Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu

Published: December 3, 2019 doi: 10.3791/60315
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

Summary

Burada insanlaşmış farelerde HIV enfeksiyonu dinamikleri incelenmesi için üç deneysel yaklaşımlar açıklanmıştır. İlk ivedi kronik enfeksiyon olaylarının incelenmesine izin vererken, ikincisi primer enfeksiyon veya viral reaktivasyon sonrası akut olayların incelenmesine izin verir.

Abstract

Humanized NOD/SCID/IL-2 reseptör γ-chainnull fareler bulaşıcı hastalıklar üzerinde temel ve klinik öncesi araştırmalarda yararlanılabilir insan bağışıklığı, bazı özellikleri recapitulate. Burada açıklanan HIV enfeksiyonu dinamikleri incelemek için insanlaşmış immüneksik farelerin üç modeli vardır. Bunlardan ilki, yeni doğan farelerde CD34+ hematopoetik kök hücrelerin intrahepatik enjeksiyonuna dayanır, bu da birkaç kan ve lenfoid doku ile sınırlı hücrelerin yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar ve bunu referans HIV türü ile enfeksiyon takip eder. Bu model enfeksiyon sonrası 36 haftaya kadar izlenmesine olanak sağlar ve bu nedenle kronik model olarak adlandırılır. İkinci ve üçüncü modeller, periferik kan mononükleer hücrelerinin erişkin farelere intraperitoneal enjekte edildiği akut ve reaktivasyon modelleri olarak adlandırılır. Akut modelde, sağlıklı bir donörden hücreler intraperitoneal yol ile engrafted, bir referans HIV suşu ile enfeksiyon takip. Son olarak, reaktivasyon modelinde, antiretroviral tedavi altında HIV ile enfekte donör hücreleri intraperitoneal rota ile engrafted. Bu durumda, fare bir ilaç içermeyen ortam virüs reaktivasyonu ve viral yük artışı sağlar. Burada sağlanan protokoller HIV enfeksiyonu insanlaşmış, immüneksik fare modelleri için geleneksel deneysel yaklaşım açıklar.

Introduction

Humanized NOD / SCID / interlökin (IL)-2 reseptör γ-chainnull (bundan böyle huNS γ-chainnullolarak anılacaktır) fare modeli yaygın enfeksiyonların patogenezi incelemek için kullanılmıştır, otoimmünite, ve kanser, yanı sıra ilaçların ve insan hücre tabanlı tedavilerin pre-klinik çalışmalar için1,2. Bu fareler, il-2 reseptör γ-chain locus (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 ve IL-21 için ortak γ-chain) scid mutasyon ve hedeflenen mutasyon ile, obez olmayan bir diyabetik (NOD) arka plan dayanmaktadır, hangi fare T-, B-ve doğal katil gelişiminde ciddi bir bozulmaya neden (NK) hücreleri1. Böylece, insan dokusunun engraftment destek, insan CD34+ hematopoetik kök hücreler (HSCs), ve insan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs)3,4,5. Buna ek olarak, kök hücre faktörü (SCF), granülosit/ makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve IL-3 gibi insan hematopoetik faktörlerin transgenik ekspresyonu6,7,8.

HIV çalışmaları için, fare suş farklı birkaç huNS γ-zincirnull fare modelleri, tanımlanmıştır, kullanılan insan hücrelerinin türü, engraftment için dokuların türü, ve hücrelerin kökeni (yani, sağlıklı vs. HIV bulaşmış donör)9,10. Orijinal suşu, ancak, yaygın bir referans HIV suş11,12,13ile enfeksiyon aşağıdaki insan hücrelerinin engraftment ve viral çoğaltma yüksek düzeyde nedeniyle kullanılır. İnsan hematopoetik faktörlerinin transgenik ekspresyonu ile benzer immünoyfik fare suşları (örn. NOG-EXL veya NSG-SGM3) veya insan karaciğeri ve timus dokularının implantları ile (kemik iliği-karaciğer-timus [BLT] fareler) anti-HIV bağışıklık yanıtı miyeloid popülasyonların rolünü değerlendirmek için yararlıdır, bu dokular üzerinde HIV etkileri, ve viral rezervuarlar olarak katılım14,15. Ayrıca, insan lökosit antijen (HLA) moleküllerinin transgenik ekspresyonu ile bazı suşları, yanı sıra BLT fareler, HIV enfeksiyonu16,17T-hücre yanıtı çalışması için kullanılabilir.

Genel olarak, bu farelerde, insanlaşma hücresel kökenli bağlıdır, doğum güzergahı (intraperitoneal, intrahepatik, intravenöz, intrakardiyak) ve engraftment anda fare yaşı18,19,20. Hücre kökeni ile ilgili olarak, insan CD34+ HSC kordon kanı, fetal karaciğer, ya da seferber periferik kan elde edilen yenidoğan veya gençfarelerdeenjekte edilebilir 3,21. Buna ek olarak, yetişkin γ-zincirnull fareler PBMC enjeksiyonu ile insancıl olabilir (burada, hu-PBL-NS γ-zincirnull fareler olarak anılacaktır), kanda bu hücrelerin zamansal dolaşımını sağlayan, ikincil lenfoid organlar, ve iltihaplı dokular22,23,24.

