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Immunology and Infection

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

doi: 10.3791/60315 Published: December 3, 2019

Summary

Hier werden drei experimentelle Ansätze beschrieben, um die Dynamik der HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen zu untersuchen. Die erste erlaubt die Untersuchung chronischer Infektionsereignisse, während letztere die Untersuchung akuter Ereignisse nach primärer Infektion oder viraler Reaktivierung ermöglicht.

Abstract

Humanisierte NOD/SCID/IL-2-Rezeptor-Null-Mäuse rekapitulieren einige Merkmale der menschlichen Immunität, die in der grundlegenden und präklinischen Forschung an Infektionskrankheiten genutzt werden können. Hier sind drei Modelle von humanisierten immundefizienten Mäusen beschrieben, um die Dynamik einer HIV-Infektion zu untersuchen. Die erste basiert auf der intrahepatischen Injektion von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen bei neugeborenen Mäusen, die die Rekonstitution mehrerer Blut- und Lymphgewebezellen ermöglicht, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von bis zu 36 Wochen nach der Infektion und wird daher als chronisches Modell bezeichnet. Das zweite und dritte Modell werden als die akuten und Reaktivierungsmodelle bezeichnet, bei denen periphere mononukleäre Blutzellen intraperitoneal in erwachsene Mäuse injiziert werden. Im akuten Modell werden Zellen eines gesunden Spenders über den intraperitonealen Weg transplantiert, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Schließlich werden im Reaktivierungsmodell Zellen eines HIV-infizierten Spenders unter antiretroviraler Therapie über den intraperitonealen Weg transplantiert. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung in der Maus eine Virusreaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben den konventionellen experimentellen Ansatz für humanisierte, immundefizienten Mausmodelle einer HIV-Infektion.

Introduction

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Das humanisierte Mausmodell NOD/SCID/interleukin (IL)-2-Rezeptor-Chain null (im Folgenden als huNS-Kettenullbezeichnet) wurde häufig zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen, Autoimmunität und Krebs sowie für präklinische Studien von Medikamenten und humanzellbasierten Therapien1,2verwendet. Diese Mäuse basieren auf einem nicht-fettleibigen Diabetiker (NOD) Hintergrund, mit der scid-Mutation und gezielten Mutation am IL-2-Rezeptor-Ketten-Lokus (gemeinsame Kette für IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 und IL-21), die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B-, und natürlichen Killerzellen (NK) verursachen, die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B- und natürlichen Killerzellen (NK)verursachen. So unterstützen sie die Engraftierung von menschlichem Gewebe, humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)3,4,5. Darüber hinaus fördert die transgene Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren, wie Stammzellenfaktor (SCF), Granulozyt/Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), und IL-3 die Engraftmentierung menschlicher Myeloidpopulationen6,7,8.

Für HIV-Studien wurden mehrere huNS-Kette Null-Maus-Modelle beschrieben, die sich in der Maus Stamm, Art der verwendeten menschlichen Zellen, Art des Gewebes für die Engraftment und Herkunft der Zellen (d.h. gesund vs. HIV-infizierter Spender)9,10. Der ursprüngliche Stamm ist jedoch aufgrund der hohen Konzentration menschlicher Zellen und der Virusreplikation nach einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm11,12,13weit verbreitet. Ähnliche immundefiziöse Mausstämme mit transgener Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren (z. B. NOG-EXL oder NSG-SGM3) oder mit Implantaten menschlicher Leber- und Thymusgewebe (Knochenmark-Leber-Thymus [BLT]-Mäuse) sind nützlich für die Bewertung der Rolle von Myeloidpopulationen bei der Anti-HIV-Immunantwort, den Auswirkungen von HIV auf diese Gewebe und deren Beteiligung als Virusreservoir14,15. Darüber hinaus können einige Stämme mit transgener Expression von humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Molekülen sowie BLT-Mäusen zur Untersuchung der T-Zell-Reaktion auf HIV-Infektionen16,17verwendet werden.

Im Allgemeinen hängt die Humanisierung bei diesen Mäusen vom zellulären Ursprung, dem Verabreichungsweg (intraperitoneal, intrahepatisch, intravenös, intrakardial) und dem Mausalter zum Zeitpunkt der Transplantation18,19,20ab. In Bezug auf den Zellursprung können menschliche CD34+ HSC aus Nabelschnurblut, fetaler Leber oder mobilisiertem peripherem Blut bei neugeborenen oder jungen Mäusen injiziert werden3,21. Darüber hinaus können erwachseneNull-Mäuse durch Injektion von PBMC (hier als hu-PBL-NS-Kettenull-Mäuse bezeichnet) humanisiert werden, was die zeitliche Zirkulation dieser Zellen im Blut, sekundären Lymphorganen und entzündeten Geweben22,23,24ermöglicht.

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von huNS-Kette Null-Maus-Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektionen beschrieben. Das erste ist das chronische Modell, bei dem menschliche CD34+ HSCs, die aus Nabelschnurblut von einem gesunden Spender stammen, bei neugeborenen Mäusen injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 14 Wochen Rekonstitution des menschlichen Immunsystems. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von Mäusen für bis zu 36 Wochen nach der Infektion. Das zweite Modell ist ein akutes Modell, bei dem PBMCs, die von einem gesunden Spender abgeleitet wurden, in erwachsene NS-Kettenull Mäuse injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 3 Wochen menschlicher T-Zell-Expansion in der Maus. Das dritte Modell schließlich ist das Reaktivierungsmodell, bei dem PBMCs, die von einem HIV-infizierten Spender im Rahmen einer unterdrückenden antiretroviralen Therapie (ART) abgeleitet wurden, in adulte NS-Kettenull Mäuse injiziert werden. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung eine virale Reaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die beiden letztgenannten Modelle ermöglichen eine Überwachung von bis zu 9 Wochen nach der Transplantation.

