Summary
मायोब्लास्ट्स पूर्ववर्ती कोशिकाओं को बढ़ारहे हैं जो पॉलीन्यूक्लिएट मायोट्यूब और अंततः कंकालीय मांसपेशी मायोफाइबर बनाने में अंतर करते हैं। यहाँ, हम कुशल अलगाव और युवा वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशियों से प्राथमिक मायोब्लास्ट ्स्स्मेशन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। विधि आणविक सक्षम बनाता है, आनुवंशिक, और संस्कृति में मांसपेशियों की कोशिकाओं के चयापचय अध्ययन.
Abstract
प्राथमिक मायोब्लास्ट कंकाल की मांसपेशी के अपृथक्करणीय प्रसारी अग्रदूत होते हैं. वे सुसंस्कृत किया जा सकता है और मांसपेशियों के अग्रदूतों के रूप में अध्ययन किया या मांसपेशियों के विकास के बाद के चरणों में अंतर करने के लिए प्रेरित किया. यहाँ प्रदान की प्रोटोकॉल अलगाव और युवा वयस्क माउस कंकाल मांसपेशी explants से मायोब्लास्ट कोशिकाओं की एक अत्यधिक proliferative आबादी की संस्कृति के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन करता है. इन कोशिकाओं को अलग माउस मॉडल के कंकाल की मांसपेशी के चयापचय गुणों के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं, साथ ही exogenous डीएनए या वायरल अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ transduction के साथ transfection के रूप में अन्य बहाव अनुप्रयोगों में. इन कोशिकाओं के भेदभाव और चयापचय प्रोफ़ाइल का स्तर जोखिम की लंबाई पर निर्भर करता है, और मायोब्लास्ट भेदभाव पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया मीडिया की संरचना। इन तरीकों माउस मांसपेशी सेल चयापचय पूर्व vivo के अध्ययन के लिए एक मजबूत प्रणाली प्रदान करते हैं. महत्वपूर्ण बात, vivo मॉडल के विपरीत, यहाँ वर्णित तरीकों एक सेल आबादी है कि विस्तार किया जा सकता है और reproducibility के उच्च स्तर के साथ अध्ययन प्रदान करते हैं.
Introduction
जबकि अक्सर समग्र चयापचय स्वास्थ्य का एक संकेत के रूप में उद्धृत, कई अध्ययनों से पता चला है कि शरीर द्रव्यमान सूचकांक (बीएमआई) पुराने वयस्कों में लगातार मृत्यु के उच्च जोखिम के साथ जुड़ा हुआ नहीं है. आज तक, इस जनसंख्या में कम मृत्यु दर के अनुरूप होने के लिए दिखाया गया एकमात्र कारक मांसपेशियों में वृद्धि हुई है1. मांसपेशियों के ऊतकों शरीर में इंसुलिन के प्रति संवेदनशील कोशिकाओं का सबसे बड़ा स्रोतों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, और इसलिए समग्र चयापचय homeostasis2के रखरखाव में महत्वपूर्ण है. व्यायाम के माध्यम से कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के सक्रियण दोनों स्थानीय इंसुलिन संवेदनशीलता और समग्र चयापचय स्वास्थ्य3में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है . जबकि vivo मॉडल में मांसपेशियों शरीर क्रिया विज्ञान और एकीकृत चयापचय पर मांसपेशी समारोह के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं, मायोट्यूब की प्राथमिक संस्कृतियों एक पथ्य प्रणाली है कि पशु अध्ययन की जटिलता को कम कर देता है प्रदान करते हैं.