Burada açıklanan HIV enfeksiyonu çalışması için huNS γ-chainnull fare modelleri kurulması için ayrıntılı bir protokoldür. Bunlardan ilki, sağlıklı bir donörden kordon kanından elde edilen insan CD34+ HSC'lerinin yeni doğan farelere enjekte edildiği, ardından 14 haftalık insan bağışıklık sisteminin yeniden yapılandırılmasından sonra referans HIV türü ile enfeksiyon kapıldığı kronik modeldir. Bu model, farelerin enfeksiyondan sonra ~36 haftaya kadar izlenmesini sağlar. İkinci model akut bir modeldir, hangi PBMCs sağlıklı bir donör elde yetişkin NS γ-chainnull fareler enjekte edilir, fare insan T-hücre genişleme 3 hafta sonra bir referans HIV suşu ile enfeksiyon takip. Son olarak, üçüncü model reaktivasyon modeli, hangi PBMCs baskılayıcı antiretroviral tedavi altında HIV enfekte donör türetilen (ART) yetişkin NS γ-chainnull fareler enjekte edilir. Bu durumda, ilaçsız bir ortam viral reaktivasyon ve viral yük artışı sağlar. İki ikinci model engraftment sonra ~ 9 hafta ya kadar izleme sağlar.

Genel olarak, bu üç model virolojik çalışmalar, yeni ilaçların klinik öncesi çalışmalar ve küresel bağışıklık yanıtı hiv enfeksiyonu etkilerinin değerlendirilmesi için yararlıdır. Ayrıca, HIV'li insanlaşmış farelerin kullanımının herhangi bir deneyden önce Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmesi ve onaylanması gerektiğini de göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu, çalışmanın tehlikeli biyolojik maddelerin kullanımı ve deneysel hayvanların insancıl kullanımı için tüm iç ve dış kurumsal düzenlemeleri takip etmesini sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada, Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokollere göre tüm hayvan bakımı ve prosedürleri gerçekleştirilmiştir (protokol numaraları 1018017, 1018018 ve 0318009).

1. İnsan CD34+ HSC yenidoğan farelerin engraftment

  1. Steril önlükler, eldivenler, özel ayakkabılar, ayakkabı kılıfları, maske, gözlük, saç/sakal kaputu ve steril laboratuvar önlükleri dahil olmak üzere her zaman tek kullanımlık kişisel koruma ekipmanı (PPE) kullanın.
  2. 1x 106 dondurulmuş CD34+ HSC'yi (malzeme tablosunabakınız) 10 mL RPMI 1640 ortam %10 FBS'yi sertifikalı bir biyogüvenlik kabini altında yeniden askıya alın ve steril koşulları koruyun.
  3. Bir hemositometrede trypan mavisi dışlama boyama ile hücre canlılığını kontrol etmek için (beklenen sayıda hücrenin varlığını sağlamak için) 10 μL süspansiyon kullanın.
  4. Oda sıcaklığında (RT) 15 dakika 400 x g santrifüj. Supernatant atın ve soğuk 1x PBS resuspend gerekli konsantrasyon (1.4 x 105 CD34+ HSCs 50 μL). İğne yenene kadar hücreleri buzda tutun.
  5. Yavruları (1-4 günlük her iki cinsiyetten ns γ-chainnull yavruları) steril 100 mm2 Petri kabına ve yetiştirici kafesinden az miktarda yatak malzemesine yerleştirin. Ayrıca, alıcı yavrular üzerinde herhangi bir yabancı kokuları daha fazla maskelemek için eller arasında temiz yatak ovmak.
    NOT: Bu durum, yavrulara emprenye edilen yabancı kokuları en aza indirir ve böylece annelerin doğumdan sonra yavrularını kafeslere geri kabul etme şansını artırır.
  6. Petri kabını temiz bir taşıma kafesine koyun ve yavruları çevreden korumak için kafesi temiz bir fare mikroizolatör kafesine yerleştirin. Işınlama odasına geçerken hayvanların dış ışığa maruz kalmasını önlemek için taşıma kafesini bir kapak pedi ile kapatın.
  7. 137 Cs kaynağına maruz kalarak 100 cGy tüm vücut ışınlaması (WBI) ile yavruları ışınla. Işınlayıcının içini dezenfektan solüsyonuyla temizleyin, fareleri ışınlayıcıya yerleştirin ve tüm yavruların homojen bir şekilde ışınlanması için pikap'ı açın. Işınlama işlemini başlatmak için ışınlayıcıyı kapatın ve güç düğmesine basın. Işınlama süresi tamamlanana kadar bekleyin ve hemen fareleri çıkarın.
    NOT: Işınlama farelerde stres oluşturmadığından, önceki anestezi gerekli değildir.
  8. 2-4 saat ışınlama işleminden sonra, soğuk steril Petri çanak buz üzerinde steril gazlı bez ile kaplı bir biyogüvenlik kabine yavrusu yerleştirin, anestezi kadar (~ 5-10 dk). Brüt hareketler sona erdiğinde yeterli anestezi sağlanır.
  9. Şırıngayı, hücre süspansiyonunun 50 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 0000 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000
  10. Hepatik enjeksiyon yoluyla engraftment için, başparmak ve işaret parmakları ile yavru dizginlemek. Fare kısıtlamasını en aza indirmek için (~30-45 s), bir araştırmacının yavruyu tutmasına ve enjeksiyonu yönetmesine izin verin ve ikinci araştırmacının şırıngayı HSC süspansiyonuyla yüklemesini bekleyin. Enjeksiyon bölgesini %70 alkolle temizleyin ve 50°L'lik hücreleri doğrudan karaciğere ulaştırın. Tamamen karaciğer piercing önlemek için enjekte ederken sığ bir iğne açısı kullanın. Kontrol olarak, farelere karaciğere 50 μL 1x PBS enjekte edin.
  11. Kurtarma sağlamak için 1-5 dakika steril gazlı bez ile kaplı önceden ısıtılmış steril Petri çanak üzerinde yavru yerleştirin. Yavruların aşırı ısınmamasını sağlamak için 20 °C'de kemirgenler için kızılötesi ısıtma yastığı kullanarak yemeği önceden ısıtın.
  12. Yavruları ebeveynlerine geri vermeden hemen önce, yamyamlık tan kaçınmak veya yavruları reddetmek için başparmak ve işaret parmaklarını kullanarak küçük miktarda mentol ve okaliptüs bazlı merhem uygulayın.
  13. Kuru cilt, beslenme, döküntü ve alopesi gibi yavrularda greft-versus-host hastalığı (GVHD) herhangi bir belirti arıyor, her gün kafesleri kontrol edin. Bu belirtilerden herhangi biri görülürse hayvanları ötenazi.
  14. 3 haftalık wean fareleri cinsiyetlerine göre gruplatmalı. Kafes başına 5'ten fazla hayvan koymayın. 14 haftalıkken kan sitometrisi ile periferik kanda engreftlemayı doğrulayın.
    NOT: Engraftment başarı oranı% 80-100 arasındadır.