Insgesamt sind diese drei Modelle nützlich für virologische Studien, präklinische Studien neuartiger Medikamente und die Bewertung der Auswirkungen von HIV-Infektionen auf die globale Immunantwort. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass die Verwendung von HIV-infizierten humanisierten Mäusen vor jedem Experiment eine Überprüfung und Genehmigung durch den Institutional Biosafety Committee (IBC) sowie durch den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) erfordert. Dadurch wird sichergestellt, dass die Studie alle internen und externen institutionellen Vorschriften für die Verwendung von gefährlichem biologischem Material und den humanen Umgang mit Versuchstieren befolgt.

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Protocol

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Bei dieser Arbeit wurden alle Tierpflege- und -verfahren nach Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland School of Medicine überprüft und genehmigt wurden (Protokollnummern 1018017, 1018018 und 0318009).

1. Humane CD34+ HSC-Transplantation von neugeborenen Mäusen

  1. Verwenden Sie immer Einweg-Personenschutzausrüstung (PPE), einschließlich steriler Peelings, Handschuhe, spezielle Schuhe, Schuhbezüge, Maske, Schutzbrille, Haar/Bart-Motorhaube und sterile Labormäntel.
  2. 1 x 106 gefrorener CD34+ HSCs (siehe Materialtabelle) in 10 ml RPMI 1640 Medien 10% FBS unter einem zertifizierten Biosicherheitsschrank wieder aussetzen und sterile Bedingungen aufrechterhalten.
  3. Verwenden Sie 10 l der Suspension zu zählen (um das Vorhandensein der erwarteten Anzahl von Zellen zu gewährleisten) und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer.
  4. Zentrifuge bei 400 x g für 15 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in kalten 1x PBS auf die erforderliche Konzentration (1,4 x 105 CD34+ HSCs in 50 l) ab. Halten Sie die Zellen auf Eis bis zur Injektion.
  5. Welpen (NS-Kettenull Welpen beider Geschlechter von 1 bis 4 Tagen) in eine sterile 100 mm2 Petrischale zusammen mit einer kleinen Menge Bettmaterial aus dem Züchterkäfig geben. Zusätzlich reiben Sie saubere Bettwäsche zwischen den Händen, um fremde Gerüche auf den Empfängerwelpen weiter zu maskieren.
    HINWEIS: Dies minimiert die imprägnierten Fremdgerüche auf die Welpen und verbessert so die Chancen von Müttern, ihre Welpen nach dem Eingriff wieder in Käfige aufzunehmen.
  6. Legen Sie die Petrischale in einen sauberen Transportkäfig und legen Sie den Käfig in einen sauberen Mausmikroisolatorkäfig, um Welpen vor der Umwelt zu schützen. Bedecken Sie den Transportkäfig mit einem Abdeck, um die Exposition von Tieren gegenüber externem Licht während des Transports zum Bestrahlungsraum zu vermeiden.
  7. Bestrahlen Welpen mit 100 cGy Ganzkörperbestrahlung (WBI) durch Exposition gegenüber einer 137 Cs Quelle. Reinigen Sie das Innere des Bestrahlungsators mit Desinfektionslösung, legen Sie Mäuse in den Bestrahlungskörper und schalten Sie den Plattenspieler so ein, dass alle Welpen homogen bestrahlt werden. Schließen Sie den Bestrahlungskörper und drücken Sie den Netzschalter, um den Bestrahlungsprozess zu initiieren. Warten Sie, bis die Bestrahlungszeit abgeschlossen ist, und entfernen Sie die Mäuse sofort.
    HINWEIS: Da die Bestrahlung bei den Mäusen keinen Stress erzeugt, ist keine vorherige Anästhesie erforderlich.
  8. 2–4 h nach dem Bestrahlungsverfahren, legen Sie Welpen in einem Biosicherheitsschrank in eine gekühlte sterile Petrischale, die mit steriler Gaze auf Eis bedeckt ist, bis sie anästhesiert werden (ca. 5–10 min). Eine ausreichende Anästhesie wird erreicht, wenn die Grobbewegungen aufhören.
  9. Laden Sie die Spritze mit einer beigefügten Nadel (29 G, 0,5") mit 50 l der Zellsuspension und 1,4 x 105 CD34+ HSCs unter dem zertifizierten Biosicherheitsschrank.
  10. Für die Transplantation durch Leberinjektion, halten Sie Welpen mit dem Daumen und Zeigefinger. Um die Mauszurückhaltung zu minimieren (30–45 s), lassen Sie einen Prüfer den Welpen halten und die Injektion verabreichen, und lassen Sie den zweiten Prüfer die Spritze mit der HSC-Suspension beladen. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Alkohol und liefern Sie 50 l Zellen direkt in die Leber. Verwenden Sie einen flachen Nadelwinkel beim Injizieren, um ein vollständiges Durchstechen der Leber zu vermeiden. Als Kontrolle, injizieren Sie Mäuse mit 50 l von 1x PBS in die Leber.
  11. Legen Sie die Welpen auf eine vorgewärmte sterile Petrischale, die mit steriler Gaze für 1–5 min bedeckt ist, um eine Erholung zu ermöglichen. Die Schale mit einem Infrarot-Wärmepad für Nagetiere bei 20 °C vorwärmen, um sicherzustellen, dass die Welpen nicht übergewärmt werden.
  12. Unmittelbar vor der Rückgabe der Welpen an ihre Eltern, wenden Sie eine kleine Menge Menthol- und Eukalyptus-basierte Salbe, mit dem Daumen und Zeigefinger, auf die Schnis beider Eltern, um Kannibalismus oder Ablehnung der Welpen zu vermeiden.
  13. Überprüfen Sie Käfige jeden Tag, auf der Suche nach Anzeichen von Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) in den Welpen wie trockene Haut, keine Fütterung, Hautausschlag, und Alopezie. Euthanisieren Sie die Tiere, wenn eines dieser Anzeichen beobachtet wird.
  14. Entwöhnen Sie Mäuse im Alter von 3 Wochen, sie nach Geschlecht zu gruppieren. Setzen Sie nicht mehr als 5 Tiere pro Käfig. Verifizieren Sie die Engraftmentierung im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie im Alter von 14 Wochen.
    HINWEIS: Die Erfolgsrate der Transplantation liegt zwischen 80% und 100%.