प्रसव के बाद की मांसपेशियों से व्युत्पन्न मायोब्लास्ट्स का उपयोग अत्यधिक पुनरुत्पादक तरीके से कई उपचार और विकास की स्थिति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसे लंबे समय से मान्यता दी जा रही है और मायोब्लास्ट अलगाव और संस्कृति के लिए अनेक विधियों का वर्णन4,5,6,7,8,9किया गया है . इन तरीकों में से कुछ नवजात मांसपेशियों का उपयोग करें और myoblasts5,8की अपेक्षाकृत कम संख्या उपज , बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए कई जानवरों की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, myoblasts culturing के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों का उपयोग करें "पूर्व चढ़ाना" myoblasts, जो अन्य सेल प्रकार की तुलना में कम अनुयायी हैं के लिए समृद्ध करने के लिए। हम वैकल्पिक संवर्धन विधि यहाँ वर्णित पाया है और अधिक कुशल और एक उच्च proliferative मायोब्लास्ट आबादी को समृद्ध करने के लिए reprodible हो. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल संस्कृति मीडिया में वृद्धि के माध्यम से, युवा वयस्क मांसपेशी explants से अत्यधिक proliferative मायोब्लास्ट के अलगाव सक्षम बनाता है. Myoblasts बार बार काटा जा सकता है, कई दिनों से अधिक, तेजी से विस्तार, और मायोट्यूब में अंतर करने के लिए प्रेरित किया. इस प्रोटोकॉल reproducibly स्वस्थ मायोब्लास्ट कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या है कि मजबूती से सहज twitching मायोट्यूब में अंतर उत्पन्न करता है. यह हमें चयापचय और circadian लय का अध्ययन करने के लिए सक्षम किया गया है जीनोटाइप की एक किस्म के चूहों की प्राथमिक मायोट्यूब में. अंत में, हम ऑक्सीडेटिव चयापचय के अध्ययन के लिए मायोट्यूब तैयार करने के लिए तरीकों में शामिल हैं, 96-वेल प्लेटों में ऑक्सीजन की खपत दरों की माप का उपयोग कर.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल Scripps अनुसंधान के पशु देखभाल दिशा निर्देशों का पालन करता है.
1. मांसपेशियों के ऊतकों के संग्रह और प्रसंस्करण
- विच्छेदन से पहले दिन, सभी विच्छेदन उपकरण (बल्स, रेजर ब्लेड, और कैंची) बाँझ और सभी आवश्यक मीडिया तैयार: फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस), एमबी चढ़ाना मीडिया (DMEM के 12.5 एमएल, HAMS F12 के 12.5 एमएल, गर्मी में सक्रिय भ्रूण गोवाइन के 20 एमएल सीरम (एफबीएस), एमनियोटिक तरल मध्यम पूरक के 5 एमएल), और कोटिंग समाधान (DMEM के 24 एमएल, HAMS F12 के 24 एमएल, कोलेजन के 1.7 एमएल, matricgel के 1 एमएल).
- विच्छेदन के दिन, प्रत्येक मांसपेशी विच्छेदन के लिए कोटिंग समाधान के साथ एक 6 सेमी पकवान कोट. प्रत्येक प्लेट की सतह पर 2 एमएल कोटिंग समाधान जोड़ें, सतह पर एक सम कोट बनाने के लिए धीरे से हिलाएं, और प्लेटों को 1 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान के साथ इनक्यूबेट करें।
- प्लेटों से कोटिंग समाधान निकालें और स्टॉक समाधान पर वापस लौटें।
नोट: कोटिंग समाधान को छह महीने तक पुन: उपयोग किया जा सकता है और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। - प्लेटों को दो बार पीबीएस के 2 एमएल के साथ कुल्ला करने के लिए असीम कोलेजन और matricgel हटाने के लिए.
- विच्छेदन के दौरान एक 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें।
- एक प्लास्टिक बैग या एक बाँझ 15 सेमी पकवान में मोटी शोषक कागज की 2-3 चादरें रखकर एक नम कक्ष तैयार करें और बाँझ पानी के साथ कागज की सतह गीला करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
- बंध्याकरण के लिए 5 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत कक्ष रखें।
- वांछित मांसपेशियों को 4 से 8 सप्ताह पुराने माउस से अलग करें। मांसपेशियों के ऊतकों को बाँझ करने के लिए, पीबीएस में धीरे से कुल्ला जिसमें 40 ग्राम/
नोट: क्वाड्रीसेप्स और गैस्ट्रोसेमियस मांसपेशियों के लिए, प्रति प्लेट एक मांसपेशी को प्लेट करें। सोलस, प्लांटारिस और ईडीएल के लिए, दोनों पैरों की मांसपेशियों को एक प्लेट में मिलाएं। - एक बाँझ 10 सेमी गैर लेपित पेट्री डिश के लिए मांसपेशियों को स्थानांतरित करने के लिए बाँझ बलप्स का प्रयोग करें। मांसपेशियों पर चढ़ाना मीडिया के 0.5-1.0 एमएल जोड़ें इस तरह है कि ऊतक नम है, लेकिन चल नहीं है (चित्र 1A) .