2. Juvenil farelerin Insan PBMC engraftment

  1. Akut ve reaktivasyon modelleri için, 6-8 haftalık NS γ-chainnull fareleri, sırasıyla ART altında bulunan sağlıklı bir donör veya HIV enfekte olan hastadan elde edilen insan PBMC'leri ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Her iki modelde de, kontrol olarak HIV enfeksiyonu (sham) olmayan sağlıklı bir donörden PBMC enjekte fareler içerir.
  2. 50 mL konik tüp içine steril yoğunluk gradyan ortamda 5 mL tam kan Tabakası 15 mL.
  3. 400 x g'da 30 dakika boyunca RT'de frensiz, buffy paltonun yoğunluk gradyan ortamıyla karışmasını önleyin.
  4. Mononükleer hücrelerin fraksiyonunu dikkatlice toplayın (yoğunluk gradyan orta ve süpernatant arasında) ve buffy kat 10 mL 1x PBS içeren 15 mL santrifüj tüp aktarın. RT'de 10 dk için 300 x g'da santrifüj.
  5. Supernatant atın ve peletli hücrelere eklenen ACK tampon 5 mL ile lysing tarafından kalan kırmızı kan hücrelerini çıkarın. RT'de 4 dakika kuluçka.
  6. RT'de 10 dk için 300 x g'de santrifüj. 1x PBS veya RPMI 1640 orta 10 mL'de süpernatant'ı atın ve yeniden askıya alın.
  7. Hücreleri saymak ve hemositometrede mavi dışlama boyama ile canlılığı kontrol etmek için hücre süspansiyonunun 10 μL'sini kullanın. Tipik olarak, 1-2 x 106 hücre kan her 1 mL için elde edilir, fazla 95% canlılık ile.
  8. RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj atın ve hücre numarasını istenilen konsantrasyona ayarlayın (bu durumda, 200 μL 1x PBS'de 3,5 x 106 hücre).
  9. Şırıngayı, sertifikalı bir biyogüvenlik kabini altında 200 μL 1x PBS'de 3,5 x 106 pbmc'ye bağlı bir iğneyle (28 G, 0,5") yükleyin.
  10. Fareyi kafesten çıkarın ve arka arkaya hafif çekiş uygulayarak kafesi tutabilmesi için kuyruğundan tutun. Daha sonra, boynun gevşek deri kapma ve sırtını stabilize etmek için orta parmak kullanarak, hayvanın omuzlarında indeks ve başparmak parmakları yerleştirin.
  11. Fare başını geriye doğru kaydırın, böylece sırtı başının üzerindedir. Bu karın boşluğunda vissera geriye doğru yerinden olmasını sağlar ve enjeksiyon sırasında iç organları delme riskini azaltır.
  12. Enjeksiyon bölgesini %70 alkolle temizleyin.
  13. Adım 2.9'da kullanılan şırıngaya karın duvarından nüfuz edin ve hücrelere enjekte etmeden önce aspire edin, eğer herhangi bir madde aspire edilirse, şırıngayı çıkarın ve atın. Aksi takdirde, intraperitoneal kavite yavaş yavaş hücreleri enjekte, şırınga çıkarın ve atın. Fareleri kontrol etmek için 1x PBS enjekte edin.
  14. Hayvanı kafesine geri getir.
  15. Enjeksiyon dan sonra 3 hafta da akış sitometrisi ile periferik kanda engreftment doğrulayın.

3. Engraftment sonrası bakım

  1. Fareleri kulak etiketleme ile tanımlayın.
  2. Bu deneylerde kullanılan fareleri klinik sıkıntı belirtileri için her işlemden sonra günde 2 x yakından gözlemleyin.
  3. İnsan hücrelerinin naklinden sonra, GVHD için fareleri izleyin. Yenidoğan, çocuk ve erişkin farelerde GVHD semptomlarını izlemek için, vücut ağırlığı ölçümüne ek olarak, hayvanları deri hastalığının (yani renk, kuruluk, döküntü, alopesi) görünümü ne olursa olsun değerlendirin. Erken ötenazi yi göz önünde bulundurarak bir veteriner tarafından bu belirtileri gösteren hayvanları değerlendirin.

4. HIV enfeksiyonu prosedürü ve sahte enfeksiyon prosedürü

NOT: Kronik ve akut modellerde farelere sırasıyla 14. HIV enjeksiyonları alt karın kadranda intraperitoneally uygulanır.

  1. ABSL2 prosedürlerini takiben BSL2 dolaplarında 28 G 0.5" iğne kullanarak virüsün/PBS'nin şırıngalara yükleme işlemini gerçekleştirin. Enjekte edilen toplam virüs miktarı 15.000 ortanca doku kültürü enfeksiyöz dozudur (TCID50) 200 μL steril RPMI 1640'tadır.
  2. Fareyi kafesten çıkarın ve arka arkaya hafif çekiş uygulayarak kafesi tutabilmesi için kuyruğundan tutun. Daha sonra, işaret parmağı ve başparmak hayvanın omuzlarında yerleştirin, boyun gevşek deri kapma ve geri stabilize etmek için orta parmak kullanarak.
  3. Fare başını geriye doğru kaydırın, böylece sırtı başının üstünde olacak şekilde. Bu karın boşluğunda vissera geriye doğru yerinden sağlar ve enjeksiyon sırasında iç organları delinme riskini azaltır.
  4. Fareleri karın alt sol/sağ kadranında önceden ıslak bir alkol yastığı yla temizleyin. 200 μL steril RPMI 1640'ta bulunan HIV BaL virüsünün 15.000 TCID 50'sini enjekte edin.
  5. Enjeksiyondan sonra fareyi kafesine geri getirin.

5. Retroorbital delinme ile kan toplanması

NOT: Retroorbital kanama kan hızlı toplanması için izin verir, böylece genel toplama süresini azaltarak ve insan lenfosit belirteçleri istikrarını artırarak. Farelerkan toplamak için EDTA tüpleri kullanın.

  1. Kronik modelde, 14 hafta sonrası HSC enjeksiyonu, retroorbital ven yoluyla kan toplamak. Akut ve reaktivasyon modellerinde pbmc enjeksiyonu sonrası 3 hafta bu işlemi gerçekleştirin.
  2. Dıştan kanalize bir biyogüvenlik başlık sınıf B2 kan toplama dan önce isofluran inhalasyon 250 μL kullanarak hayvanları anestezik.
  3. Isoflurane'yi, binanın dışında havalandırmalı bir biyogüvenlik kabininde 1 L'lik berrak bir kavanozda bir tel örgü altında pamuk pedlere dağıtın. Mesh kullanımı hayvanların isoflurane-ıslatılmış ped temas değil sağlar, hangi isoflurane de deri yoluyla emilir beri cilt tahrişi ve potansiyel aşırı dosing neden olabilir. Ayrıca, bacaklar yaralanmaları önlemek için mesh ve hayvan arasında yumuşak bir kağıt havlu koyun.
  4. Kavanoz isoflurane ile doyuncaya (ekledikten yaklaşık 1 dk sonra), hayvanı tanıtın ve solunum hızını gözlemleyin, bu da daha sonra azalacak. Bir düzeltme refleks eksikliği içeren anestezi derin bir düzlem, klinik endikasyonu kontrol edin (yavaşça kavanoz devrilme üzerine) ve brüt hareketlerin eksikliği. Hayvan tamamen rahat ve ayak ucur refleks yoksun en kısa sürede kanama prosedürü başlatın.
    NOT: Isofluran buharlaştığıiçin anestezi bulgusu yoksa daha fazla ilaç dağıtın.
  5. Retroorbital kanama için, fare dış juguler ven kaudal başparmak ile mandibula basın ve aynı el ile, yavaşça işaret parmağı ile üst göz kapağı nı yükseltmek.
  6. Gözün medial kanthus içine bir hematokrit tüp yerleştirin ve kan akı başlayana kadar ventrolateral yönde yönlendirin.
  7. En az 100 μL kan toplayın. İstenilen kan hacmi elde edildikten sonra (hayvanın vücut ağırlığının %1'inden fazla olmayan bir hacim), dış juguler basıncı durdurun ve hematokrit tüpünü çıkarın.
  8. Hemostazın en az 30 s steril gazlı bez kullanarak göze doğrudan basınç uygulayarak tamamlandığından emin olun.
  9. Göze tetrakain damlaları uygulayın. Anesteziden tamamen iyileşene kadar hayvanı izleyin ve kafese geri yerleştirin.
    NOT: Toplanan kanın 100 μL'si insan CD45+ ve diğer kan hücresi popülasyonlarının engreftasyon düzeyinin değerlendirilmesi ve plazma viral yükünün değerlendirilmesi için kullanılır.

6. Engreftment düzeyi ve akış sitometri analizinin taranması

  1. Tam kan için geleneksel bir akış sitometri boyama protokolü izleyin, hangi florokrom etiketli anti-insan antikorların kuluçka içerir (önerilen akış paneli için, Malzemeler Tablosubakınız ), kırmızı kan hücrelerinin lysis takip ve yıkama adımları13,15.
    NOT: Engraftment düzeyinin taranması için, bir anti-insan CD45 antikor içerir. Karşılaştırma için, bir anti-fare CD45 antikor da kullanılabilir. Reaktiflerin çapraz reaktivitesini test etmek için telafi kontrollerinin yanı sıra aynı antikor karışımı, lekesiz fare ve insan kanı örnekleri ve insansız kontrol ile boyanmış bir insan kanı örneği de dahil. Boyama sonra, her zaman bazı arka plan sinyali vardır; ancak, tüm olumlu sinyaller açıkça negatif ve çapraz reaktif kontrollerden ayırt edilir.
  2. Uygun bir akış sitometresinde, lenfosit kapısında en az 10.000 olay elde edin (FSC-A vs. SSC-A). Akış sitometrisi analizi için, yinelenen dışlama dan sonra, insan CD45+ hücrelerinin yanı sıra ilgi diğer hücre popülasyonlarının yüzdesini belirleyin.

7. Plazma viral yükünün değerlendirilmesi

  1. Hiv enfekte hayvanlarda viral yük değerlendirmek 1x enfeksiyon dan sonra haftada.
  2. Retroorbital kanamadan sonra (yaklaşık 100 μL), antikoagüle kanın 3.500 x g'de mikrosentrifuge 3 dk'da santrifüjden sonra süpernatantı toplayarak plazma elde edin. Pelet kan hücresi fenotipleme için kullanılır.
  3. 40 μL plazmadan RNA elde etmek için ticari bir viral RNA ekstraksiyon kiti (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
  4. RNA'yı ilk gerinim sentezi karışımını (Bkz. Malzeme Tablosu)ve HIV gag astarı SK431 kullanarak cDNA'ya dönüştürün.
  5. Önceki çalışmalarda açıklandığı gibi HIV Gag astarSK 38/SK39 ve floresan yeşil boyalar (örneğin, SYBR yeşil) kullanarak kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin13,25.

8. Antiretroviral tedavinin uygulanması

  1. Kronik, akut ve reaktivasyon modellerinde, yüksek viral yük gözlendiğinde, enfeksiyondan en az 3 hafta sonra oral ART uygulayın.
  2. Tenofovir disoproksil fumarate (TDF), emtricitabine (FTC) ve raltegravir (RAL) dozlarını, insanlar ve fareler için 37 ve 3 km değerlerine göre hesaplayın, sırasıyla26. Tipik olarak, TDF, FTC ve RAL'nin insana eşdeğer dozları sırasıyla 61.7 mg/kg/gün, 40.7 mg/kg/gün ve 164 mg/kg/gün'tür.
  3. İçme suyunda uygulama için, ilaç tabletleri ezmek ve kafesher fare günlük doz elde sağlanması, su şişesine ilgili miktarda ekleyin. İlaç tozu şişede tortu oluşturabileceğinden, homojen süspansiyon elde etmek için su şişesini periyodik olarak sallayın.
  4. Taze çözünmüş ilaçlar ile her hafta su şişesini değiştirin.
  5. Viral yük ve CD4:CD8 oranındaki değişiklikleri değerlendirmek için ART inisiyasyonundan sonra her hafta veya 2 haftada bir retroorbital ven yoluyla kan toplayın.

9. Fare ötenazisi, sekonder lenfoid organların toplanması ve mononükleer hücrelerin izolasyonu

  1. Ötenazi üç insanlaşmış fare modelinde, periyodik olarak enfeksiyon süresi boyunca veya deneyin sonunda yapılır.
  2. Yetişkin farelerin ötanazisini CO2 boğulması ile gerçekleştirin, ardından servikal çıkığı. Boğulma için önceden şarjlı olmayan bir oda kullanın, sabit basınç regülatörlü ticari bir silindirden CO2 dağıtın ve 2013 AVMA yönergelerine uymak için oda hacminin /dakikanın %20-30'u içinde gaz akışını kontrol eden çizgi kısıtlayıcı.
  3. >60 s izleme solunum durması için CO2 akışını koruyun (5 dakika kadar sürebilir), ötanazi sağlamak için servikal dislokasyon takip.
  4. Ötenazi neonates <7 gün fiziksel bir yöntemle eski (yani, keskin makas kullanarak).
  5. Aksiller, mediastinal ve mezenterik lenf düğümlerini (tipik olarak gözlenen) görselleştirin ve cımbız ve keskin makasile ayıklayın. Ayrıca, periton boşluğunun sol üst tarafında bulunan dalak ayıklayın.
  6. Lenfoid dokuları steril RPMI 1640 orta içeren 1,5 mL santrifüj tüplerinde tevdi edin.
  7. Lenfoid dokuları hemen 70 mm'lik gözenek büyüklüğünde bir naylon hücresüzde işleyebilir ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Dokuları aspire etmeyin.
  8. Hücreleri filtreleyi kolaylaştırmak için hücreleri %1 FBS ile takviye edilmiş 5 mL RPMI 1640 orta ile yıkayın.
  9. Doku ayrıştırma sonra, bir mikrosantrifüj 10 dakika için 3.500 x g hücreleri süspansiyon santrifüj.
  10. Supernatant atın ve 1x PBS 500 μL ile hücreleri yeniden askıya.
  11. Hücreleri süspansiyonu 500 μL steril yoğunluk gradyan ortam içeren 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  12. 3 dk'da 3500 x g'lık santrifüj, frensiz, buffy paltosunun yoğunluk gradyan orta sıyla karışmasını önlemek için
  13. Mononükleer hücrelerin fraksiyonunu dikkatlice toplayın (yoğunluk gradyan orta ve süpernatant arasında) ve buffy katını 500 μL 1x PBS içeren 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın. 3 dk için 3000 x g santrifüj.
  14. Kalan kırmızı kan hücrelerini 500 μL ACK tamponu ile lysing, RT 4 dakika kuluçka ile çıkarın.
  15. 3 dk. 3 dk. için 3.000 x g santrifüj supernatant atın ve 1 mL 1x PBS veya orta resuspend.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda açıklandığı gibi, 14 hafta post-HSC enjeksiyon (kronik model) veya 3 hafta post-PBMC enjeksiyon (akut ve reaktivasyon modelleri), fareler akış sitometri ile insan hücrelerinin engraftment düzeyini taramalar için kanayan vardır. 1) insan CD45+ hücrelerin yeniden yapılandırılması ve 2) CD4+ ve CD8+ T-hücrelerinin yüzdesi için temsili bir gating stratejisi Şekil 1A'dagösterilmiştir. Tipik olarak, engraftment düzeyi (insan CD45yüzdesi + hücrelerin) CD34+ HSC enjeksiyonsonra% 10-80 arasında değişir ve enjeksiyon ve fare zorlanma güzergahına bağlıdır, diğer önceden tanımlanmış faktörler arasında(Şekil 1B). PBMC enjeksiyonundan sonra engreftleme düzeyi (insan CD45+ veya CD3+ hücrelerinin yüzdesi) %5-%65 arasında değişmekte olup fare suşları arasındaki farklar da vardır(Şekil 1B). Buna ek olarak, pbmc enjekte fareler arasında bazı farklılıklar sağlıklı karşı HIV enfekte donör elde edilen, görülebilir (Şekil 1D). Genellikle, HIV enfeksiyonu için, engraftment düzeyleri 5%-10% üzerinde aktif viral çoğaltma için yeterlidir.

Daha da önemlisi, hu-PBL-NS γ-chainnull fare modellerinin bir özelliği, hücre engreftlemekten sonra birkaç hafta içinde ksenojenejik GVHD'nin geliştirilmesidir, çünkü insan T-hücre tanıması sayesinde murinmaj histokompatibilite kompleksi (MHC) molekülleri23. Bu süreç, saç ve kilo kaybı gibi belirtiler(Şekil 2A,B)gibi belirtilerin yanı sıra HLA-DR ve CD38 gibi T-hücrelerinde aktivasyon belirteçlerinin artan ekspresyonu ile pbmc sonrası enjeksiyondan 3 hafta sonra bile belirgindir (Şekil 2C,D). Öte yandan, GVHD daha yavaş fareler de insan CD34+ HSC enjekte gelişmiş ve doğrudan engraftment ilk düzeyi ile ilişkilidir.

HIV enfeksiyonundan sonra, plazma viral yükünde hızlı bir artış vardır, genellikle 2-3 hafta sonrası enfeksiyon sonrası saptanabilen, hem kronik hem de akut modellerde(Şekil 3A,B),reaktivasyon modelinde benzer kinetikler vardır (Şekil 3C). Viral yükteki artış CD4:CD8 oranındaki düşüşle çakışıyor (Şekil 3D,E,F). Bu değişiklikler kontrol farelerinde gözlenmez (HIV enfeksiyonu olmadan, Şekil 3). Hu-PBL-NS γ-chainnull mouse modelinde, CD4:CD8 oranının ilk ters çevrilme oranı gözlemlenebilir ve izleme süresi boyunca yeniden oluşturulabilir (Şekil 3E,F). Son olarak, ART HIV ile enfekte farelere uygulanırsa, cd4:CD8 oranında viral yükün bastırılması ve iyileşmenin, enfekte olmayan kontrollerdekilere benzer seviyelere ulaşması beklenmektedir(Şekil 3A,C,D,F). Tipik olarak, tedavinin 2-3 hafta sonra, viral yük bir azalma ve CD4:CD8 oranında artış kronik gözlenir, akut, ve reaktivasyon modelleri. Bu gözlenmezise, ilaç dozları ve uygulama nın yolu bir değerlendirmeye ihtiyaç duyar.

Figure 1
Şekil 1: İnsan CD45+ ve T-hücrelerinin engreftasyon düzeylerinin değerlendirilmesi için temsili gating stratejisi. (A) Insan CD45 + (huCD45), CD3 + , CD4+, ve CD8+T-hücreleri huNS γ-zincirnull fareler, hafta 14 kordon kanı CD34 + HSCs ile enjeksiyon aşağıdaki yüzde tarama için kullanılan Gating stratejisi. Sayılar her popülasyonun yüzdesini gösterir. (B) HuNS γ-chainnull (n = 6) ve IL-3 ve GM-CSF (huNOG-EXL, n = 6) transgenik ekspresyonu ile benzer bir immünoeksik zorlanma engreftleme (huCD45 + hücrelerin yüzdesi) temsili düzeyleri (huCD45+ hücrelerin yüzdesi) daha önce bildirildiği gibi15. (C) Hu-PBL-NS γ-chainnull ve hu-PBL-SGM3 farelerinde (Sırasıyla SCF, GM-CSF ve IL-3 transgenik ekspresyonu olan NS γ-chainnull fareler) engreftleme (huCD3+ hücrelerin yüzdesi) temsili düzeyleri, sağlıklı bir donörden (akut model, n = 7 ve n = 8) pbmcs enjeksiyonu takip eden 3. (D) Art altında olan sağlıklı veya HIV ile enfekte bir hastadan (sırasıyla n = 10 ve n = 12) PBMCs ile enjeksiyon dan sonra hu-PBL-NSG-SGM3 farelerde engraftment (huCD3+ hücrelerin yüzdesi) temsilcisi düzeyleri. B-D'de çizgi ortancayı gösterir ve Mann-Whitney testinin p değeri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Hu-PBL-NS γ-chainnull mouse modelinde GVHD gelişimi. (A) Sağlıklı bir donörden PBMC ile enjeksiyonu takip eden 7. (B) Fare vücut kilo kaybı izleme süresi boyunca sağlıklı bir donörden (n = 10) pbmc enjekte edilen hu-PBL-NSG-SGM3 farelerinde başlangıç ağırlığının yüzdesi (n = 10) ve HIV'li hastaya (n = 12) normalleştirilmiştir. (C) Cd4+ ve CD8+ CD8 + T-hücreleri hla-DR ve CD38 hafta 7 post-engraftment temsili ifade hu-PBL-NSG-SGM3 fareler sağlıklı bir donör pbmcs ile enjekte. Sayılar her popülasyonun yüzdesini gösterir. (D) Sağlıklı bir donörden PBMC enjekte edilen hla-DR + CD38+ hu-PBL-NSG-SGM3 farelerinde bulunan CD4+ ve CD8+ T-hücrelerinin temsili yüzdeleri. Dikkat, fareler içine enjeksiyon öncesi hücrelerde, HLA-DR+ CD38+ CD4+ ve CD8+ T-hücreleri düzeyleri sırasıyla% 2.0 ve% 5.7 idi. B ve D'de ortanca ve interquartile aralığı gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: HIV enfeksiyonu sonrası ve ART girişinden sonra huNS γ-chainnull farelerde viral yük ve CD4:CD8 oranının temsili değişiklikleri. (A, D) CD4:CD8 oranı ve hiv BaL enfeksiyonu sonrası huNS γ-zincirnull farelerde plazma viral yük (kırmızı nokta ve çizgi, n = 3), kordon kanı CD34+ HSCd. Enfekte olmayan kontroller (PBS-enjekte) ile enjeksiyon hafta 14 sonra yapıldı (yeşil nokta ve çizgi, n = 5). (B, E) Hiv BaL (kırmızı nokta ve çizgi, n = 4) ile enfeksiyon sonrası hu-PBL-NSG-SGM3 farelerde plazma viral yük ve CD4:CD8 oranı, sağlıklı bir donörden PBMC ile enjeksiyondan sonra 3. Enfekte olmayan kontroller (PBS enjekte) de dahil edildi (yeşil nokta ve çizgi, n = 3). (C ve F) Plazma viral yük ve CD4:CD8 oranı hu-PBL-NSG-SGM3 fareler bir HIV enfekte donör (kırmızı nokta ve çizgi, n = 9) veya sağlıklı donör (yeşil nokta ve çizgi, n = 10) (reaktivasyon modeli) PBMCs ile enjekte fareler. Her durumda, ortanca ve interquartile aralığı gösterilir. A-C'de kesik çizgi, tişin (150 kopya/mL) algı sınırını gösterir. Tespit edilemeyen viral yükü olan numunelere, algılama sınırının yarısına eşit bir değer atandı. D-F'de kesik çizgi 1 CD4:CD8 oranını gösterir. A, C, D ve F'de gri kutu ART'ın yönetimiyle olan zamanı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsanlaşma için immünoeksik fare suşlarının geliştirilmesinde önemli ilerlemeler sağlanmıştır, araştırma ilgi1göre kullanılabilecek farklı seçenekler bir dizi ile. Burada ns γ-zincirnull fareler ve genetik olarak benzer suşları HIV enfeksiyonu eğitimi için üç farklı modelde istihdam edilecek insanlaşma için genel bir protokol sağlanan. İlk deneysel yaklaşımda, ışınlanmış yenidoğan fareler insan CD34ile enjekte edilir + HSCs, hangi kordon kanı elde edilebilir, fetal karaciğer, ya da seferber periferik kan3,21. NS γ-chainnull farelerin uygun ışınlanması kritik bir adımdır, çünkü fare kemik iliği ve diğer ata hücrelerini ortadan kaldırarak insan hücre popülasyonlarının verimli bir şekilde yeniden yapılandırılabilmesini sağlar. Ancak, bazı raporlar farklı fare suşları insan hücrelerinin yeniden yapılanma kanıtlamış, ışınlama olmadan27. Bu bağlamda, NS γ-chainnull fareler radyosensital olduğundan ve yüksek γ-ışınlama timik lenfomagenezi neden olabilir,28,ışınlama uygun dozlarda sağlanmalıdır.

Engreftment düzeyini etkileyebilecek diğer kritik adımlar ve faktörler enjeksiyon rotası (intrahepatik, intravenöz, intrakardiyak), fare yaşı, CD34+ HSC saflık yüzdesi ve operatör uzmanlığı29içerir. Hu-PBL-NS γ-chainnull mouse modellerine dayanan ikinci ve üçüncü yaklaşımlarda, bazı kritik faktörler enjeksiyon rotası (intraperitoneal, intravenöz, intrasplenik), fare yaşı ve enjekte edilen insan hücrelerinin sayısı, engraftment son düzeyini etkileyebilir içerir. Bu ikinci faktör ile ilgili olarak, çeşitli çalışmalar da engraftment 22 için 5-10 x 106 PBMCs kullanmış22,23,30, mevcut protokol 3.5 x 106 PBMCs kullanımını göstermektedir. Dikkat dikkat, hücrelerin bu sayıda T-hücrelerinin yeniden yapılandırılması ve HIV replikasyonu için yeterli, akut ve reaktivasyon modellerinde hem de, ve aynı zamanda GVHD gelişimini geciktirir23. Yine de, araştırmacılar araştırma hedeflerine göre insanlaşma koşullarını optimize etmelidir. Ayrıca, huNS γ-chainnull farelerin enfeksiyonu için kullanılan HIV türünü doğrulamak önemlidir. Burada, R5 tropik HIV-1 BaL suşu kullanılır, hangi huNS γ-zincirnull farelerde viral çoğaltma yüksek düzeyde verimleri. Luciferase veya floresan proteinler içerenler gibi diğer muhabir suşları da HIV ile enfekte hücrelerin tek hücreli analizi için uygundur31.