2. Menschliche PBMC-Engraftment von Juvenile-Mäusen

  1. Für die akuten und Reaktivierungsmodelle injizieren Sie 6-8 Wochen alte NS-Kettenull Mäuse intraperitoneal mit menschlichen PBMCs, die von einem gesunden Spender oder HIV-infizierten Patienten abgeleitet wurden, der unter ART war. In beiden Modellen, gehören Mäuse mit PBMCs von einem gesunden Spender ohne HIV-Infektion (Schein) als Kontrollen injiziert.
  2. Schicht 15 ml Vollblut in 5 ml sterilen Dichte Gradienten Medium in einem 50 ml konischen Rohr.
  3. Zentrifuge bei 400 x g für 30 min bei RT, ohne Bremsen, um zu vermeiden, dass sich das buffy Fell mit dem Dichtegradientenmedium vermischt.
  4. Sammeln Sie vorsichtig den Anteil der mononukleären Zellen (zwischen dichtegradienten medium und überstand) und übertragen Sie die buffy Schicht auf ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 10 ml 1x PBS. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei RT.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie die verbleibenden roten Blutkörperchen, indem Sie mit 5 ml ACK-Puffer, der den pelletierten Zellen zugesetzt wird, lysieren. 4 min bei RT inkubieren.
  6. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei RT. Den Überstand entsorgen und in 10 ml 1x PBS oder RPMI 1640 medium wieder aufsetzen.
  7. Verwenden Sie 10 l der Zellsuspension, um die Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer zu überprüfen. In der Regel werden 1–2 x 106 Zellen für jede 1 ml Blut erhalten, mit mehr als 95% Lebensfähigkeit.
  8. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und passen Sie die Zellzahl an die erforderliche Konzentration an (in diesem Fall 3,5 x 106 Zellen in 200 l mit 1x PBS).
  9. Die Spritze mit einer beigefügten Nadel (28 G, 0,5") mit 3,5 x 106 PBMCs in 200 l 1x PBS unter einem zertifizierten Biosicherheitsschrank beladen.
  10. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und halten Sie sie am Schwanz, so dass sie das Netz greifen kann, indem Sie sanfte Traktion nach hinten. Legen Sie dann den Zeige- und Daumenfinger auf die Schultern des Tieres, greifen Sie die lockere Haut des Halses und verwenden Sie den Mittelfinger, um ihren Rücken zu stabilisieren.
  11. Schieben Sie den Mauskopf zurück, so dass sein Rücken über dem Kopf ist. Dadurch kann die Eingeweide in der Bauchhöhle nach hinten verschoben werden und reduziert das Risiko, die inneren Organe während der Injektion zu durchkreuzen.
  12. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Alkohol.
  13. Durchdringen Sie die in Schritt 2.9 verwendete Spritze durch die Bauchwand und aspirieren Sie vor der Injektion der Zellen, wenn Material angesaugt wird, entfernen Sie die Spritze und entsorgen Sie sie. Andernfalls injizieren Sie die Zellen langsam in die intraperitoneale Höhle, entfernen Sie die Spritze und entsorgen Sie sie. Injizieren Sie 1x PBS, um Mäuse zu kontrollieren.
  14. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück.
  15. Verifizieren Sie die Engraftmentierung im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie nach 3 Wochen nach der Injektion.

3. Post-Engraftment-Pflege

  1. Identifizieren Sie Mäuse durch Ohrmarkierungen.
  2. Beobachten Sie die Mäuse, die in diesen Experimenten verwendet werden, nach jedem Eingriff bei klinischen Anzeichen von Not genau 2x pro Tag.
  3. Nach der Transplantation menschlicher Zellen, überwachen Sie Mäuse auf GVHD. Zur Überwachung der GVHD-Symptome bei neugeborenen, jugendlichen und erwachsenen Mäusen, bewerten Tiere auf das Auftreten von Hauterkrankungen (d. h. Farbe, Trockenheit, Hautausschlag, Alopezie), zusätzlich zur Körpergewichtsmessung. Bewerten Sie Tiere, die diese Anzeichen durch einen Tierarzt zeigen, um frühe Sterbehilfe in Betracht zu ziehen.

4. HIV-Infektionsverfahren und Scheininfektionsverfahren

HINWEIS: Bei den chronischen und akuten Modellen sind Mäuse in Woche 14 bzw. Woche 3 nach der Transplantation mit dem HIV-BaL-Referenzstamm infiziert. Injektionen mit HIV werden intraperitoneal in die unteren Bauchquadranten verabreicht.

  1. Führen Sie den Ladevorgang des Virus/PBS in Spritzen mit einer 28 G 0,5"-Nadel in BSL2-Schränken nach ABSL2-Verfahren durch. Die Gesamtmenge des injizierten Virus beträgt 15.000 mediane Gewebekultur-Infektiöse Dosis (TCID50) in 200 l sterilem RPMI 1640.
  2. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und halten Sie sie am Schwanz, so dass sie das Netz greifen kann, indem Sie sanfte Traktion nach hinten. Legen Sie dann den Zeigefinger und den Daumen auf die Schultern des Tieres, greifen Sie die lockere Haut des Halses und verwenden Sie den Mittelfinger, um den Rücken zu stabilisieren.
  3. Schieben Sie den Mauskopf zurück, so dass sein Rücken über seinem Kopf ist. Dadurch kann die Eingeweide in der Bauchhöhle nach hinten verschoben werden und reduziert das Risiko, während der Injektion innere Organe zu durchkreuzen.
  4. Reinigen Sie die Mäuse mit einem vorbenetzten Alkoholpolster im unteren linken/rechten Quadranten des Bauches. Injizieren Sie 15.000 TCID50 des HIV-BaL-Virus, das in 200 l sterilem RPMI 1640 enthalten ist.
  5. Nach der Injektion, kehren Sie die Maus in ihren Hauskäfig zurück.

5. Blutentnahme durch retroorbitale Punktion

HINWEIS: Retroorbitale Blutungen ermöglichen eine schnelle Blutentnahme, wodurch die Gesamtentnahmezeit verkürzt und die Stabilität der menschlichen Lymphozytenmarker erhöht wird. Verwenden Sie EDTA-Röhrchen, um Mäuseblut zu sammeln.

  1. Im chronischen Modell, bei 14 Wochen nach der HSC-Injektion, sammeln Sie das Blut über retroorbitale Vene. Führen Sie dieses Verfahren in den Akut- und Reaktivierungsmodellen nach 3 Wochen nach der PBMC-Injektion durch.
  2. Anästhetisieren Sie die Tiere mit 250 l Isofluran-Inhalation vor der Blutentnahme in einer Biosicherheitshaube der Klasse B2, die extern kanalisiert wird.
  3. Geben Sie das Isoflurane in Wattepads unter einem Drahtgitter in einem klaren 1 L Glas in einem Außerhalb des Gebäudes entlüfteten Biosicherheitsschrank. Die Verwendung des Netzes sorgt dafür, dass die Tiere nicht mit dem isoflurangetränkten Pad in Berührung kommen, was zu Hautreizungen und einer möglichen Überbezäunung führen kann, da Isofluran auch durch die Haut absorbiert wird. Legen Sie auch ein weiches Papiertuch zwischen das Netz und das Tier, um Verletzungen der Gliedmaßen zu vermeiden.
  4. Sobald das Glas mit Isofluran gesättigt ist (ca. 1 min nach Zugabe), führen Sie das Tier ein und beobachten Sie die Atemfrequenz, die dann abnehmen wird. Prüfen Sie die klinische Indikation einer tiefen Anästhesieebene, die das Fehlen eines Rechtenreflexes (bei sanftem Kippen) und fehlende grobe Bewegungen umfasst. Beginnen Sie den Blutungsvorgang, sobald das Tier völlig entspannt ist und der Zehenkniffreflex fehlt.
    HINWEIS: Da Isoflurane verdunstet, mehr Medikament abgeben, wenn keine Anzeichen einer Anästhesie beobachtet werden.
  5. Für die retroorbitale Blutung drücken Sie die Maus externe JugularVene kaudal auf den Unterkiefer mit dem Daumen, und mit der gleichen Hand, sanft heben Sie das obere Augenlid mit dem Zeigefinger.
  6. Setzen Sie ein Hämatokritrohr in den medialen Canthus des Auges ein und lenken Sie es in ventrolaterale Richtung, bis das Blut zu fließen beginnt.
  7. Sammeln Sie mindestens 100 L Blut. Sobald das gewünschte Blutvolumen erreicht ist (ein Volumen von nicht mehr als 1% des Körpergewichts des Tieres), beenden Sie den äußeren Jugulardruck und entfernen Sie das Hämatokritrohr.
  8. Stellen Sie sicher, dass die Hämostase vollständig ist, indem Sie den direkten Druck auf das Auge mit einer sterilen Gaze für mindestens 30 s anwenden.
  9. Tetracaintropfen im Auge auftragen. Überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig von der Anästhesie erholt hat, und legen Sie es wieder in den Käfig.
    ANMERKUNG: Die 100 L des gesammelten Blutes werden zur Bewertung des Entransplantats von Human-CD45+ und anderen Blutkörperchen sowie zur Bewertung der Plasmaviruslast verwendet.

6. Screening der Transplantationspegel- und Durchflusszytometrie-Analyse

  1. Befolgen Sie ein herkömmliches Flusszytometrie-Färbeprotokoll für Vollblut, das die Inkubation von fluorchrom-markierten antihumanen Antikörpern umfasst (für vorgeschlagenes Strömungspanel, siehe Tabelle der Materialien), gefolgt von der Lyse roter Blutkörperchen und den Waschschritten13,15.
    HINWEIS: Für die Abschirmung des Entransplantatsisten ist ein antihumaner CD45-Antikörper enthalten. Zum Vergleich kann auch ein Anti-Maus-CD45-Antikörper verwendet werden. Umfassen Sie Kompensationskontrollen sowie eine menschliche Blutprobe, die mit der gleichen Antikörpermischung, ungefärbten Maus- und menschlichen Blutproben und nicht-humanisierter Kontrolle gefärbt ist, um die Kreuzreaktivität der Reagenzien zu testen. Nach der Färbung gibt es immer ein Hintergrundsignal; alle positiven Signale unterscheiden sich jedoch deutlich von negativen und kreuzreaktiven Steuerungen.
  2. Erfassen Sie in einem geeigneten Durchflusszytometer mindestens 10.000 Ereignisse am Lymphozytentor (FSC-A vs. SSC-A). Für die Analyse der Durchflusszytometrie bestimmen Sie nach doppeltem Ausschluss den Prozentsatz der menschlichen CD45+ Zellen sowie anderer zellgroßer Populationen, die von Interesse sind.

7. Bewertung der Plasma-Viruslast

  1. Bewerten Sie die Viruslast bei HIV-infizierten Tieren 1x pro Woche nach der Infektion.
  2. Nach der retroorbitalen Blutung (ca. 100 l) erhalten Sie Plasma, indem Sie den Überstand nach zentrifugieren des antikoagulierten Blutes bei 3.500 x g für 3 min in einer Mikrozentrifuge sammeln. Das Pellet wird für die Blutzell-Phänotypisierung verwendet.
  3. Verwenden Sie ein kommerzielles virales RNA-Extraktionskit (siehe Tabelle der Materialien), um RNA aus 40 l Plasma zu erhalten.
  4. Konvertieren Sie RNA in cDNA mit dem ersten Dehnungssynthesemix (siehe Tabelle der Materialien) und HIV-Knebelgrundierung SK431.
  5. Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR mit HIV-Gag-Primern SK38/SK39 und fluoreszierenden grünen Farbstoffen (z. B. SYBR grün) durch, wie in früheren Studien13,25beschrieben.

8. Verabreichung der antiretroviralen Therapie

  1. Verabreichen Sie orale ART mindestens 3 Wochen nach der Infektion, wenn eine hohe Viruslast beobachtet wird, in den chronischen, akuten und Reaktivierungsmodellen.
  2. Berechnen Sie die Dosen von Tenofovirdisdisoproxilfumarat (TDF), Emtricitabin (FTC) und Raltegravir (RAL), nach Km-Werten von 37 bzw. 3 für Mensch und Maus, bzw.26. In der Regel betragen die humanäquivalenten Dosen von TDF, FTC und RAL 61,7 mg/kg/Tag, 40,7 mg/kg/Tag bzw. 164 mg/kg/Tag.
  3. Für die Verabreichung im Trinkwasser, zerkleinern Sie Drogentabletten und fügen Sie die entsprechende Menge in der Wasserflasche, um sicherzustellen, dass jede Maus im Käfig ihre tägliche Dosis erhält. Da das Wirkstoffpulver Sediment in der Flasche bilden kann, schütteln Sie regelmäßig die Wasserflasche, um eine homogene Suspension zu erreichen.
  4. Wechseln Sie die Wasserflasche jede Woche mit frisch gelösten Medikamenten.
  5. Sammeln Sie das Blut über retroorbitale Vene jede Woche oder alle 2 Wochen nach ART-Initiierung, um die Veränderungen der Viruslast und CD4:CD8-Verhältnis zu bewerten.

9. Maus-Euthanasie, Sammlung von sekundären Lymphorganen und Isolierung mononuklearer Zellen

  1. Euthanasie wird in den drei humanisierten Mausmodellen durchgeführt, periodisch entlang der Infektionszeit oder am Ende des Experiments.
  2. Führen Sie die Euthanasie von erwachsenen Mäusen durch CO2-Erstickung, gefolgt von der zervikalen Dislokation. Verwenden Sie zur Erstickung eine nicht vorgeladene Kammer, geben Sie CO2 aus einem Handelszylinder mit festem Druckregler aus und steuern Sie den Gasstrom innerhalb von 20%-30% des Kammervolumens/der Kammerminute, um den AVMA-Richtlinien von 2013 zu entsprechen.
  3. Halten Sie denCO2-Fluss für >60 s Überwachung Atemstillstand (die bis zu 5 min dauern kann), gefolgt von der Zervixdislokation, um Dieathanasie zu gewährleisten.
  4. Euthanisieren Neonate <7 Tage alt durch eine physikalische Methode (d.h. mit scharfer Schere).
  5. Visualisieren Sie axilläre, mediastinale und mesenterische Lymphknoten (die typischerweise beobachtet werden) und extrahieren Sie sie mit einer Pinzette und einer scharfen Schere. Extrahieren Sie auch die Milz, die sich in der oberen linken Seite der Peritonealhöhle befindet.
  6. Legen Sie das Lymphgewebe in 1,5 ml Zentrifugenröhren ab, die steriles RPMI 1640 Medium enthalten.
  7. Verarbeiten Sie das lymphoide Gewebe sofort in einem 70 mm Poren-großen Nylonzellsieb und sammeln die Zellen in einem 50 ml-Rohr. Das Gewebe nicht ansaugen.
  8. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 1% FBS, um die Zellenfilterung zu erleichtern.
  9. Zentrifugieren Sie nach der Gewebedisaggregation die Zellsuspension bei 3.500 x g für 10 min in einer Mikrozentrifuge.
  10. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 500 l 1x PBS wieder auf.
  11. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr, das 500 l steriles Dichtegradientenmedium enthält.
  12. Zentrifuge bei 3.500 x g für 3 min in einer Mikrozentrifuge, ohne Bremse, um zu verhindern, dass sich die buffy Schicht mit dem Dichtegradientenmedium vermischt
  13. Sammeln Sie vorsichtig den Anteil der mononukleären Zellen (zwischen dichtegradientenmedium und überstand) und übertragen Sie die buffy Schicht auf ein 1,5 ml Zentrifugenrohr, das 500 l 1x PBS enthält. Zentrifuge bei 3.000 x g für 3 min.
  14. Entfernen Sie die verbleibenden roten Blutkörperchen, indem Sie mit 500 l ACK-Puffer lysieren und 4 min bei RT inkubieren.
  15. Zentrifuge bei 3.000 x g für 3 min. Den Überstand entsorgen und in 1 ml 1x PBS oder Medium wieder aufsetzen.

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Representative Results

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Wie oben beschrieben, werden die Mäuse nach 14 Wochen nach der HSC-Injektion (chronisches Modell) oder nach 3 Wochen nach der PBMC-Injektion (akute und Reaktivierungsmodelle) zum Screening des Niveaus der Enpfropz menschlicher Zellen durch Durchflusszytometrie ausgeblutet. Eine repräsentative Gating-Strategie für die Bewertung von 1) menschlichen CD45+ Zellen Rekonstitution und 2) Prozentsatz von CD4+ und CD8+ T-Zellen ist in Abbildung 1Adargestellt. Typischerweise liegt der Grad der Engraftment (Prozentsatz der menschlichen CD45+ Zellen) zwischen 10% und 80% nach CD34+ HSC-Injektion und hängt von der Route der Injektion und Mausdehnung, unter anderem zuvor beschriebenen Faktoren(Abbildung 1B). Nach der PBMC-Injektion liegt der Grad der Engraftment (Prozentsatz der menschlichen CD45+ oder CD3+ Zellen) zwischen 5%–65%, auch mit Unterschieden zwischen den Mausstämmen (Abbildung 1B). Darüber hinaus können einige Unterschiede zwischen Mäusen beobachtet werden, die mit PBMC injiziert wurden, die von einem gesunden im Vergleich zu einem HIV-infizierten Spender stammen (Abbildung 1D). In der Regel reichen bei HIV-Infektionen ein Transplantatvon von über 5 %-10 % für eine aktive Virusreplikation.

Wichtig ist, dass ein Merkmal von hu-PBL-NS-Null-Maus-Modellen die Entwicklung von xenogenen GVHD innerhalb weniger Wochen nach der Zellentransplantation aufgrund der menschlichen T-Zell-Erkennung von murinen Haupthistokompatibilitätskomplexen (MHC) Molekülen23ist. Dieser Prozess ist offensichtlich, auch nach 3 Wochen post-PBMC-Injektion, durch Anzeichen wie Haar- und Gewichtsverlust (Abbildung 2A,B), sowie durch die erhöhte Expression von Aktivierungsmarkern in T-Zellen wie HLA-DR und CD38 (Abbildung 2C,D). Auf der anderen Seite entwickelt sich GVHD langsamer bei Mäusen, die mit humaner CD34+ HSC injiziert werden, und ist direkt mit dem anfänglichen Grad der Engraftment korreliert.

Nach der HIV-Infektion gibt es eine schnelle Zunahme der Plasmaviruslast, die in der Regel nach 2–3 Wochen nach der Infektion nachweisbar ist, sowohl in den chronischen als auch in den akuten Modellen (Abbildung 3A,B), mit ähnlicher Kinetik im Reaktivierungsmodell (Abbildung 3C). Der Anstieg der Viruslast fällt mit einem Rückgang des CD4:CD8-Verhältnisses zusammen (Abbildung 3D,E,F). Diese Veränderungen werden bei Kontrollmäusen nicht beobachtet (ohne HIV-Infektion, Abbildung 3). Bemerkenswert ist, dass im hu-PBL-NS-Kette-Null-Maus-Modell eine anfängliche Umkehrung des CD4:CD8-Verhältnisses beobachtet werden kann, die entlang der Überwachungszeit rekonstituiert wird (Abbildung 3 E,F). Schließlich wird bei der Verabreichung von ART an HIV-infizierte Mäuse eine Unterdrückung der Viruslast sowie eine Erholung im CD4:CD8-Verhältnis erwartet, die ähnliche Werte wie bei nicht infizierten Kontrollen erreichen wird (Abbildung 3A,C,D,F). Typischerweise wird nach 2-3 Wochen der Behandlung eine Abnahme der Viruslast und eine Erhöhung des CD4:CD8-Verhältnisses in den chronischen, akuten und Reaktivierungsmodellen beobachtet. Wenn dies nicht beobachtet wird, müssen die Medikamentendosen und der Verabreichungsweg einer Bewertung bedürfen.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Gating-Strategie zur Bewertung der Einpfrückungsniveaus menschlicher CD45+ und T-Zellen. (A) Gating-Strategie für das Screening des Prozentsatzes der menschlichen CD45+ (huCD45), CD3+, CD4+, und CD8+ T-Zellen in huNS-Kettenull Mäuse, in Woche 14 nach Injektion mit Nabelschnurblut CD34+ HSCs. Die Zahlen geben den Prozentsatz jeder Bevölkerung an. (B) Repräsentative Eindredlungswerte (Prozentsatz von huCD45+ Zellen) in huNS-Kettenull (n = 6) und einer ähnlichen immundefizienten Sorte mit transgener Expression von IL-3 und GM-CSF (huNOG-EXL, n = 6), wie zuvorberichtet 15. (C) Repräsentative Eindredlungswerte (Prozentsatz von huCD3+ Zellen) in hu-PBL-NS-Kettenull und hu-PBL-SGM3-Mäusen (NS-Kettenull Mäuse mit transgener Expression von SCF, GM-CSF und IL-3), in Woche 3 nach Injektion mit PBMCs von einem gesunden Spender (akutes Modell, n = 7 bzw. n = 8). (D) Repräsentative Eindredlungswerte (Prozentsatz von huCD3+ Zellen) bei hu-PBL-NSG-SGM3-Mäusen nach Injektion mit PBMCs von einem gesunden oder HIV-infizierten Patienten, der unter ART war (Reaktivierungsmodell, n = 10 bzw. n = 12). In B-D gibt die Zeile den Median an, und der p-Wert des Mann-Whitney-Tests wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Entwicklung von GVHD im hu-PBL-NS-Kette-Null-Maus-Modell. (A) Haarausfall bei zwei repräsentativen hu-PBL-NSG-SGM3-Mäusen in Woche 7 nach Injektion mit PBMC von einem gesunden Spender. (B) Der Gewichtsverlust des Mauskörpers während der gesamten Überwachungszeit normalisierte sich auf den Prozentsatz des Startgewichts bei hu-PBL-NSG-SGM3-Mäusen, die von einem gesunden Spender (n = 10) und HIV-infizierten Patienten (n = 12) mit PBMC injiziert wurden. (C) Repräsentative Expression (in Woche 7 nach der Engraftmentierung) von HLA-DR und CD38 in CD4+ und CD8+ T-Zellen von hu-PBL-NSG-SGM3-Mäusen, die von einem gesunden Spender mit PBMCs injiziert wurden. Die Zahlen geben den Prozentsatz jeder Bevölkerung an. (D) Repräsentative Prozentsätze von CD4+ und CD8+ T-Zellen, die HLA-DR+ CD38+ in hu-PBL-NSG-SGM3-Mäusen sind, die von einem gesunden Spender mit PBMC injiziert wurden. Bemerkenswert ist, dass in Zellen vor der Injektion in Mäuse die Konzentrationen von HLA-DR+ CD38+ CD4+ und CD8+ T-Zellen 2,0 % bzw. 5,7 % betrugen. In B und D wird der mediane und interquartile Bereich angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Veränderungen der Viruslast und des CD4:CD8-Verhältnisses bei huNS-Kettenull Mäusen nach EINER HIV-Infektion und nach DER ART-Einführung. (A, D) CD4:CD8-Verhältnis und Plasma-Viruslast bei huNS-Kettenull Mäusen nach einer Hiv-BaL-Infektion (rote Punkte und Linie, n = 3), die nach woche 14 der Injektion mit Nabelschnurblut CD34+ HSCd durchgeführt wurden. Uninfizierte Kontrollen (PBS-injiziert) wurden ebenfalls enthalten (grüne Punkte und Linie, n = 5). (B, E) Plasmaviruslast und CD4:CD8-Verhältnis bei hu-PBL-NSG-SGM3-Mäusen nach einer Hiv-BaL-Infektion (rote Punkte und Linie, n = 4), die in Woche 3 nach Injektion mit PBMC von einem gesunden Spender (akutes Modell) durchgeführt wurde. Nicht infizierte Steuerelemente (PBS-injiziert) wurden ebenfalls einbezogen (grüne Punkte und Linie, n = 3). (C und F) Plasmaviruslast und CD4:CD8-Verhältnis bei hu-PBL-NSG-SGM3-Mäusen, die von einem HIV-infizierten Spender (rote Punkte und Linie, n = 9) oder gesundem Spender (grüne Punkte und Linie, n = 10) mit PBMZ injiziert wurden (Reaktivierungsmodell). In allen Fällen wird der mediane und interquartile Bereich angezeigt. In A-C gibt die gestrichelte Linie die Erkennungsgrenze des Assays an (150 Kopien/ml). Für Proben mit nicht nachweisbarer Viruslast wurde ein Wert zugewiesen, der der Hälfte der Nachweisgrenze entspricht. In D-F gibt die gestrichelte Zeile ein CD4:CD8-Verhältnis von 1 an. In A, C, D und F zeigt das graue Feld die Zeit mit der Verwaltung von ART an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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Wichtige Fortschritte wurden bei der Entwicklung von immundefizienten Mausstämmen für die Humanisierung erzielt, mit einer Reihe von verschiedenen Optionen, die je nach Forschungsinteresse verwendet werden können1. Hier ist ein allgemeines Protokoll zur Humanisierung von NS-Kettenull Mäuse n und genetisch ähnliche Stämme in drei verschiedenen Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektion verwendet werden. Im ersten experimentellen Ansatz werden bestrahlte neugeborene Mäuse mit menschlichen CD34+ HSCs injiziert, die aus Nabelschnurblut, fetaler Leber oder mobilisiertem peripherem Blut abgeleitet werden können3,21. Eine angemessene Bestrahlung von NS-Ketten-Null-Mäusen ist ein kritischer Schritt, da sie das Knochenmark der Maus und andere Vorläuferzellen eliminiert und eine effiziente Rekonstitution menschlicher Zellpopulationen ermöglicht. Einige Berichte haben jedoch eine Rekonstitution menschlicher Zellen in verschiedenen Mausstämmen ohne Bestrahlung nachgewiesen27. In diesem Zusammenhang müssen angemessene Strahlendosen vorgesehen werden, da NS-KetteNull-Mäuse radioempfindlich sind und eine hohe Bestrahlung eine thymische Lymphomgenese21,28induzieren könnte.

Weitere kritische Schritte und Faktoren, die den Grad der Engraftment beeinflussen könnten, sind der Injektionsweg (intrahepatische, intravenöse, intrakardiale), das Alter von Mäusen, der Reinheitsgrad von CD34+ HSCs und das Fachwissen des Bedieners29. In der zweiten und dritten Ansätze auf der Grundlage von hu-PBL-NS-Kette Null-Maus-Modelle, einige kritische Faktoren sind der Weg der Injektion (intraperitoneal, intravenös, intrasplenic), Mäuse Alter, und Anzahl der menschlichen Zellen injiziert, die die endgültige Ebene der Engraftment beeinflussen können. In Bezug auf diesen letztgenannten Faktor wurden in mehreren Studien 5–10 x 106 PBMCs für die Engraftment22,23,30, verwendet, während das vorliegende Protokoll die Verwendung von 3,5 x 106 PBMCs vorschlägt. Bemerkenswert ist, dass diese Anzahl von Zellen für die Rekonstitution von T-Zellen und für die HIV-Replikation sowohl in den akuten als auch in den Reaktivierungsmodellen ausreicht und auch die Entwicklung von GVHD23verzögert. Dennoch sollten die Forscher die Humanisierungsbedingungen entsprechend den Forschungszielen optimieren. Darüber hinaus ist es wichtig, den HIV-Stamm zu validieren, der für die Infektion von HuNS-Kettenull Mäusen verwendet wird. Hierkommt der R5-TropischeR HIV-1-BaL-Stamm, der bei huNS-Kette null-Mäusen ein hohes Maß an Virusreplikation ergibt. Andere Reporterstämme, wie solche, die Luziferase oder fluoreszierende Proteine enthalten, eignen sich auch für die einzellige Analyse von HIV-infizierten Zellen31.

Insgesamt sind drei wesentliche Einschränkungen in huNS-Kette-Null-Maus-Modellen nach der Engraftmentierung mit CD34+ HSC nachgewiesen. Erstens, aufgrund des Fehlens einer menschlichen thymischen Umgebung, T-Zellen werden im Kontext von murinen MHC-Molekülen gebildet, Die nachfolgende antigenspezifische Stimulation über ihre T-Zell-Rezeptoren zu bremsen. Dieses Problem beschränkt die Verwendung von NS-Kette Null-Maus-Modellen für die Untersuchung der HIV-spezifischen T-Zell-Reaktion. Dennoch kann diese Einschränkung durch die Verwendung von BLT-Mäusen oder NS-Kettenull Mäusen mit transgener Expression der HLA-Moleküle16,17überwunden werden. Zweitens gibt es in der Regel eine schlechte Rekonstitution von myeloischen Populationen in NS-Kette Null-Maus-Modellen, die die Untersuchung dieser Teilmengen einschränken, die im Zusammenhang mit Antigen-Präsentation und Pathogenese der HIV-Infektion relevant sind14, 15. In diesem Fall wird die Verwendung von Mausstämmen mit transgener Expression hämatopoetischer Faktoren empfohlen8,15,32.

Drittens gibt es eine 1) schlechte Entwicklung der lymphoiden Follikelstrukturen in den sekundären Lymphgeweben und 2) einen Mangel an tertiären Lymphgeweben, der mit dem niedrigen Niveau angeborener Immunzellen (d. h. dendritischen Zellen in huNS-Kettenull Mäusen) zusammenhängt, die für die Entwicklung von Follikel33entscheidend sind. Dieses Problem ist mit einer schlechten humoralen Reaktion in huNS -Kette Null-Maus-Modelle34verbunden. Nichtsdestotrotz haben einige Berichte die Entwicklung follikelähnlicher Strukturen in huNS-Kettenull Mäusen4belegt, während Milz- und Lymphknoten-beschränkte follikuläre T-Zellen (exklamiert den follikel-homing Chemokin-Rezeptor CXCR5) in huNS-Kettenull Mäusen und verwandten Stämmen15) nachgewiesen werden. Auch hier kann die Verwendung von 1) BLT-Mäusen oder 2) Mausstämmen mit transgener Expression hämatopoetischer Faktoren und/oder mit Expression von HLA-Molekülen die Rekonstitution von myeloischen Populationen, die Entwicklung organisierter sekundärer und tertiärer Lymphstrukturen sowie effektive T-Zell- und B-Zellreaktionen8,35,36verbessern.

Ähnlich wie bei den Einschränkungen von CD34+ HSC-humanisierten NS-Kette Null-Maus-Modellen fehlt es an antigenspezifischen T-Zell- und Humorreaktionen, an myeloischen Populationen und an organisierten lymphoiden Strukturen in hu-PBL-NS-Null-Mäusen. Darüber hinaus ist eine wichtige Einschränkung des hu-PBL-NS-Null-Maus-Modells (akute und Reaktivierungsmodelle einer HIV-Infektion) das kurze Zeitfenster zur Überwachung, da diese Mäuse xenogene GVHD23entwickeln. Die Entwicklung von GVHD könnte auch unerwünschte phänotypische und funktionelle Veränderungen der Immunpopulationen induzieren, inhärent des pathogenen Prozesses23,37. Dennoch hat dieses Modell den Vorteil, einfacher und zugänglicher zu sein, insbesondere wenn man bedenkt, dass menschliche PBMCs leichter von gesunden oder HIV-infizierten Spendern erworben werdenkönnen 38. Darüber hinaus ist die Injektion von Primärzellen direkt von Patienten für die Untersuchung zell- oder pathogen-intrinsischer Erkrankungen des Spenders nützlich, wie virale Wirkstoffresistenzmutationen oder spenderspezifische Immunveränderungen. Bemerkenswert ist, dass für das Reaktivierungsmodell In-vitro-Assays mit HIV-Reaktivierungsmitteln durchgeführt werden können, um die Reaktion von PBMCs vor der Injektion in Mäuse zu bestätigen39. Eine weitere Einschränkung für einige Institutionen ist, dass diese Arbeit BSL2+ Einrichtungen erfordert, um HIV-infizierte Tiere aufgrund von Vorschriften zu behandeln.

Die huNS-Kette Null-Maus-Modelle haben einige Vorteile im Vergleich zu anderen Tiermodellen zur Untersuchung von HIV-Infektionen, wie nichtmenschliche Primaten, die mit einem simianischen Immundefizienzvirus infiziert sind. Zum Beispiel ermöglichen huNS-Kettenull-Mäuse die Bildung von Gen-Knockout oder transgenen Stämmen, die die Bewertung spezifischer Genziele ermöglichen. Darüber hinaus vermeidet die Verwendung primärer menschlicher Zellen in huNS-Kette null-Mäusen mögliche artspezifische Einschränkungen, wie z. B. interferonstimulierte Gene bei nichtmenschlichen Primaten, die die antivirale Reaktion und den Verlauf der Infektion beeinflussen können40. Somit ist die Kinetik der Infektion sehr konsistent zwischen huNS-Kettenull Mäusen. Schließlich sind huNS-Kette-Null-Maus-Modelle kostengünstiger, erfordern keine komplexen Kerneinrichtungen und sind leichter zugänglich.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CD34+ HSC-humanisierte und hu-PBL-NS-Kette Null-Maus-Modelle eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Untersuchung chronischer, akuter und Reaktivierungsereignisse bei HIV-Infektionen bieten. Mit der Erkennung und Überwindung der oben genannten Einschränkungen dieser Modelle kann die Verwendung von NS-Kette Null-Mäusen ein leistungsfähiges Werkzeug für virologische, immunologische und medikamentöse präklinische Studien sowie für genomische Editing und zellbasierte Immuntherapien sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den internen Fonds der Klinischen Abteilung IHV an JCZ unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

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Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen
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Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).More

Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

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