- धीरे छोटे टुकड़ों में मांसपेशियों टुकड़ा करने के लिए एक बाँझ स्केलपेल या उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें (लगभग 1-3 मिमी3)।
नोट: यह सबसे अच्छा परिणाम के लिए मांसपेशियों के ऊतकों से निपटने को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. - एक पूर्व लेपित 6 सेमी प्लेट की सतह पर मांसपेशियों के टुकड़े हस्तांतरण करने के लिए संदर्श या एक पिपेट का उपयोग करें। बहुत धीरे ऊतक पर चढ़ाना मीडिया के एक अतिरिक्त 0.8 एमएल ओवरले. ऊतक के टुकड़ों को हाइड्रेटेड रखने के लिए पर्याप्त मीडिया होना चाहिए लेकिन चल नहींसकताहै ( चित्र 1बी) ।
- नम कक्ष के अंदर मांसपेशियों के टुकड़े युक्त 6 सेमी व्यंजन रखें और 48 ज के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2) पर वापस लौटें (चित्र 1ब्)।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि मांसपेशियों के टुकड़े प्लेट की सतह का पालन करने के लिए मायोब्लास्ट वृद्धि के लिए अनुमति देते हैं. प्लेटों/कक्ष को कम से कम 48 ज के लिए मत हिलाओ। - 48 ज के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए प्लेटों की सावधानीपूर्वक जांच करें कि मांसपेशियों के टुकड़े का पालन किया गया है। प्लेटिंग मीडिया के 2 एमएल के साथ ओवरले, ध्यान रखने के लिए टुकड़े उखाड़ना नहीं.
नोट: यदि प्लेटों पर दिखाई देने वाला संदूषण या मलबा है, तो मांसपेशियों के टुकड़ों को सावधानी से धो लें। प्लेट के किनारे पर पीबीएस/जेंटामिसिन समाधान की प्लेट 2 एमएल और मांसपेशियों के ऊतकों को धोने के लिए धीरे से टिप करें। पीबीएस निकालें और धोने के चरण को दोहराएँ। दूसरी धोने के बाद, चढ़ाना मीडिया के 2 एमएल ओवरले. - मायोब्लास्टों की कटाई से पहले प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अतिरिक्त 3 दिनों (मूल विच्छेदन से 5 दिन) तक रखें। मायोब्लास्ट्स के आउटवृद्धि के लिए हर दूसरे दिन की जाँच करें।
नोट: मांसपेशी एक्सप्लांट्स से उभरने वाली कोशिकाओं की उपस्थिति चर और विषमांगी होगी। प्राथमिक मायोब्लास्ट छोटे, गोल और चमकदार कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं। तथापि, इस अवस्था में अपनी उपस्थिति से उनकी पहचान करना न तो आवश्यक है और न ही विश्वसनीय है (चित्र 2)।
2. कटाई से बढ़ रहा मायोब्लास्ट्स
- तैयार और पूर्व गर्म Myoblast मीडिया (17.5 एमएल DMEM के, HAMS F12 के 17.5 एमएल, FBS के 10 एमएल, amniotic तरल पदार्थ मध्यम पूरक के 5 एमएल), trypsin, और पीबीएस / कोट एक टी 25 फ्लास्क प्रति मांसपेशी समूह कोटिंग समाधान के साथ काटा जा रहा है और के रूप में चरण 1.2 में वर्णित (तालिका 1देखें)।
- चढ़ाना मीडिया निकालें और धीरे PBS के 2 एमएल के साथ मांसपेशियों explants कुल्ला / पीबीएस को जल्दी से हटा दें (एक समय में एक प्लेट को धोलें और प्लेट को इस चरण में पीबीएस में बैठने न दें)।
- पीबीएस/जेंटामिसिन के 1 एमएल को धीरे-धीरे जोड़ें और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 1 मिनट के लिए रखें।
- 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस/कोशिकाओं को एकत्र करने के लिए P1000 पिपेट का उपयोग करें।
- प्लेट में 1 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर वापस लौटें। मायोब्लास्ट्स को उखाड़ने के लिए प्लेटों को धीरे-धीरे टैप करें। trypsin/cells लीजिए और PBS संग्रह के साथ गठबंधन. अपकेंद्रित्र ट्यूब में 8 एमएल मायोब्लास्ट मीडिया जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे से उलटा करें।
- मांसपेशी प्लेटों पर प्लेटिंग समाधान के 2 एमएल को धीरे से ओवरले करें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर वापस लौटें।
- अपकेंद्रित्र ट्यूबों को 200 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं से युक्त स्पिन करें .
- सेल गोली से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है, $ 1 एमएल के लिए supernatant aspirate. धीरे से Myoblast मीडिया जोड़ें (तालिका 1देखें) और पूर्व लेपित फ्लास्क और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित. यह पी0 फसल है। यदि सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखा जाए तो बहुत कम कोशिकाएं हो सकती हैं(चित्र 3)।
- हर दूसरे दिन तीन बार तक ऊपर वर्णित फसल को दोहराएँ। तीसरी फसल के बाद, explants त्याग दें.
3. विस्तार और Proliferating Myoblasts के संवर्धन
नोट: P0 फसल विषम हो जाएगा ($60% मायोब्लास्ट्स). अगले 2 मार्ग चुनिंदा myoblasts फसल के लिए पीबीएस का उपयोग करें. अधिक अनुयायी कोशिकाओं के कई पीछे छोड़ दिया जाएगा और तेजी से बढ़ myoblasts 2 मार्ग के भीतर 95% शुद्ध हो जाएगा. एक बार मायोब्लास्टस्थापित हो जाने के बाद, उन्हें सहज भेदभाव से बचने के लिए कम घनत्व पर बनाए रखा जाना चाहिए।
- खंड 2 से $ 40-50% के प्रत्येक T25 फ्लास्क के लिए, कोट एक T75 फ्लास्क को 5 एमएल कोटिंग समाधान के साथ और 1-4 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- फ्लास्क से कोटिंग समाधान निकालें और स्टॉक समाधान पर वापस लौटें। फ्लास्क को 2 एमएल पीबीएस/जेंटामिसिन के साथ दो बार कुल्ला करें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
- P0 मायोब्लास्ट T25 फ्लास्क से मीडिया को प्रेरित करें। 2 एमएल गर्म पीबीएस/जेंटामिसिन के साथ कोशिकाओं को संक्षेप में कुल्ला करें। फ्लास्क से एस्पायर पीबीएस।
नोट: इस कदम का उद्देश्य (3.3) जीवाणु संदूषण की संभावना को कम करने के लिए है. यदि जल्दी और धीरे से प्रदर्शन किया, यह मायोब्लास्ट्स के नुकसान में परिणाम नहीं होना चाहिए. यह myoblast संरक्षण को अधिकतम करने के लिए छोड़ा जा सकता है अगर वांछित. - पिपेट 2 एमएल गर्म पीबीएस (नहीं trypsin) मायोब्लास्ट युक्त प्रत्येक फ्लास्क में। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पीबीएस के साथ फ्लास्क रखें।
नोट: मायोब्लास्ट्स को पीबीएस के साथ फ्लास्क से आसानी से अलग करना चाहिए। इस कदम पर trypsin के बजाय PBS का उपयोग अन्य सेल प्रकार के साथ मायोब्लास्ट आबादी के संदूषण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. - 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें और कोशिकाओं को उखाड़ने के लिए फ्लास्क के पक्ष को मजबूती से टैप करें। स्वतंत्र रूप से चल मायोब्लास्ट के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जाँच करें।
- एक ऊतक संस्कृति हुड में सीधा फ्लास्क प्लेस और सभी कोशिकाओं disloged रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए Myoblast मीडिया के 10 एमएल के साथ फ्लास्क के नीचे कुल्ला 2-3 बार.
- सेल/मीडिया मिश्रण को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र कीजिए। 200 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
- लगभग 1 एमएल के लिए मीडिया aspirate, सेल गोली से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है. धीरे से अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए Myoblast मीडिया की एक उचित मात्रा में जोड़ने के लिए और धीरे मिश्रण.
- नए T75 फ्लास्क के लिए सेल मिश्रण वितरित करें. प्रत्येक नए T75 फ्लास्क के लिए Myoblast मीडिया के 10 एमएल जोड़ें. फ्लास्क को क्षैतिज रूप से हिलाकर कोशिकाओं को वितरित किया जाता है और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह होती है।
- दो दिन बाद, पीबीएस के साथ एक बार फिर से पारित, तीन T75 फ्लास्क में प्रत्येक T75 फ्लास्क बंटवारे.
नोट: मायोब्लास्ट्स को 50%-60% से अधिक होने की अनुमति न दें, क्योंकि इससे उन्हें अलग-अलग होना होगा और प्रोलिफैटर क्षमता खो नीर होगी। - अतिरिक्त मार्ग के लिए, trypsin का उपयोग करें. पीबीएस पैदावार के साथ दो बार गुजरना ; 95% मायोब्लास्ट्स; शुद्धता में और सुधार करने के प्रयासों से गरीब भेदभाव होता है।
4. मायोट्यूब के लिए प्राथमिक मायोब्लास्ट्स का भेदभाव
- प्लेट P2 (या बाद में पारित) लेपित प्लेटों पर Myoblast मीडिया में myoblasts (सुझाव कोटिंग और चढ़ाना संस्करणों और सेल संख्या के लिए तालिका 1 देखें). दो या तीन दिन बाद, जब कोशिकाओं को 70-80% संगम पर हैं, भेदभाव मीडिया के लिए मीडिया को बदलने (DMEM के 24 एमएल, HAMS F12 के 24 एमएल, गर्मी के 1.5 एमएल निष्क्रिय घोड़े सीरम, इंसुलिन-सेलेनियम-Transferrin के 0.5 एमएल).
- मायोट्यूब में प्राथमिक मायोब्लास्टकेश के भेदभाव के दौरान हर दूसरे दिन भेदभाव मीडिया बदलें। भेदभाव आम तौर पर 4-5 दिन से पूरा हो जाता है और लम्बी, जुड़े कोशिकाओं है कि स्वतः हिल द्वारा चिह्नित किया जाएगा. 6 दिनों के भीतर विभेदित मायोट्यूब पर प्रयोग करें। आमतौर पर कोशिकाओं भेदभाव की शुरुआत के बाद पांच या छह दिन परख कर रहे हैं.
5. 96-वेल प्लेट्स में मायोब्लास्ट ्स या मायोट्यूब में ऑक्सीजन उपभोग दर को मापना
- कोट 96 अच्छी तरह से प्रति कोटिंग समाधान के 25 डिग्री एल के साथ प्लेटें. किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए 58 x ग्राम पर प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें।
- प्लेटकोटिंग समाधान में प्लेटकोटिंग को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-4 एच के लिए इनक्यूबेट करें। कोटिंग समाधान को हटाने और ठंड पीबीएस / gentamicin के 25 डिग्री एल में तीन बार धोने के लिए मल्टी चैनल पिपेट का प्रयोग करें। कोई बुलबुले फंस रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए इन washes में से कम से कम एक सेंट्रीफ्यूज।
- प्रत्येक अच्छी तरह से भेदभाव मीडिया के 40 $L जोड़ें. बुलबुले से बचने के लिए और मीडिया की एक समान परत पाने के लिए सतह तनाव को दूर करने के लिए 58 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए कोई कोशिकाओं के साथ लेपित प्लेट पर मीडिया centrifuge।
- प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया के एक अतिरिक्त 40 $L में निलंबित कोशिकाओं जोड़ें. 58 x gपर फिर से स्पिन |
नोट: चढ़ाना में संगतता सबसे अच्छा परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है और अच्छी तरह से प्रति चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटअप के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, और संभावना की सीमा में होगा $10,000-25,000 myoblasts एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति भेदभाव मीडिया में चढ़ाया. - धीरे से भेदभाव के दौरान मीडिया दैनिक बदल जाते हैं. मीडिया को प्रेरित न करें बल्कि इसे एक पिपेट के साथ हटा दें, कोशिकाओं को अलग करने या उन्हें हवा में उजागर करने से बचने के लिए पीछे एक छोटी मात्रा छोड़ दें। उदाहरण के लिए, एक बार में सभी 80 डिग्री सेल्सियस के बजाय तीन दोहरावों के लिए एक समय में 50 डिग्री सेल्सियस बदलें।
- प्रति शर्त 8-15 कुओं का प्रयोग करें। यह कुछ कुओं को छोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है अगर कोशिकाओं मायोट्यूब की एक समान परत फार्म नहीं है.
नोट: प्लेट के किनारों पर ओमिट कुओं क्योंकि वे वाष्पीकरण के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं। व्यवस्थित त्रुटियों से बचने के लिए प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए प्लेट सेटअप को अलग करें। - पूर्ण विभेदन के 1-2 दिनों के भीतर विभेदित मायोट्यूब पर वांछित परख करें (दिन 4-6 भेदभाव की शुरुआत से).। ऑक्सीजन की खपत दरों के मापन के लिए अनुशंसित उपकरण और अभिकर्मक सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं .
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Representative Results
प्रदत्त प्रोटोकॉल की धारा 1 के बाद उन एक्सप्लांटों से निकलने वाली प्राथमिक कोशिकाओं को प्राप्त करना चाहिए जो मानक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के अधीन दिखाई देंगी (चित्र 2) । एक विषमांगी कोशिका जनसंख्या प्रत्येक मांसपेशी ऊतक एक्सप्लांट के बाहर और आसपास के बढ़ते देखा जाएगा। Myoblasts छोटे, गोल, उज्ज्वल क्षेत्रों के रूप में दिखाई देगा। प्रोटोकॉल की धारा 2 के बाद ऊतक एक्सप्लांट्स से मायोब्लास्ट्स की शीघ्र फसल निकलेगी, जिसमें कुछ कोशिकाएं होंगी और विषमांगी (चित्र 3) होगी। प्रोटोकॉल की धारा 3 PBS के साथ जल्दी फसल passaging का वर्णन करता है (trypsin के बजाय), जो आगे culturing के लिए myoblasts के एक अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी प्रदान करेगा. प्रोटोकॉल की धारा 4 के बाद आगे प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए पूरी तरह से विभेदित मायोट्यूब उपज होगी। मायोब्लास्ट्स के विभेद में आमतौर पर 4-6 दिन लगते हैं, जिसके दौरान कोशिकाओं की आकृति विज्ञान एकल, गोल क्षेत्रों से लम्बी, जुड़े, लंबे बहुकेंद्रकी फाइबर ( चित्र 4 ) में बदलजाएगा। प्रोटोकॉल की धारा 5 के बाद 96-वेल प्लेटों में विभेदित मायोट्यूब का उत्पादन होगा ताकि ऑक्सीजन की खपत और अकोशिक अम्लीकरण दर10 (चित्र 5) में परिवर्तन के आधार पर विभिन्न प्रकार के चयापचय विशेषताओं को सक्षम किया जा सके।
चित्र ाााल1: चतुष्क पेशी का विच्छेदन और संसाधन। (ए) क्वारीसेप्स मांसपेशी जिसे 10 सेमी डिश में स्थानांतरित करने से पहले पीबीएस के साथ ताजा विच्छेदन और कुल्ला किया गया है। चढ़ाना मीडिया के 1 एमएल प्रसंस्करण के लिए मढ़ा गया है। (बी) पूर्व लेपित 6 सेमी प्लेट में स्थानांतरण के बाद मांसपेशियों के ऊतकों के टुकड़े। (ग) 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थान देने से पहले नम कक्ष के अंदर 6 सेमी प्लेटें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: मायोब्लास्ट्स की वृद्धि। क्वेरिसेप्स मांसपेशी एक्सप्लांट्स से मायोब्लास्ट्स की वृद्धि। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: प्रारंभिक मार्ग मायोब्लास्ट्स। T25 फ्लास्क के हस्तांतरण और लगाव के बाद पी 0 मायोब्लास्ट्स। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र ााा्वित: प्राथमिक मायोट्यूब का प्लेटिंग और विभेदन। ((ए) विभेदन मीडिया के संपर्क में आने के एक दिन बाद मायोब्लास्ट्स। (बी, सी) विभेदकी शुरुआत के बाद पांच (बी) या छह (सी) दिन अलग-अलग मायोट्यूब। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: Myotubes ऑक्सीजन की खपत दरों की माप के लिए तैयार है. पूरी तरह से विभेदित myotubes एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति microplate के प्रत्येक कुएं में भेदभाव मीडिया में 20,000 मायोब्लास्ट चढ़ाना के बाद पांच दिन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
कंकाल की मांसपेशी चयापचय होमियोस्टेसिस11की स्थापना और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है . मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन interindividual परिवर्तनशीलता से जटिल है, साथ ही नमूने प्राप्त करने में कठिनाई, विशेष रूप से मानव अध्ययन के मामले में. सभ्य प्राथमिक मायोट्यूब मांसपेशियों के शरीर क्रिया विज्ञान की कई विशेषताओं को फिर से दोहराने के लिए दिखाया गया है, कैल्शियम homeostasis12सहित , क्षतिग्रस्त मांसपेशियों के ऊतकों के पुनर्जनन5,13व्यायाम करने के लिए प्रतिक्रिया में चयापचय परिवर्तन , और मधुमेह14जैसे रोगों से उत्पन्न चयापचय में परिवर्तन . चूहों से मायोब्लास्ट और मायोट्यूब की प्राथमिक संस्कृति मांसपेशियों की कोशिकाओं की जांच में सक्षम बनाता है जो अच्छी तरह से परिभाषित आनुवंशिक जोड़-तोड़ को आश्रय देता है, और मानव मांसपेशी बायोप्सी से व्युत्पन्न मायोट्यूब के अध्ययन के लिए एक पूरक प्रदान करता है12,15 ,16. इसलिए, अलगाव और माउस प्राथमिक मायोब्लास्ट और मायोट्यूब की संस्कृति के लिए तरीकों को मांसपेशियों सेल समारोह पूर्व vivo के reproduible, उच्च throughput जांच सक्षम करने के लिए आवश्यक हैं. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल की स्थापना और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की एक किस्म के तहत प्राथमिक माउस myoblasts और मायोट्यूब के अध्ययन के लिए अनुमति देता है.
जबकि पिछले प्रोटोकॉल explant संस्कृतियों से मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन किया है, इस प्रोटोकॉल मांसपेशियों के ऊतकों के कई अलग अलग प्रकार से myoblasts के सफल अलगाव के लिए एक विधि प्रदान करता है. इसके अलावा, इस विधि आगे प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए स्टेम सेल की एक काफी बड़ी आबादी पैदावार. इसके अलावा, इस विधि परिपक्व मांसपेशियों की कोशिकाओं के मार्करों व्यक्त है कि विभेदित मायोट्यूब उपज के रूप में मान्य किया गया है17, और इस तरह के circadian लय17 और mitogen सक्रिय प्रोटीन kinase (MAPK) संकेत के रूप में सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान, प्रदर्शन transduction18|
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम मांसपेशी ऊतक explants के विच्छेदन और प्रसंस्करण, साथ ही फसल के बीच संदूषण से बचने कर रहे हैं। ऊतकों के अधिक प्रसंस्करण से बचने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। जबकि मांसपेशियों के छोटे टुकड़े मायोब्लास्ट्स की बड़ी संख्या उपज, मांसपेशियों के अत्यधिक काटने स्टेम सेल वृद्धि को रोकने सकता है. हालांकि यह महत्वपूर्ण है कि एक बार जब वे प्लेटिंग कर रहे हैं explants उखाड़ना नहीं है, PBS के साथ प्लेटों की सावधान धोने / फसली myoblasts एक 10% DMSO /90% Myoblast मीडिया मिश्रण का उपयोग कर cryovials में P2 कोशिकाओं के रूप में जमे हुए किया जा सकता है. जबकि मायोब्लास्ट्स को विकास की सुविधा के लिए उच्च घनत्व पर बनाए रखने की आवश्यकता नहीं है, यह सलाह दी जाती है कि कोशिकाओं को 40-50% संगम पर जमे हुए हैं। आमतौर पर, एक T75 फ्लास्क कोशिकाओं के 4 क्रायोविएल्स पैदावार।
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Disclosures
कोई नहीं.
Acknowledgments
लेखक मेलबोर्न विश्वविद्यालय में डॉ मैथ्यू वाट और जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय में डॉ अनास्तासिया Kralli के आभारी हैं मदद के लिए इस प्रोटोकॉल को अपनाने Mokbel एट अल6के काम पर आधारित है . हम भी विकास और हमारी प्रयोगशाला में इस प्रोटोकॉल को अपनाने की सहायता के लिए डॉ सबीन जॉर्डन धन्यवाद. इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान R01s DK097164 और DK112927 द्वारा K.A.L. के लिए वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15 mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
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