在异丙醇沉淀期间进一步添加糖原,以帮助恢复所有RNA。除了RNA产量之外,验证RNA完整性以确保样品在解剖和分离过程中没有被碎片化或降解非常重要。工作无RNase也是必不可少的。最后,RT-套件的选择会影响逆转录过程的灵敏度。虽然不经常详细讨论,但所有这些点都影响IFM样本的质量和从下游应用程序获得的数据。
几个重要的修改使协议与现有的IFM解剖协议不同。虽然 IFM 免疫荧光的详细解剖方案存在 19 ,但该协议提出了一种不同的解剖方法,允许更快速地分离 IFM 组织。这允许收集大量的IFM组织(相对而言),解剖时间有限,以防止蛋白酶或转录组的变化。其他协议描述成人 IFM 的解剖,用于在单个肌纤维蛋白 39中可视化 GFP 染色或幼虫体壁肌肉 58染色,但它们不涉及在阶段解剖或 RNA 或蛋白质的分离。这种方法也不同于现有的从低温节38中对pupal IFM进行微解剖的协议,后者可以生成更纯净的IFM样本,但劳动强度更大,产生的材料更少。与其他快速成人IFM解剖协议38,39相比,IFM在PBS缓冲液中分离,无需洗涤剂,以限制应力诱导和其他主要表达变化。
该协议的关键进展是包含一个实时的荧光报告器,允许在早期pupal阶段隔离IFM。我们标准使用Mef2-GAL459驱动UAS-CD8::GFP 或 UAS-GFP::Gma60。 这允许对IFM进行差异标记(飞行肌肉比其他脓肿肌肉更贴有强烈标签和形状不同),以及基于GAL4-UAS的操作的性能,例如救援或RNAi实验。也可以结合Mef2-GAL4与浴缸-GAL80ts,以避免RNAi相关的早期杀伤力或与UAS-Dcr2,以提高RNAi效率40。
有额外的GAL4驱动程序或GFP线可用,在肌肉类型特异性,时间表达模式,和驱动器强度19,61,可以使用代替Mef2-GAL4。例如,Act88F-GAL4 首先表示大约 24 h APF,因此不能用于较早的时间点;然而,它强烈标注IFM,并可能有助于避免RNAi相关的早期杀伤力。他-GFP 或Act88F-GFP 标签 IFM,再次具有时间限制,但它们避免了标记表达式的 GAL4 依赖性,并且可能与感兴趣的突变背景结合使用。其他可能的标记行列表有19。还应注意的是,使用转基因和 GAL4/UAS 系统可能会导致基因表达伪影,因此使用适当的控制非常重要,例如,跨越到野生类型背景应变的驱动线,以便此类伪影可能在所有样本中都相同。
在随附的视频中,此详细协议旨在使 pupal IFM 解剖更易于访问,并促进使用组学方法来研究肌肉发育。将果蝇遗传学和细胞生物学的力量与通过解剖IFM获得的生物化学和组学测定相结合,有可能促进对肌发生和肌肉功能的机械理解。未来的研究将转录组和蛋白酶调控的系统级观察与代谢和功能输出联系起来,将有助于更深入地了解肌肉类型的具体发育和肌肉疾病的发病机制。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢安德烈亚斯·拉杜纳和弗兰克·施诺勒的慷慨支持。我们感谢桑德拉·埃塞尔的出色技术援助和Akanksha Roy生成质谱数据。我们承认布卢明顿和维也纳股票中心提供苍蝇。我们感谢核心设施生物成像在共聚焦成像和Zentrall für蛋白酸化技术分析质谱样本方面的帮助,无论是在LMU生物医学中心(马丁斯里德,DE)。我们的工作得到了德国福森斯Gemeinschaft(MLS,SP 1662/3-1),慕尼黑综合蛋白质科学中心(CIPSM)的支持,在路德维希-马克西米利安大学明琴大学(MLS),弗雷德里希-鲍尔基金会(MLS)和国际马克斯普朗克研究学院(EN)。
5x High Fidelity (HF) buffer | Thermo Fisher | F518L | |
60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
black dissecting dish (glass) | Augusta Laborbedarf | 42021010 | Lymphbecken, black glass, 4×4 cm |
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder | Sigma-Aldrich | C9157 | Also available from most pharmacies |
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes). |
blue pestle | Sigma-Aldrich | Z359947-100EA | Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder |
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
chloroform | PanReac AppliChem | A3691,0500 | |
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal | Leica | www.leica-microsystems.com | |
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal | Zeiss | www.zeiss.com | |
double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip |
EtOH (100%, RNase free) | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’. |
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
microtome blades | PFM Medical | 207500003 | C35 feather 80mm |
Monarch DNase I | New England Biolabs | T2004-21 | |
Monarch DNase I Reaction Buffer | New England Biolabs | T2005-21 | |
normal goat serum | Thermo Fisher | 16210072 | |
OneTaq Polymerase | New England Biolabs | M0480X | |
Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Fisher | F-530XL | |
Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
Preomics iST 8x Kit | Preomics | P.O.00001 | peptide preparation kit for mass spectrometry |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | 725500 | mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center |
Qubit RNA Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen, Molecular Probes | 10063052 | |
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
RNA Pico Chips | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
RNase A | Promega | A7937 | |
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
slide mounting buffer, Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | containing DAPI |
statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |