Summary
Myoblaster er prolifererende prækursorceller, der differentierer til dannelse af polynucleerede myotubes og i sidste ende skeletmuskulatur myofibers. Her præsenterer vi en protokol for effektiv isolation og kultur af primære myoblaster fra unge voksne mus skeletmuskulatur. Metoden muliggør molekylære, genetiske og metaboliske undersøgelser af muskelceller i kulturen.
Abstract
Primære myoblaster er udifferentierede prolifererende forstadier af skeletmuskulatur. De kan dyrkes og undersøgt som muskel prækursorer eller induceret til at differentiere i senere stadier af muskel udvikling. Den protokol, der gives her beskriver en robust metode til isolation og kultur af en meget proliferativ population af fremmer celler fra unge voksne mus skeletmuskulatur explants. Disse celler er nyttige for studiet af de metaboliske egenskaber af skeletmuskulatur af forskellige musemodeller, såvel som i andre downstream applikationer såsom transfektering med eksogen DNA eller transduktion med viral Expression vektorer. Graden af differentiering og metaboliske profil af disse celler afhænger af eksponeringens længde, og sammensætningen af de medier, der anvendes til at inducere fremmer differentiering. Disse metoder giver et robust system til undersøgelse af muse muskel cellemetabolisme ex vivo. Vigtigere, i modsætning til in vivo-modeller, de metoder, der er beskrevet her, giver en cellepopulation, som kan udvides og undersøgt med høje niveauer af reproducerbarhed.
Introduction
Mens ofte citeret som en indikation af samlede metaboliske sundhed, flere undersøgelser har vist, at Body Mass Index (BMI) hos ældre voksne ikke er konsekvent forbundet med højere risiko for dødelighed. Til dato, den eneste faktor vist at være i overensstemmelse med reduceret dødelighed i denne population er øget muskel masse1. Muskelvæv repræsenterer en af de største kilder til insulin-følsomme celler i kroppen, og er derfor kritisk i vedligeholdelsen af den samlede metaboliske homøostase2. Aktivering af skeletmuskulatur væv via motion er forbundet med stigninger i både lokale insulinfølsomhed og samlede metaboliske sundhed3. Mens in vivo modeller er afgørende for at studere muskel fysiologi og virkningen af muskelfunktion på integreret metabolisme, primære kulturer af myotubes giver en Tractable system, der reducerer kompleksiteten af dyreforsøg.
Myoblaster afledt af postnatale muskler kan bruges til at undersøge virkningen af talrige behandling og vækstbetingelser i en meget reproducerbar måde. Dette har længe været anerkendt, og flere metoder til fremmer isolation og kultur er blevet beskrevet4,5,6,7,8,9. Nogle af disse metoder bruger neonatal muskler og giver relativt lavt antal myoblaster5,8, der kræver flere dyr til større skala undersøgelser. Også, mest udbredte metoder til dyrkning myoblaster bruge "pre-plating" at berige for myoblaster, som er mindre Veder end andre celletyper. Vi har fundet den alternative berigende metode, der er beskrevet her, for at være langt mere effektiv og reproducerbar for at berige en meget proliferativ fremmer-population. Sammenfattende giver denne protokol mulighed for isolering af meget proliferativ myoblaster fra unge voksne muskel explants, via udvækst til kultur medier. Myoblaster kan høstes gentagne gange, over flere dage, hurtigt ekspanderet, og induceret til at skelne til myotubes. Denne protokol genererer reproducerbart et stort antal raske fremmer-celler, der i høj grad adskiller sig i spontant trækninger myotubes. Det har gjort det muligt for os at studere metabolisme og døgnrytme i primære myotubes af mus af en række genotyper. Endelig omfatter vi metoder til fremstilling af myotubes til undersøgelse af oxidativ metabolisme, ved hjælp af målinger af iltforbrug satser i 96-brønd plader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne for dyrepasning i Scripps Research.
1. indsamling og behandling af muskelvæv Explants
- Dagen før dissektion, sterilisere al dissektions udstyr (pincet, barberblade og saks) og forberede alle nødvendige medier: fosfat bufferet saltvand (PBS), MB plating medier (12,5 mL DMEM, 12,5 mL SKINKE F12, 20 mL varme inaktiveret føtal serum (FBS), 5 mL amniotisk væske medium supplement) og belægnings opløsning (24 mL DMEM, 24 mL SKINKE F12, 1,7 mL kollagen, 1 mL matrigel).
- Dagen for Dissection, coat en 6-cm skål med belægning løsning for hver muskel, der skal dissekeret. Tilsæt 2 mL overfladebehandlings opløsning til overfladen af hver plade, Ryst forsigtigt for at skabe en jævn frakke på overfladen, og Inkuber pladerne med en opløsning ved 4 °C i 1 time.
- Fjern overfladebehandlings opløsningen fra pladerne, og vend tilbage til stamopløsningen.
Bemærk: Overfladebehandlings opløsningen kan genbruges i op til seks måneder og opbevares ved 4 °C. - Pladerne skylles to gange med 2 mL PBS for at fjerne ubundet kollagen og matrigel.
- Pladerne placeres i en 37 °C-vævskultur inkubator under dissektionerne.
- Forbered et fugtigt kammer ved at anbringe 2-3 ark tykt absorberende papir i en plastikpose eller en steril 15 cm skål og brug en pipette til at våd papirets overflade med sterilt vand.
- Placer kammeret under UV-lys i 5 min at sterilisere.
- Dissekere ønskede muskler fra en 4 til 8-ugers gammel mus. For at sterilisere muskelvæv skylles forsigtigt i PBS, der indeholder 40 μg/mL gentamicin.
Bemærk: For quadriceps og gastrocnemius muskler, plade en muskel pr. plade. For soleus, plantaris og EDL, kombinere muskler fra begge ben i en plade. - Brug sterile pincet til at overføre musklen til en steril 10 cm ikke-belagt Petri skål. Tilsæt 0,5-1,0 mL plating medier over musklen sådan at vævet er fugtig, men ikke flydende (figur 1a).
- Brug en steril skalpel eller barberkniv til forsigtigt at opdele musklen i små fragmenter (ca. 1-3 mm3).
Bemærk: Det er vigtigt at minimere håndteringen af muskelvæv for de bedste resultater. - Brug pincet eller en pipette til at overføre muskel fragmenter til overfladen af en forbelagt 6 cm plade. Meget forsigtigt overlay en ekstra 0,8 mL plating medier over vævet. Der bør være nok medier til at holde vævet stykker hydreret, men ikke flydende (figur 1B).
- Placer de 6 cm-skåle, der indeholder muskel fragmenter i det fugtige kammer, og vend tilbage til en inkubator (37 °C, 5% CO2) for 48 h (figur 1C).
Bemærk: Det er afgørende, at muskel fragmenter overholder overfladen af pladen for at give mulighed for fremmer udvækst. Flyt ikke pladerne/kammeret i mindst 48 h. - Efter 48 h, omhyggeligt kontrollere pladerne for at sikre, at muskel fragmenter har overholdt. Overlay med 2 mL plating medier, at passe på ikke at skille fragmenter.
Bemærk: Hvis der er synlig forurening eller snavs på pladerne, omhyggeligt vaske muskelstykker. Plade 2 mL PBS/gentamicin opløsning på kanten af pladen og spidsen forsigtigt at vaske over muskelvæv. Fjern PBS, og Gentag vaske trinnet. Efter den anden vask, overlay 2 mL plating medier. - Opbevar pladerne i 37 °C-inkubator i op til yderligere 3 dage (5 dage fra den oprindelige dissektion), før du høster myoblaster. Tjek hver anden dag for udvækst af myoblaster.
Bemærk: Fremkomsten af celler, der dukker op fra muskel bruskeksplantater, vil være variable og heterogene. Primære myoblaster vises som små, runde og lyse celler. Det er imidlertid hverken nødvendigt eller pålideligt at identificere dem ved deres udseende på nuværende tidspunkt (figur 2).
2. høst udvoksede Myoblaster
- Forbered og Forvarm Myoblast Media (17,5 mL DMEM, 17,5 mL SKINKE F12, 10 mL FBS, 5 mL amniotisk væske medium supplement), trypsin og PBS/gentamicin. En T25-kolbe pr. muskel gruppe, der høstes med belægnings opløsning, og som beskrevet i trin 1,2 (Se tabel 1).
- Fjern plating mediet, og skyl muskel explanterne forsigtigt med 2 mL PBS/gentamicin. Fjern hurtigt PBS (skyl én plade ad gangen, og lad ikke pladen sidde i PBS på dette trin).
- Tilsæt forsigtigt 1 mL PBS/gentamicin og Anbring pladen i 37 °C inkubator i 1 min.
- Brug en P1000-pipette til at samle PBS/celler i et 15 mL centrifugeglas.
- Tilsæt 1 mL trypsin til pladen og vend tilbage til 37 °C inkubator i 3 min. Tryk forsigtigt på pladerne for at opløse myoblaster. Saml trypsin/cellerne og Kombiner med PBS kollektionen. Tilsæt 8 mL Myoblast-mediet til centrifugeglasset, og vend forsigtigt for at blande.
- Overlejring forsigtigt 2 mL plating opløsning på muskel pladerne og vend tilbage til 37 °C inkubator.
- Centrifuge rørene, der indeholder cellerne i en centrifuge, centrifugeres i 3 min. ved 200 x g.
- Aspirer supernatanten til ~ 1 mL, idet man er omhyggelig med at undgå celle pellet. Tilsæt forsigtigt Myoblast-mediet (Se tabel 1), og Overfør cellerne til den forbelagte kolbe, og Placer dem i 37 °c-inkubator. Dette er den p0 høst. Hvis det observeres under et mikroskop, kan der være meget få celler (figur 3).
- Gentag høsten beskrevet ovenfor hver anden dag op til tre gange. Efter den tredje høst, kassere explants.
3. udvidelse og berigelse af prolifererende Myoblaster
Bemærk: Den p0 høst vil være heterogene (~ 60% myoblaster). De næste 2 passager bruger PBS til selektivt høst myoblaster. Mange af de mere vedlige celler vil blive ladt tilbage, og de hurtigt prolifererende myoblaster vil være ≥ 95% ren inden for 2 passager. Når myoblaster er etableret, bør de opretholdes ved lav densitet for at undgå spontan differentiering.
- For hver T25-kolbe på ~ 40-50% flydende-celler fra afsnit 2, coat en T75 kolbe med 5 ml overfladebehandlings opløsning og anbringes ved 4 °c i 1-4 h.
- Fjern overfladebehandlings opløsningen fra kolberne og vend tilbage til stamopløsningen. Kolberne skylles to gange med 2 mL PBS/gentamicin og placeres i 37 °C-inkubator.
- Aspirer mediet fra p0 fremmer T25-kolber. Cellerne skylles kort med 2 mL varm PBS/gentamicin. Aspirere PBS fra kolben.
Bemærk: Formålet med dette trin (3,3) er at reducere risikoen for bakteriel kontaminering. Hvis det udføres hurtigt og forsigtigt, bør det ikke resultere i tab af myoblaster. Det kan udelades for at maksimere fremmer bevaring, hvis det ønskes. - Der afpipetteres 2 mL varm PBS (ikke trypsin) i hver kolbe med myoblaster. Kolberne med PBS placeres i 37 °C-inkubator i 3 min.
Bemærk: Myoblaster bør let løsne fra kolber med PBS. Brug af PBS i stedet for trypsin på dette trin er afgørende for at reducere kontaminering af fremmer-populationen med andre celletyper. - Fjern cellerne fra 37 °C-inkubator og den faste Tap-side af kolberne for at opløse cellerne. Kontroller under et let mikroskop for frit flydende myoblaster.
- Kolberne placeres oprejst i en vævs kulturs hætte og skylles i bunden af kolberne med 10 mL Myoblast-medier 2-3 gange for at sikre, at alle celler bliver opløst.
- Celle/medie blandingen opsamles i et 15 mL centrifugeglas. Centrifuger i 3 min. ved 200 x g.
- Aspirer medierne til omkring 1 mL, at være omhyggelig med at undgå celle pellet. Tilsæt forsigtigt en passende mængde Myoblast-medier til centrifuge røret og bland forsigtigt.
- Distribuer celle blandingen til nye T75 kolber. Tilsæt 10 mL Myoblast-medier til hver ny T75 kolbe. Ryst forsigtigt kolberne vandret for at distribuere cellerne og Placer dem i 37 °C-inkubator natten over.
- To dage senere, passage igen med PBS, opdele hver T75 kolbe i tre T75 kolber.
Bemærk: Lad ikke myoblaster blive mere end 50%-60% confluent, da dette ville få dem til at begynde at differentiere og tabe produktiv kapacitet. - Brug trypsin til yderligere passager. Passaging to gange med PBS udbytter > 95% myoblaster; forsøg på yderligere at forbedre renheden har tendens til at resultere i dårligere differentiering.
4. differentiering af primære Myoblaster til Myotubes
- Plade P2 (eller senere passage) myoblaster i Myoblast-medier på coatede plader (Se tabel 1 for foreslået belægning og plating volumener og cellenumre). To eller tre dage senere, når cellerne er på 70-80% konfluency, ændre medierne til differentiering medier (24 mL DMEM, 24 mL SKINKE F12, 1,5 mL varme inaktiveret hest serum, 0,5 mL insulin-selen-transferrin).
- Skift differentierings medier hver anden dag under differentiering af primære myoblaster i myotubes. Differentieringen er typisk komplet ved dag 4-5 og vil blive markeret af aflange, smeltet celler, der spontant spjæt. Udfør eksperimenter på differentierede myotubes inden for 6 dage. Typisk celler er analyseret fem eller seks dage efter initiering differentiering.
5. måling af iltforbrug i Myoblaster eller Myotubes i 96-brønd plader
- Coat 96-brønd plader med 25 μL belægning opløsning pr brønd. Centrifuger pladerne ved 58 x g i 1 min. for at fjerne eventuelle bobler.
- Pladerne inkubates i overfladebehandlings opløsningen til 1-4 h ved 4 °C. Brug multikanalpipette til at fjerne belægnings opløsningen og vask tre gange i 25 μL kold PBS/gentamicin. Centrifuger mindst en af disse vaske for at sikre, at ingen bobler er fanget.
- Tilsæt 40 μL differentierings medie til hver brønd. Centrifuger mediet på den coatede plade uden celler i 1 min ved 58 x g for at undgå bobler og fjerne overflade spændinger for at få et ensartet lag af medier.
- Tilføj celler suspenderet i yderligere 40 μL medier til hver brønd. Spin igen på 58 x g.
Bemærk: Konsistens i plating er vigtigt for de bedste resultater og antallet af celler belagt pr brønd bør optimeres for hver eksperimentel opsætning, og vil sandsynligvis være i intervallet ~ 10000-25000 myoblaster belagt i differentiering medier pr brønd af en 96-brønd plade. - Skift forsigtigt medierne dagligt under differentiering. Du må ikke aspirere medierne, men snarere fjerne det med en pipette, efterlader en lille volumen bag for at undgå at skille cellerne eller udsætte dem til luften. Udskift for eksempel 50 μL ad gangen for tre gentagelser i stedet for alle 80 μL på én gang.
- Brug 8-15 brønde pr. tilstand. Det kan være nødvendigt at udelade nogle brønde, hvis cellerne ikke danner et ensartet lag af myotubes.
Bemærk: Udelad brønde på kanterne af pladen, fordi de er meget modtagelige for fordampning. Varier plade opsætningen for eksperimentelle replikater for at undgå systematiske fejl. - Udfør den ønskede analyse på differentierede myotubes inden for 1-2 dage med fuld differentiering (dag 4-6 fra start af differentiering). Anbefalede instrumenter og reagenser til måling af iltforbrug er anført i tabellen over materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I henhold til afsnit 1 i den medfølgende protokol skal primær cellerne fremkommer fra de bruskeksplantater, der vil være synlige under et standardlys mikroskop (figur 2). En heterogen cellepopulation vil blive set vokser ud af og omgiver hver muskelvæv explant. Myoblaster vil fremstå som små, runde, lyse kugler. Efter afsnit 2 i protokollen vil give tidlig høst af myoblaster fra vævs explants, som vil indeholde få celler og vil være heterogene (figur 3). Afsnit 3 i protokollen beskriver passaging tidlig høst med PBS (snarere end trypsin), som vil give en relativt ren population af myoblaster for yderligere dyrkning. Efter afsnit 4 i protokollen vil give fuldt differentierede myotubes for yderligere eksperimentel manipulation. Differentieringen af myoblaster tager typisk 4-6 dage, hvor cellernes morfologi vil skifte fra enkelte, runde sfærer til aflange, sammensmeltet, lang flerkernede fibre (figur 4). Efter afsnit 5 i protokollen vil producere differentierede myotubes i 96-brønd plader til at muliggøre en række metaboliske karakteriseringer baseret på ændringer i iltforbrug og ekstracellulære forsuring satser10 (figur 5).
Figur 1: dissektion og behandling af quadriceps muskel. A) quadriceps-muskler, der er blevet nydissekeret og SKYLLET med PBS inden overførsel til en 10 cm skål. 1 mL plating medier er blevet overlagt til forarbejdning. (B) quadriceps muskelvæv stykker efter overførsel til pre-coated 6 cm plade. C) 6 cm plader inde i fugtigt kammer inden placering i 37 °c inkubator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: udvækst af myoblaster. Udvækst af myoblaster fra quadriceps muskel explants. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tidlige passage myoblaster. P0 myoblaster efter overførsel og fastgørelse til T25-kolbe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: overfladebelægning og differentiering af primære myorør. A) myoblaster en dag efter påbegyndelse af eksponering for differentierings medier. (B, C) Forskellige myotubes fem (B) eller seks (C) dage efter initiering af differentieringen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Myotubes klar til måling af iltforbrug. Fuldt differentieret myotubes fem dage efter plating 20.000 myoblaster i differentiering medier i hver brønd af en 96-brønd cellekultur mikropladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skeletmuskulatur er afgørende for etablering og vedligeholdelse af metabolisk homøostase11. Studiet af muskel fysiologi kompliceres af den interindividuelle variation, samt vanskeligheder med at få prøver, især i tilfælde af humane undersøgelser. Kulturperler primære myotubes har vist sig at rekapitulere mange funktioner i muskel fysiologi, herunder calcium homøostase12, regenerering af beskadigede muskelvæv5, metaboliske ændringer som reaktion på motion13, og ændringer i metabolisme som følge af sygdomme som diabetes14. Primær kultur af myoblaster og myotubes fra mus muliggør undersøgelse af muskelceller, der harkedeligt veldefinerede genetiske manipulationer, og giver et supplement til undersøgelser af myotubes afledt af humane muskelbiopsier12,15 ,16. Derfor er metoder til isolation og kultur af mus primære myoblaster og myotubes afgørende for at muliggøre reproducerbar, høj gennemløb undersøgelse af muskel celle funktion ex vivo. Den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for etablering og undersøgelse af primære mus myoblaster og myotubes under en række eksperimentelle manipulationer.
Mens tidligere protokoller har beskrevet isolering af muskel stamceller fra explant kulturer, denne protokol giver en metode til vellykket isolering af myoblaster fra flere forskellige typer af muskelvæv. Desuden giver denne metode en signifikant større population af stamceller til yderligere eksperimentel manipulation. Endvidere er denne metode blevet valideret som fremstilling af differentierede myotubes, der udtrykker markører for modne muskelceller17, og udviser normal fysiologi, såsom døgnrytmen17 og mitogen aktiveret protein kinase (MAPK) signal transduktion18.
De kritiske trin i protokollen er dissektion og behandling af muskelvæv explants, samt undgåelse af kontaminering mellem høster. Der bør udvises forsigtighed for at undgå over behandling af vævet. Mens mindre stykker af muskel udbytte større antal myoblaster, overdreven skæring af musklen kunne forhindre stamcelle udvækst. Selv om det er vigtigt ikke at skille explanterne, når de er belagt, omhyggelig vask af pladerne med PBS/gentamicin er afgørende for at reducere kontaminering. Høstede myoblaster kan fryses som P2-celler i cryovials ved hjælp af en 10% DMSO/90% Myoblast-medie blanding. Mens myoblaster ikke behøver at blive vedligeholdt ved en høj densitet for at fremme vækst, tilrådes det, at cellerne fryses ved 40-50% sammenløbet. Typisk, en T75 kolbe udbytter 4 kryovialer af celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelig for Dr. Matthew watt på University of Melbourne og Dr. Anastasia Kralli på Johns Hopkins University for at hjælpe med at vedtage denne protokol baseret på arbejdet i Mokbel et al.6. Vi takker også Dr. Sabine Jordan for hjælp til at udvikle og vedtage denne protokol i vores laboratorium. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health R01s DK097164 og DK112927 at K.A.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15 mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