Genel olarak, CD34+ HSC ile engraftment aşağıdaki huNS γ-zincirnull fare modellerinde üç büyük sınırlamalar kanıtlanmaktadır. İlk olarak, bir insan timik ortamın yokluğu nedeniyle, T-hücreleri murine MHC molekülleri bağlamında eğitimli, onların T-hücre reseptörleri aracılığıyla sonraki antijen özgü stimülasyon kısıtlama. Bu sorun, HIV'e özgü T hücre yanıtını incelemek için NS γ zincirinull fare modellerinin kullanımını sınırlar. Bununla birlikte, bu sınırlama BLT fareler veya HLA moleküllerinin transgenik ekspresyonu ile NS γ-zincirnull farelerin kullanımı ile aşılabilir16,17. İkinci olarak, tipik olarak NS γ-chainnull fare modellerinde miyeloid popülasyonların kötü yeniden yapılandırılması vardır, antijen sunumu ve HIV enfeksiyonu patogenezi bağlamında alaka var bu alt kümelerin çalışma sınırlayan14,15. Bu durumda hematopoetik faktörlerin transgenik ekspresyonu ile fare suşlarının kullanılması8,15,32önerilir.

Üçüncü olarak, bir 1) ikincil lenfoid dokularda lenfoid folikül yapılarının kötü gelişimi ve 2) üçüncül lenfoid dokuların eksikliği, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin düşük seviyeleri ile ilgili olan (yani, huNS γ-zincirnull farelerde dendritik hücreler) foliküllerin gelişimi için kritik olan33. Bu sorun huNS γ-chainnull fare modelleri kötü bir mizahi yanıt ile ilişkilidir34. Bununla birlikte, bazı raporlar huNS γ-chainnull farelerdefolikül benzeri yapıların gelişimini kanıtlamış 4 , dalak- ve lenf nodülü ile sınırlı foliküler T hücreleri ise (folikül-homing kemokin reseptörCXCR5 ifade) huNS γ-zincirnull fareler ve ilgili suşları15tespit edilir. Yine, kullanımı 1) BLT fareler veya 2) hematopoetik faktörlerin transjenik ekspresyonu ile fare suşları ve / veya HLA moleküllerinin ekspresyonu ile miyeloid popülasyonların reconstitution artırabilir, organize ikincil ve tersiyer lenfoid yapıların gelişimi, ve etkili T-hücre ve B-hücre yanıtları8,35,36.

CD34+ HS-humanized NS γ-chainnull fare modellerinin sınırlamalarına benzer şekilde, antijene özgü T-hücre ve mizahi tepkiler, miyeloid popülasyonların yokluğu ve hu-PBL-NS γ-chainnull farelerde organize lenfoid yapılar bulunmaktadır. Buna ek olarak, hu-PBL-NS γ-chainnull mouse modelinin önemli bir sınırlama (HIV enfeksiyonu akut ve reaktivasyon modelleri) izlemek için kısa bir pencere, bu fareler xenojenik GVHD geliştirmek beri23. GVHD gelişimi de bağışıklık popülasyonlarının istenmeyen phenotik ve fonksiyonel değişiklikler neden olabilir, patojenik sürecin doğasında23,37. Yine de, bu model daha basit ve daha erişilebilir olmanın avantajı vardır, özellikle insan PBMCs daha kolay sağlıklı veya HIV enfekte donörler38elde edilir göz önünde bulundurularak . Buna ek olarak, birincil hücrelerin doğrudan hastalardan enjeksiyonu, viral ilaç direnci mutasyonları veya donöre özgü immün değişiklikler gibi donörün hücre veya patojen-içsel durumlarının incelenmesinde yararlıdır. Not, reaktivasyon modeli için, HIV reaktivasyon ajanları ile in vitro tahliller fareler içine enjeksiyon dan önce PBMCs yanıtını doğrulamak için yapılabilir39. Bazı kurumlar için bir diğer sınırlama da, bu çalışmanın düzenlemeler nedeniyle HIV bulaşmış hayvanları işlemek için BSL2+ tesislerini gerektirmesidir.

HuNS γ-chainnull fare modelleri, simian immün yetmezlik virüsü ile enfekte insan olmayan primatlar gibi HIV enfeksiyonu incelemek için diğer hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında bazı avantajlara sahiptir. Örneğin, huNSγ-zincirnull fareler gen nakavt veya transgenik suşların oluşturulmasına izin, hangi belirli gen hedeflerinin değerlendirilmesi izin. Ayrıca, huNS γ-zincirnull farelerde birincil insan hücrelerinin kullanımı olası türlere özgü kısıtlamalar önler, insan olmayan primatlar interferon uyarılmış genlerin durumunda gibi, hangi antiviral yanıt ve enfeksiyon seyri etkileyebilir40. Böylece, enfeksiyonun kinetik huNS γ-zincirnull fareler arasında son derece tutarlıdır. Son olarak, huNS γ-chainnull fare modelleri daha az pahalıdır, karmaşık çekirdek tesisleri gerektirmez ve daha erişilebilir.

Özetle, CD34+ HSC-humanized ve hu-PBL-NS γ-chainnull fare modelleri HIV enfeksiyonu kronik, akut ve reaktivasyon olayları nın incelenmesi için çeşitli olanaklar sunar. Bu modellerin yukarıda belirtilen sınırlamalarının tanınması ve aşılması yla, NS γ-chainnull farelerin kullanımı virolojik, immünolojik ve ilaç öncesi klinik çalışmalar için güçlü bir araç olabilir, genom düzenleme ve hücre bazlı immünoterapiler için de.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma JCZ Için IHV klinik bölümü iç fonlar tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 154 CD34+ PBMC intrahepatik enjeksiyonlar intraperitoneal enjeksiyonlar retro-orbital kanama HIV
Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno,… More

Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter