Summary
Les ligands de matrice extracellulaire peuvent être modelés sur des hydrogels de polyacrylamide pour permettre la culture des cellules souches embryonnaires humaines dans les colonies confinées sur des substrats conformes. Cette méthode peut être combinée avec la microscopie de force de traction et des essais biochimiques pour examiner l'interaction entre la géométrie de tissu, les forces cell-générées, et la spécification de destin.
Abstract
Les cellules souches embryonnaires humaines démontrent une capacité unique de répondre aux morphogènes in vitro par des modèles auto-organisés de spécification sépariane du destin cellulaire qui correspondent à la formation de couches germinales primaires pendant l'embryogenèse. Ainsi, ces cellules représentent un outil puissant pour examiner les mécanismes qui conduisent le développement humain précoce. Nous avons mis au point une méthode de culture de cellules souches embryonnaires humaines dans des colonies confinées sur des substrats conformes qui assure le contrôle de la géométrie des colonies et de leur environnement mécanique afin de récapituler les paramètres physiques qui sous-tendent l'embryogenèse. La caractéristique clé de cette méthode est la capacité de générer des hydrogels polyacrylamides avec des modèles définis de ligand matrice extracellulaire à la surface pour promouvoir l'attachement cellulaire. Ceci est réalisé en fabriquant des pochoirs avec les motifs géométriques désirés, en utilisant ces pochoirs pour créer des modèles de ligand de matrice extracellulaire sur des couvertures en verre, et en transférant ces modèles aux hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation. Cette méthode est également compatible avec la microscopie de force de traction, permettant à l'utilisateur de mesurer et de cartographier la distribution des forces générées par les cellules dans les colonies confinées. En combinaison avec des essais biochimiques standard, ces mesures peuvent être utilisées pour examiner le rôle des indices mécaniques jouer dans la spécification du destin et la morphogénèse au cours du développement humain précoce.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) sont très prometteuses pour une utilisation dans les applications de médecine régénérative et d'ingénierie tissulaire. La nature pluripotente de ces cellules leur donne la capacité de se différencier en n'importe quel type de cellule adulte. Bien que de grands progrès aient été réalisés dans la direction du sort des HESC vers des types cellulaires particuliers, il est resté très difficile de générer des tissus entiers ou des organes de novo1,2,3,4, 5. Cela est dû, en grande partie, à une compréhension limitée des mécanismes qui conduisent la formation de ces tissus au cours du développement humain. Afin de combler cette lacune dans les connaissances, un certain nombre de méthodes ont émergé ces dernières années pour modéliser l'embryon précoce et les stades de développement ultérieurs avec des cellules souches embryonnaires6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Peu de temps après la dérivation des premières lignées hESC14, il a été démontré que les corps embryonnaires formés à partir de HESCs étaient capables de produire spontanément des cellules des trois couches germinales primaires6. Cependant, en raison du manque inhérent de contrôle sur la taille et la morphologie des corps embryonnaires, l'organisation des couches germinales variait considérablement et ne correspondait pas à l'organisation de l'embryon précoce. Plus récemment, Warmflash et coll. ont mis au point une méthode pour confiner les colonies de HESC sur des substrats de verre par micro-patterning, fournissant un contrôle et une cohérence sur la taille et la géométrie des colonies8. En présence de BMP4, un morphogène important dans le développement précoce, ces colonies confinées étaient capables d'auto-organiser des modèles reproductibles de spécification aux destins représentant les couches germinales primaires. Bien que cela ait fourni un modèle utile pour étudier les mécanismes par lesquels les couches germinales primaires sont établies, les modèles de spécification de destin ne correspondent pas exactement à l'organisation et à la morphogenèse observées pendant l'embryogenèse15. Une récapitulation plus fidèle du développement embryonnaire précoce a été réalisée en intégrant des HESC dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (ECM) de matrigel11, fournissant les preuves les plus solides à ce jour de la capacité des HESC à s'auto-organiser et à modéliser les premiers stades de l'embryogenèse ex vivo. Cependant, cette méthode donne des résultats incohérents et est donc incompatible avec un certain nombre d'essais qui pourraient être utilisés pour révéler les mécanismes sous-jacents de l'auto-organisation et la spécification du destin.
Compte tenu de ces méthodes existantes et de leurs limites respectives, nous avons cherché à développer une méthode de culture reproduction des colonies hESC de géométries définies dans des conditions qui modélisent l'environnement extracellulaire de l'embryon précoce. Pour ce faire, nous avons utilisé des hydrogels polyacrylamides d'élasticité réglable pour contrôler les propriétés mécaniques du substrat. En utilisant la microscopie de force atomique sur les embryons de poulet au stade de la gastrulation, nous avons constaté que l'élasticité de l'épiblaste variait de centaines de pascals à quelques kilopascals. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur la production d'hydrogels de polyacrylamide avec l'élasticité dans cette gamme pour servir de substrat pour les colonies de hESC. Nous avons modifié nos méthodes précédentes de culture des hESC sur les hydrogels polyacrylamides7,9 afin de fournir un contrôle robuste sur la géométrie des colonies. Nous y sommes parvenus en faisant d'abord des glaçages eCM ligands, à savoir des matrigel, sur des feuilles de verre à travers des pochoirs microfabriqués, comme indiqué précédemment16. Nous avons ensuite conçu une nouvelle technique pour transférer le ligand à motifs à la surface des hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation. La méthode que nous décrivons ici consiste à utiliser la photolithographie pour fabriquer une plaquette de silicium avec les motifs géométriques souhaités, la création de timbres de thèses géométriques avec polydimethylsiloxane (PDMS), et en utilisant ces timbres pour générer les pochoirs qui finalement permettre le modelage de ligand sur la surface des feuilles de verre et de transférer à polyacrylamide.
En plus de récapituler l'environnement mécanique de l'embryon précoce, le confinement des colonies hESC sur le polyacrylamide permet de mesurer les forces générées par les cellules avec la microscopie de force de traction (TFM), tel que rapporté dans notre méthode précédente9. En bref, les perles fluorescentes peuvent être incorporées dans le polyacrylamide et utilisées comme marqueurs fiducial. Les forces générées par les cellules sont calculées en imagerie du déplacement de ces perles après l'ensemencement des HESC sur le substrat à motifs. En outre, les cartes de force de traction qui en résultent peuvent être combinées avec des essais traditionnels, tels que l'immunostaining, pour examiner comment la distribution des forces générées par les cellules dans les colonies hESC confinées peut réguler ou moduler la signalisation en aval. Nous nous attendons à ce que ces méthodes révèlent que les forces mécaniques jouent un rôle critique dans le modelage de la spécification du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire précoce qui est actuellement négligé.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici concernant l'utilisation des HESC ont été approuvées par le Human Gamete, Embryo and Stem Cell Research (GESCR) Committee de l'Université de Californie à San Francisco.
1. Préparation de plaquette de silicium avec des dispositifs géométriques
- Créez un photomasque avec les caractéristiques géométriques souhaitées. Utilisez un logiciel de rédaction assisté par ordinateur pour concevoir les fonctionnalités. Pour une utilisation avec photoresist négatif, rendre les caractéristiques opaques et le reste du masque transparent.
REMARQUE : Pour le modelage sur des couvertures de diamètre de 18 mm, les caractéristiques de groupe pour chaque condition expérimentale dans des zones de 10 x 10 mm pour s'assurer que les pochoirs générés à l'étape 3 s'adaptent aux couvertures. - Spin manteau photoresist négatif sur une plaquette de silicium de 100 mm. Utilisez la fiche de données photorésistante pour déterminer la vitesse et la longueur de la rotation afin de générer une épaisseur de film de 100 à 250 m.
REMARQUE : L'épaisseur du film doit être ajustée de telle sorte que le rapport d'aspect de la largeur des motifs à la hauteur du pochoir soit aussi proche que possible de 1:1. Cependant, nous recommandons une épaisseur minimale de 100 m, car rien de moins produit des pochoirs délicats qui se déchirent facilement. - Traiter le photoresist selon la feuille de données du produit. Il s'agit généralement d'une cuisson molle, l'exposition aux UV avec photomask dans un aligneur de masque, après l'exposition cuire, le développement, et cuire dur cuire. Par exemple, la procédure utilisée pour traiter les gaufrettes utilisées dans ce protocole est décrite dans le tableau 1.
REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous manipulez des plaquettes de silicium car elles sont fragiles. Une fois générées, les gaufrettes peuvent être utilisées à plusieurs reprises tant qu'elles ne sont pas endommagées.
2. Préparation des couvertures
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Préparation des couvertures « supérieures » lavées à l'acide
- Placer les couvercles de #1 de 18 mm de diamètre dans un plat Petri en verre. Le nombre approprié de couvertures dépend de la taille du plat. Pour un plat de 100 mm, préparer 50-100 couvertures à la fois. Les quantités de volume données dans le reste de cette section correspondent à un plat de 100 mm.
- Ajouter 20 ml de 1 M HCl au plat Petri et secouer délicatement le plat pour disperser les couvercles. Assurez-vous que toutes les fiches sont submergées et relâchez des bulles d'air entre les couvertures. Incuber toute la nuit à température ambiante en secouant doucement.
CAUTION: HCl est acide et corrosif. Faites preuve de prudence et portez un EPI approprié tout en travaillant avec HCl. - Decant HCl du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total de cinq lavages.
- Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml d'éthanol à 100 % au plat. À l'aide de forceps, retirer les couvertures individuellement et disposer entre deux morceaux de papier filtre pour sécher.
- Conserver les feuilles de couverture séchées dans un contenant scellé. Les couvertures lavées à l'acide peuvent être préparées à l'avance et entreposées pendant un mois ou plus dans des conditions exemptes de poussière.
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Préparation des couvertures « inférieures » activées par le glutaraldéhyde
REMARQUE: Se référer aux méthodes précédentes pour plus de détails7,9.- Placer des couvertures de #1 de 18 mm de diamètre dans un plat Petri.
- Ajouter 20 ml de 0,2 M HCl dans le plat de Pétri et secouer délicatement le plat pour disperser les couvercles. Assurez-vous que toutes les fiches sont submergées et relâchez des bulles d'air entre les couvertures. Incuber toute la nuit à température ambiante en secouant doucement.
- Decant HCl du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total de cinq lavages.
- Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml de 0,1 M NaOH et secouer doucement pour disperser et submerger les couvertures. Incuber à température ambiante en secouant doucement pendant 1 h.
- Decant NaOH du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total de cinq lavages.
- Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml d'une dilution de 1:200 de 3-aminopropyltrimethoxysilane dans l'eau ultrapure et secouer doucement pour disperser et submerger les couvertures. Incuber à température ambiante en secouant doucement pendant 1 h ou toute la nuit.
CAUTION: 3-aminopropyltrimethoxysilane est inflammable et peut causer une irritation de la peau. Manipuler avec soin, porter le PPE approprié et jeter les déchets conformément aux règlements locaux d'élimination. - Decant la solution diluée 3-aminopropyltrimethoxysilane du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total d'au moins cinq lavages. Il est essentiel d'enlever tous les 3-aminopropyltrimethoxysilane avant de procéder.
- Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml d'une dilution de 1:140 de 70% de glutaraldéhyde dans le phosphate tamponné salin (PBS) et secouer doucement pour disperser et submerger les couvertures. Incuber à température ambiante en secouant doucement pendant 1 h ou toute la nuit.
CAUTION : 70% de glutaraldéhyde est toxique et peut causer une irritation de la peau. Manipuler avec soin, porter le PPE approprié et jeter les déchets conformément aux règlements locaux d'élimination. - Décant la solution diluée de glutaraldéhyde du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total de cinq lavages.
- Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml d'éthanol à 100 %. À l'aide de forceps, retirer les couvertures individuellement et disposer entre deux morceaux de papier filtre pour sécher.
- Conserver les feuilles de couverture séchées dans un contenant scellé. Les fiches de couverture activées par le glutaraldéhyde peuvent être préparées à l'avance et stockées jusqu'à six mois.
3. Génération de pochoirs pour le modèle ECM ligand
- Génération de timbres intermédiaires en polydiméthylsiloxane (PDMS)
- Mélanger la base PDMS avec l'agent de durcissement PDMS à un rapport de 10:1, par poids. Mélanger.
REMARQUE : Pour l'application initiale du PDMS, préparer environ 100 g de PDMS pour remplir un plat de 100 mm. Pour les applications ultérieures, retirez Le PDMS du centre du plat où se trouvent les caractéristiques des plaquettes de silicium et préparez 20 à 30 g de nouveau PDMS. - Dégazer le mélange PDMS dans un dessiccateur pendant 30-60 min ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air soient enlevées.
- Placer la plaquette de silicium modifiée de l'étape 1 dans un plat en plastique de 100 mm. Verser lentement et uniformément le mélange De PDMS sur la surface de la plaquette. Appuyez sur le plat sur la surface de travail pour libérer les bulles d'air de la surface de la plaquette.
- Degas le mélange PDMS versé sur la plaquette pendant 10 min ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air sont enlevés ou sont venus à la surface du PDMS.
- Cuire le PDMS à 70 oC pendant 2 h. Laisser refroidir à température ambiante.
- À l'aide d'un scalpel ou d'un coupe-boîte, découper la section de PDMS du centre du plat qui contient les caractéristiques géométriques.
- Couper le PDMS en carrés d'environ 10 x 10 mm, chacun contenant les caractéristiques d'une seule condition expérimentale. Ces « timbres » sont appelés « timbres » dans les étapes ultérieures du protocole.
- Mélanger la base PDMS avec l'agent de durcissement PDMS à un rapport de 10:1, par poids. Mélanger.
- Génération de dalles plates de PDMS
- Mélanger la base PDMS avec l'agent de durcissement PDMS à un rapport de 8:1, par poids. Préparer environ 20 g pour chaque plat de 100 mm à utiliser. Mélanger.
- Dégazer le mélange PDMS dans un dessiccateur pendant 30-60 min ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air soient enlevées.
- Versez lentement et uniformément le PDMS dans un plat propre de 100 mm. Appuyez sur le plat sur la surface de travail pour libérer les bulles d'air.
- Cuire le PDMS à 70 oC pendant 2 h. Laisser refroidir à température ambiante.
- Retirer le PDMS du plat. Inverser de telle sorte que la surface du PDMS qui était en contact avec le fond du plat est orientée vers le haut.
- Pour chaque timbre généré à l'étape 3.1, coupez un carré de 15 x 15 mm de PDMS. Ces « dalles plates » sont appelées « dalles plates » dans les étapes ultérieures du protocole.
- Générer des pochoirs
- Disposer les dalles plates de PDMS sur le couvercle d'un plat de 150 mm, ou toute autre surface plane pour une manipulation plus facile. Assurer un espacement suffisant entre les dalles (p. ex., pour un plat de 150 mm, disposer neuf dalles plates avec un espacement uniforme).
- Inverser chaque timbre généré à l'étape 3.1 sur une dalle plate de PDMS, de sorte que les caractéristiques du timbre sont en contact avec la dalle plate de PDMS. Appuyez doucement sur le dessus du timbre avec des forceps pour assurer un contact uniforme.
- Aplatlez soigneusement le couvercle tenant pDMS timbre / dalle paires sur la base du plat, de sorte que le couvercle repose à un angle. Cela aide à l'évacuation du polymère UV-curable dans l'étape suivante.
- Placez une petite goutte de polymère UV-curable à l'interface supérieure de chaque paire timbre/dalle. Le polymère sera méchant entre les deux par la tension de surface, assisté par la gravité.
REMARQUE : De nombreux polymères UV-curables peuvent fonctionner dans ce protocole. Nous avons sélectionné Norland Optical Adhesive 74 pour les propriétés suivantes: i) Durcissement rapide lors de l'exposition à la lumière UV, ii) Retrait facile des timbres PDMS sur le durcissement, iii) Adhérence robuste aux couvertures en verre avec pression manuelle. - Une fois que le polymère a été complètement méchant à travers, placez le couvercle avec des paires de timbres / dalle à plat sur la surface de travail. Placez une petite goutte de polymère UV-curable sur chacun des trois côtés restants de chaque interface timbre/dalle.
- À l'aide d'une pointe de pipette de 200 l L, connectez les gouttes de polymère sur les bords de l'interface timbre/dalle. Cela crée une frontière qui tiendra la solution ligand à l'étape 4.
REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous travaillez le polymère sur les bords du timbre. Si l'interface timbre/dalle est perturbée, le polymère mèche sous les caractéristiques et le pochoir ne se formera pas correctement. - Placez délicatement les paires timbre/dalle dans une boîte de stérilisation UV. Utilisez le réglage de puissance stérile "Str" et exposez pendant 10 min.
- Retirez les paires timbre/dalle de la boîte de stérilisation UV. À l'aide de deux paires de forceps, retirez délicatement le timbre PDMS tout en maintenant la dalle plate et le pochoir qui se sont formés à partir du polymère curable UV.
- À l'aide de forceps, retirez soigneusement le pochoir et inversez-le de telle sorte que la surface qui était en contact avec la dalle plate de PDMS est orientée vers le haut.
REMARQUE : Les pochoirs sont délicats. Soyez prudent lors de leur remise, en particulier tout en les retirant d'abord du PDMS, afin qu'ils ne se déchirent pas. - Remettre les pochoirs inversés dans une boîte de stérilisation UV. Utilisez le réglage de puissance stérile "Str" et exposez pendant 3 min.
4. Ligand de modèle d'ECM sur des couvertures
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Appuyer sur les pochoirs sur des couvertures lavées à l'acide
- Placer une feuille de couverture lavée à l'acide pour chaque pochoir sur un morceau propre de film de laboratoire.
- À l'aide de forceps, placez soigneusement chaque pochoir, côté plat vers le bas, sur un bordereau lavé à l'acide. Placez de telle sorte que les caractéristiques sont centrées sur le bordereau de couverture.
- Placer un petit morceau de film de laboratoire sur chaque pochoir. Appuyez fermement et uniformément sur le pochoir pour créer un contact fort entre le pochoir et le bordereau.
REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique! Appuyez fermement et sur toute la surface du pochoir. Si un contact suffisant n'est pas créé, la solution ligand s'infiltrera entre le pochoir et les couvertures et le modelage échouera. OPTIONAL: Pour confirmer un contact suffisant entre le pochoir et la glissière, pipette 100 'L d'eau stérile ultrapure sur la surface de chaque pochoir et incuber à température ambiante. Après 1 h, vérifiez s'il y a une fuite. Aspirez l'eau des pochoirs collés avec succès et procédez.
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Plasma nettoyant la surface des couvertures au pochoir pour augmenter l'hydrophilie
- Placer les feuilles de couverture avec des pochoirs dans un nettoyant à plasma. Appliquer du plasma de haute puissance pendant 30 s.
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Préparation de la solution ECM ligand
REMARQUE : Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées dans des conditions stériles, si possible.- Placer stérile 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 solution sur glace. Une fois la glace froide, ajouter le matrigel et le collagène pour obtenir des concentrations de 225 g/mL et de 25 g/mL, respectivement. OPTIONAL: Pour le dépannage ou pour la visualisation ligand, inclure un ligand étiqueté fluorescent dans la solution ligand.
- REMARQUE: Différents ligands ECM peuvent être utilisés avec cette méthode. Pour différents ligands, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour déterminer la concentration idéale, le temps d'incubation et la température d'incubation. Voir la section de discussion pour plus d'informations.
- Pipette la solution ligand sur la surface de chaque pochoir. Pour les pochoirs fabriqués à partir de timbres carrés de 10 x 10 mm, appliquez 100 l par pochoir.
- Vérifiez s'il y a des bulles d'air dans les fonctions de pochoir. Si nécessaire, utilisez des forceps à pointe fine ou une pointe de pipette de 2 l pour enlever les bulles d'air des entités.
REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique! Si les bulles d'air restent emprisonnées à la surface de la glissière de couverture, le ligand ne sera pas adsorb à la surface et le modèle résultant sera incomplet. - Placer les feuilles de couverture au pochoir avec du ligand dans un plat, envelopper avec du film de laboratoire, et incuber à 4 oC pendant la nuit.
- Placer stérile 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 solution sur glace. Une fois la glace froide, ajouter le matrigel et le collagène pour obtenir des concentrations de 225 g/mL et de 25 g/mL, respectivement. OPTIONAL: Pour le dépannage ou pour la visualisation ligand, inclure un ligand étiqueté fluorescent dans la solution ligand.
5. Transfert de ligand au gel de polyacrylamide
- Suppression de la solution ligand et pochoir de chaque bordereau
- Aspirez la solution ligand de la surface d'un pochoir. La solution Ligand peut être collectée et stockée à 4 oC et réutilisée jusqu'à un mois.
- À l'aide de forceps, immerger brièvement la glissière de couverture avec du pochoir dans un plat contenant du PBS stérile à laver.
- Immerger brièvement le bordereau avec du pochoir dans un deuxième plat de PBS stérile à laver.
- Retirer le pochoir de la surface de la glissière. Veillez à ne pas casser la glissière de couverture.
- Immerger brièvement le bordereau dans un plat contenant de l'eau stérile ultrapure pour enlever les sels des lavages PBS. Appuyez sur le bord de la feuille de couverture à une tâche délicate essuyer pour évacuer l'excès d'eau.
- Séchez la couverture sous un gaz inerte, comme l'azote. Marquez le dessous de la couverture pour garder une trace de l'orientation à partir de ce point vers l'avant. Veillez à garder le côté à motifs vers le haut.
- Répétez les étapes 5.1.1 à 5.1.6 pour chaque feuillet de couverture au pochoir.
- Fabrication d'hydrogels polyacrylamides avec des couvertures à motifs
REMARQUE : Se référer aux méthodes précédentes pour des détails supplémentaires7,9 Stérilisez tous les supports de chapeau, les tubes, et les espaceurs utilisés pour faire des gels de polyacrylamide en lavant avec 10% d'eau de Javel pendant la nuit, rinçant avec de l'eau au moins cinq fois pour enlever l'eau de Javel, et le lavage brièvement dans l'éthanol de 70%. Placer tous les morceaux sur des lingettes délicates dans une armoire de biosécurité stérile pour sécher avant utilisation.- Préparer la solution de polyacrylamide pour obtenir l'élasticité d'hydrogel désirée (tableau 2). Mélanger tous les composants sauf les microsphères fluorescentes et le persulfate de potassium (PPS).
REMARQUE : Préparer 1 % de persulfate de potassium à chaque fois. - Dégazer la solution de polyacrylamide, les microsphères et le PPS dans des tubes séparés sous vide pendant 30 min.
- Pour chaque bordereau à motifs, préparez un bordereau « bas » activé par le glutaraldéhyde avec un espaceur (18 mm de diamètre extérieur, 14 mm de diamètre intérieur) placé sur le dessus.
- Après le dégazage, sonicate brièvement les microsphères et ajoutez le volume approprié à la solution de polyacrylamide. Mélanger en pipetting de haut en bas, en faisant attention de ne pas introduire de bulles d'air. Peu sonore.
- Ajoutez le volume approprié de PPS à la solution de polyacrylamide. Pipette de haut en bas pour mélanger la solution, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air.
REMARQUE : Après l'ajout de PPS, travaillez rapidement pour terminer les étapes 5.2.6 à 5.2.11 avant que le polyacrylamide ne polymérise. - Pipette 75-150 L (selon l'épaisseur de l'espaceur) au centre de chaque bordereau activé par le glutaraldéhyde.
- À l'aide de forceps, placez un bordereau à motifs sur chaque bordereau activé par le glutaraldéhyde avec du polyacrylamide et de l'espaceur, de sorte que le ligand à motifs fait face à la solution de polyacrylamide. Si une solution suffisante de polyacrylamide a été ajoutée, la tension de surface évacuera le polyacrylamide entre les deux couvertures et aucune bulle d'air ne sera présente.
- Ramassez chaque polyacrylamide "sandwich" et touchez soigneusement le côté à une tâche délicate essuyer pour évacuer l'excès de solution de polyacrylamide.
- Placez soigneusement chaque polyacrylamide "sandwich" dans un porte-bouchon avec des fils qui sont compatibles avec 15 ml tubes conique-bas. L'orientation doit être telle que le fond de la glissière de couverture de glutaraldéhyde est en contact avec le bas du support de capuchon, et le couvercle modelé est sur le dessus.
- Visser un tube conique-bas de 15 ml dans chaque support de capuchon pour maintenir les « sandwichs » de polyacrylamide en place. Les tubes doivent être serrés pour éviter les fuites, mais attention à ne pas trop serrer et casser les couvercles.
- Centrifuger les "sandwichs" en polyacrylamide dans les tubes dans des seaux à balançoire à 200 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirer les tubes de la centrifugeuse et les placer dans des grilles à tubes pour maintenir l'orientation pendant 50 minutes supplémentaires afin d'assurer une polymérisation complète. Garder couvert de papier d'aluminium pour éviter le blanchiment des microsphères fluorescentes.
REMARQUE : La centrifugation est essentielle lors de l'utilisation de cette méthode pour effectuer TFM. La force centrifuge déplace toutes les microsphères vers un seul plan, qui sera finalement juste en dessous de la surface de l'hydrogel. Ceci est idéal pour l'imagerie des déplacements de microsphère qui sont utilisés pour calculer les contraintes de traction générées par les cellules. Si elles ne sont pas performantes, les microsphères peuvent être laissées à l'écart de la solution de polyacrylamide et la polymérisation peut se produire au banc sans centrifugation. - Retirer les « sandwichs » polyacrylamide polymérisés des tubes et les immerger dans le PBS dans un plat de 100 mm. Envelopper dans un film de laboratoire et incuber pendant 3 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 oC.
- Préparer la solution de polyacrylamide pour obtenir l'élasticité d'hydrogel désirée (tableau 2). Mélanger tous les composants sauf les microsphères fluorescentes et le persulfate de potassium (PPS).
- Préparation de gels à motifs pour les cellules d'ensemencement
- Utilisez un scalpel et des forceps pour enlever soigneusement le bordereau à motifs et l'espaceur du polyacrylamide "sandwich" alors qu'il reste immergé dans PBS. Le ligand à motifs aura été transféré au polyacrylamide pendant la polymérisation et restera après avoir enlevé le bordereau. Le gel de polyacrylamide restera attaché à la couverture activée par le glutaraldéhyde.
REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique! Le polyacrylamide doit être immergé dans PBS tout en enlevant le bordereau de couverture ou les modèles de ligand seront détruits. - Placez chaque bordereau avec du polyacrylamide à motifs dans un porte-capuchon. Placez un joint (18 mm de diamètre extérieur, 14 mm de diamètre intérieur) sur le dessus de la glissière de couverture et autour du polyacrylamide, où se trouvait l'espaceur. Visser un tube conique de 15 mm à fond conique dans le porte-capuchon, formant un puits avec le polyacrylamide à motifs au fond. Ces assemblages s'intègrent dans les puits d'une plaque standard de 12 puits pour une manipulation facile.
- Laver chaque gel en ajoutant 500 L de PBS à l'assemblage du puits. Incuber 10 min à température ambiante en secouant doucement. Retirez le PBS et répétez deux fois pour un total de trois lavages.
- Après le lavage final de PBS, ajouter 500 'L de knock-out-DMEM médias aux gels et incuber à 37 oC pendant la nuit. Les gels peuvent être conservés à 37 oC avec des supports jusqu'à 5 jours avant l'ensemencement des cellules.
- La veille de l'ensemencement des cellules, remplacez le knock-out-DMEM pour les médias KSR complets et incuber à 37 oC pendant la nuit.
- Utilisez un scalpel et des forceps pour enlever soigneusement le bordereau à motifs et l'espaceur du polyacrylamide "sandwich" alors qu'il reste immergé dans PBS. Le ligand à motifs aura été transféré au polyacrylamide pendant la polymérisation et restera après avoir enlevé le bordereau. Le gel de polyacrylamide restera attaché à la couverture activée par le glutaraldéhyde.
6. Cultiver des hESC sur des gels à motifs
REMARQUE : Si vous prévoyez de fixer des échantillons pour l'immunostaining après TFM, prenez des images des positions non stressées de microsphère avant des cellules d'ensemencement. Dans ce cas, le ligand étiqueté fluorescent doit être utilisé à l'étape 4.3.1 afin que les emplacements éventuels des cellules soient connus avant que l'ensemencement et les microsphères puissent être photographiés dans ces régions.
- Maintenir les cultures hESC de stock et les cultures secondaires sans mangeoire préparées sur des plaques matrigel-enduites dans les médias conditionnés de KSR avant l'ensemencement sur les gels de polyacrylamide modelés comme précédemment décrit9.
REMARQUE : Générer des médias KSR conditionnés en crepandant des fibroblastes embryonnaires irradiés de souris dans les médias KSR complétés par un facteur de croissance de base de 4 ng/mL de fibroblaste (bFGF). Recueillir et remplacer les médias tous les 24 h. - Aspirez les médias à partir de HESCs. Brièvement laver avec knock-out-DMEM médias. Ajouter 0,05 % de trypsine-EDTA complété par 10 M Y27632 (inhibiteur de la kinase rho) et incuber à 37 oC pendant 5 à 10 min.
- Ajouter le support avec le sérum pour inhiber la trypsine. Aspirez délicatement le support et la pipette sur le plat pour enlever les cellules. Continuer à pipetting doucement pour enlever toutes les cellules et dissocier les amas cellulaires à des cellules simples.
- Recueillir la suspension cellulaire et la centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min.
- Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille dans un volume équivalent de support KSR pour laver. Centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min.
- Aspirez le supernatant et suspendez la pastille dans des supports KSR conditionnés complétés par 10 ng/mL bFGF et 10 M Y27632.
- Comptez les cellules avec un hémocytomètre et ajustez la suspension cellulaire à une concentration de 300 000 cellules par mL. Pipette 500 l de la suspension cellulaire sur chaque gel à motifs (150 000 cellules par gel).
- 3 h après l'ensemencement, utiliser une pipette pour aspirer soigneusement le support de chaque gel et remplacer par un nouveau support KSR conditionné complété par 10 ng/mL bFGF et 10 M Y27632. Ceci enlève les cellules excédentaires qui n'ont pas adhéré aux régions modelées du polyacrylamide.
REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique! À ce stade, les cellules seront lâchement adhéré à la ligand à motifs. Soyez très prudent lors de l'échange de médias pour ne pas détacher les cellules. Une attention égale doit être prise avec chacun des échanges de médias dans les étapes suivantes. - 24 h après l'ensemencement, utilisez une pipette pour aspirer soigneusement les médias et échangez-les pour les supports KSR conditionnés complétés par 10 ng/mL bFGF et 5 M Y27632.
- 48 h après l'ensemencement, utiliser une pipette pour aspirer soigneusement les médias et échanger contre des supports KSR conditionnés complétés par 10 ng/mL bFGF. Cela supprime l'inhibiteur de la kinase Rho des médias et les expériences peuvent commencer le lendemain, 72 h après l'ensemencement.
7. Exécution de TFM
- Si désiré, effectuer TFM comme précédemment décrit9 dans les conditions expérimentales souhaitées.
- Si des positions de microsphère non stressées ont été imaginées avant l'ensemencement des cellules, fixez les cellules après avoir pris des positions de microsphère stressées et effectuez l'immunostaining pour déterminer la localisation des protéines d'intérêt par rapport aux régions des forces de traction élevées et basses.
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Representative Results
Le principal défi à surmonter en essayant de la culture hESCs dans les colonies de géométrie contrôlée sur des substrats conformes est de générer un modèle homogène de ECM-ligand sur la surface du substrat. La stratégie présentée dans cette méthode consiste d'abord à générer le motif désiré à la surface d'un bordereau de verre, puis à transférer ce motif à la surface d'un hydrogel polyacrylamide lors de la polymérisation du gel (Figure 1 R. Ainsi, il est important de s'assurer que le motif désiré est créé avec succès sur la surface de la glissière de verre avant de procéder à la polymérisation de l'hydrogel et au transfert du motif (figure 1B). Basé sur l'imagerie des modèles fluorescents de ligand transférés au polyacrylamide, le ligand semble être présent seulement dans un seul plan à la surface du polyacrylamide, bien que nous n'ayons pas précisément caractérisé l'épaisseur de cette couche. Il y a deux types communs de défauts observés suivant la génération de modèle sur le coverslip en verre, chacun avec sa propre source d'erreur. La première est l'apparition de ligand fluorescent s'étendant au-delà des marges du motif désiré (Figure 1C, en haut), qui résulte d'une fuite de la solution de ligand fluorescent en raison d'une petite déchirure au pochoir ou d'un étanchéité insuffisant du pochoir à la couverture en verre. La seconde est l'apparition d'un motif incomplet (Figure 1C, en bas), qui est généralement due à une bulle d'air piégée à l'interface de couverture qui empêche l'adsorption de la ligand fluorescent.
La mesure ultime du succès de cette méthode est la capacité de culture des HESC dans les géométries désirées sur les hydrogels à motifs (Figure 2). Pour ce faire, les HESC sont ensemancés à une densité relativement élevée (300 000 cellules/mL) en présence d'un inhibiteur de la kinase Rho (Y27632) et incubés pendant 3 h pour faciliter l'adhérence aux schémas de ligand. Les médias sont ensuite remplacés pour enlever les cellules non adhérentes. Au cours de 72 h, le Y27632 est progressivement dilué hors des médias par une série d'échanges médiatiques à 24 et 48 h après l'ensemencement. Typiquement, les HESC prolifèrent pour compléter les géométries modelées par 48-72 h, de sorte que les expériences peuvent commencer à 72 h après l'ensemencement, une fois que le Y27632 est complètement retiré des médias.
La culture des colonies de hESC dans des géométries confinées sur des hydrogels de polyacrylamide permet de mesurer les forces de traction générées par les cellules à l'aide de TFM. Ces mesures sont effectuées en intégrant des microsphères fluorescentes dans l'hydrogel et en imagerie des positions de ces perles avant et après l'ensemencement des HESC (Figure 3A). Le déplacement des perles après l'ensemencement cellulaire est fonction des forces générées par les cellules et de l'élasticité de l'hydrogel, de ainsi les images des positions de perles peuvent être utilisées pour générer des cartes des déplacements de perles et ensuite utilisées pour calculer le sous-jacent contraintes de traction. Dans les colonies circulaires de HESC, les plus grandes contraintes de traction se trouvent près du bord périphérique des colonies, tandis que le centre des colonies affiche des contraintes de traction uniformément faibles (figure 3B). Fait intéressant, les contraintes de traction les plus élevées se trouvent dans les grappes près du bord des colonies, plutôt que de former un anneau continu de stress maximal. Cela implique que, bien que la géométrie des colonies joue un rôle clé dans la détermination de la répartition des contraintes de traction, une régulation et une rétroaction plus localisées déterminent l'emplacement précis du stress maximal. En outre, tant que l'image des positions de microsphère sans cellules adhérentes est prise avant l'ensemencement cellulaire, les colonies de hESC peuvent être fixées pour l'immunostaining des protéines d'intérêt après des mesures de force de traction. Malgré les distributions non uniformes observées des contraintes de traction, les HESC cultivés comme des cercles à motifs dans des conditions d'entretien affichent une expression uniforme du marqueur de pluripotence Oct3/4 et de la molécule d'adhérence cellulaire E-cadherin(figure 3C ).
La méthode présentée pour l'utilisation des pochoirs pour générer des motifs de ligand est manifestement supérieure à la technique commune d'impression par microcontact pour les géométries relativement grandes utilisées dans cette méthode (c.-à-d. pour les colonies circulaires de 1 mm de diamètre ainsi que triangles et carrés d'une superficie équivalente). Les modèles d'impression en microcontact de ligand à cette échelle de longueur entraînent un transfert hétérogène aux bords des motifs, avec très peu de ligand déposé dans les régions centrales des modèles (Figure 4A). C'est clairement insuffisant pour produire constamment des colonies hESC de géométries spécifiques. La réduction de la densité d'ensemencement cellulaire entraîne également une incohérence dans la réalisation de colonies achevées. Les cellules ensemencées à 200 000 cellules/mL, au lieu de 300 000 cellules/mL, ne sont pas en mesure de générer suffisamment de contacts cellule-cellule pour survivre à la concentration réduite de Y27632 à 24 h après l'ensemencement (figure 4B). Il peut être possible de générer des modèles complets avec des densités cellulaires inférieures en prolongeant la période de dilution Y27632; cependant, dans l'ensemble, il est plus efficace de semer à la densité plus élevée de 300 000 cellules/mL. De temps en temps, des erreurs dans la génération de modèles qui ne sont pas détectées plus tôt dans le protocole deviennent évidentes lors de l'ensemencement des HESC. Une telle erreur est la fuite de la solution ligand sous le pochoir en raison d'un mauvais contact avec le bordereau de couverture. En fin de compte, le ligand est transféré dans des régions de la polyacrylamide en dehors des géométries souhaitées, et la croissance non confinée des HESC lors de l'ensemencement (Figure 4C).
Figure 1 : Modelage du ligand ECM sur des feuilles de couverture lavées à l'acide et transfert aux hydrogels polyacrylamides. (A) Représentation schématique du protocole de modelage du ligand ECM sur des couvertures lavées à l'acide et de transfert du ligand à motifs aux hydrogels polyacrylamides. (B) Images immunofluorescentes de ligand ECM à motifs sur des couvertures lavées à l'acide (à gauche) et après transfert à l'hydrogel polyacrylamide (à droite). Le matrigel marqué par biotine a été modelé sur la couverture et étiqueté avec Alexa Fluor 555 streptavidin avant le transfert au polyacrylamide. Les insets affichent une vue zoomée des modèles complets générés. (C) Images fluorescentes représentatives démontrant des défauts de modelage de ligand sur la glissière en verre. Ceux-ci résultent d'erreurs courantes dans le protocole, telles que la fuite de la solution ligand en dehors de la géométrie à motifs (en haut, flèche indique le site de fuite), et le piégeage des bulles d'air à l'intérieur des géométries à motifs du pochoir lors de l'ajout de la solution ligand ( en bas, la flèche indique le site de la bulle d'air). Toutes les barres d'échelle de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Ensemencement des HESC sur des hydrogels polyacrylamides à motifs. Images lumineuses représentatives démontrant l'ensemencement réussi des HESC sur des hydrogels de polyacrylamide avec le ligand modelé. La chronologie en haut indique la série de changements de médias utilisés pour enlever les cellules non attachées et diluer le Y27632. Notez qu'après l'ensemencement initial, les cellules adhèrent stochastiquement à diverses régions dans le ligand modelé et prolifèrent ensuite pour remplir les régions modelées au cours de 72 h. Barre d'échelle de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Localisation régionale des contraintes de traction et de l'immunostaining des colonies hESC confinées. (A) Images fluorescentes de microsphères dans l'hydrogel polyacrylamide avant et après l'ensemencement des HESC. (B) Parcelle représentative de vélocimétrie d'image de particules (PIV) représentant le déplacement des microsphères due aux contraintes de traction (à gauche) et aux contraintes de traction reconstruites correspondantes (à droite). (C) Immunostaining of confined hESC colonies on patterned polyacrylamide hydrogels, demonstrating the ability to compare localization of proteins of interest to traction stresses. Toutes les barres d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résultats non idéaux donnés par d'autres méthodes et erreurs. (A) Images fluorescentes représentatives du ligand ECM modelées sur des couvertures lavées à l'acide par l'impression par microcontact. (B) Images de Brightfield des HESC qui ne parviennent pas à former des colonies remplies en raison de l'adhérence insuffisante des cellules. Les grandes lacunes qui subsistent dans les colonies à 24 h après l'ensemencement (flèches) sont un indicateur précoce de ce problème. (C) Images de Brightfield de HESC qui ne parviennent pas à former des colonies confinées en raison d'erreurs dans le modelage qui a conduit à la présence de ligand en dehors des géométries souhaitées. Toutes les barres d'échelle de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Exemple SU8 Wafer Fabrication | |
| 1. Plaquette de manteau de rotation avec SU8-3050 | Tourner à 1000 tr/min pour 30 s |
| 2. Gaufrette molle de cuisson sur l'assiette chaude | i. 3 min à 65 oC |
| ii. 45 min à 95 oC | |
| iii. 3 min à 65 oC | |
| iv. Refroidir à température ambiante | |
| 3. Exposer dans l'aligneur de masque | i.Align plaquette et photomask dans l'aligneur de masque |
| Ⅱ. Exposer avec une énergie de 250 mJ/cm2 | |
| P. ex. pour la lampe d'intensité de 11 mW/cm2,exposer pour 23 s | |
| 4. Poster l'exposition cuire sur une plaque chaude | i. 1 min à 65 oC |
| ii.15 min à 95 oC | |
| iii. 1 min à 65 oC | |
| Iv. Refroidir à température ambiante | |
| 5. Développer | i. Agitate in SU8 Developer, environ 5-10 min |
| Ⅱ. Vérifier le développement avec l'alcool isopropyl (IPA) | |
| S'il est sous-développé, le rinçant IPA produira un résidu blanc | |
| 6. Cuire au four dur sur une assiette chaude (facultatif) | 1-2 h à 150 oC |
Tableau 1 : Exemple de protocole de fabrication de gaufrettes SU8. Les plaquettes de silicium utilisées pour générer des timbres PDMS et les pochoirs suivants ont été fabriqués à l'aide des étapes décrites dans ce tableau. Ce protocole a été généré à l'aide de la fiche de données SU8 3000 dans le but de créer une épaisseur de film d'environ 100-250 m.
| Formulations de gel polyacrylamide | |||||||||
| Volumes pour une solution complète de 1 ml | |||||||||
| Modulus élastique (Pa) | Acrylamide % final | Pourcentage final Bis-acrylamide | ddH2O | 40 % d'acrylamide | 2 % de Bis-acrylamide | 10x PBS (L) | 1% TEMED en ddH2O (L) | Microsphères 0,5 % solides en ddH2O (L) | 1% PPS en ddH2O (L) |
| 1050 | 3 | 0.1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7.5 | 0.035 | 485 | 187.5 | 17.5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7.5 | 0.05 | 477.5 | 187.5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7.5 | 0.07 | 467.5 | 187.5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
Tableau 2 : Formulations de gel polyacrylamide. Volumes de composants pour la production d'hydrogels polyacrylamides de divers moduli élastiques avec microsphères fluorescentes pour TFM. Les volumes peuvent être augmentés ou réduits en fonction de la quantité de solution de polyacrylamide nécessaire. Tous les composants, à l'exception des microsphères fluorescentes et du PPS, sont mélangés avant le dégazage. PBS - salin tamponné par le phosphate, TEMED - tétramethylethylenediamine, PPS - persulfate de potassium.
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Discussion
Pour simplifier un protocole long et détaillé, cette méthode se compose de trois étapes critiques : 1) la génération de modèles de ligand ECM sur des couvertures en verre, 2) le transfert des modèles aux hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation du gel, et 3) les HESC d'ensemencement sur le hydrogel à motifs. Il y a des étapes critiques qui doivent être prises en considération à chacune de ces trois étapes. Afin de générer des modèles de haute fidélité sur les feuilles de verre, le pochoir doit être fermement pressé sur le bordereau de couverture pour éviter la fuite de la solution de ligand et toutes les bulles d'air doivent être enlevées après l'ajout de solution ligand à la surface du pochoir ( Figure 1C). Si la solution ligand fuit à travers le pochoir en raison d'un mauvais contact avec la glissière de couverture, ligand sera transféré à toute la surface de l'hydrogel polyacrylamide et hESCs ne sera pas confiné à la géométrie de la colonie désirée (Figure 4C). L'étape la plus importante dans le transfert du ligand à motifs à la polyacrylamide est de séparer doucement le bordereau supérieur de l'hydrogel tandis que tous les composants restent immergés dans PBS. Si l'hydrogel ne reste pas immergé pendant la séparation, les motifs peuvent être complètement détruits. En outre, si la séparation se produit trop rapidement, la surface de l'hydrogel peut se déchirer ou être autrement endommagée. Plus l'hydrogel est doux, plus il est à risque de dommages pendant la séparation. Enfin, l'utilisateur doit pipette très soigneusement lors de l'échange de médias au cours de l'ensemencement et la culture des HESC sur les hydrogels à motifs. Les HESC restent lâchement respectés tout au long du protocole et les colonies à motifs peuvent être facilement perturbées par des tuyaux négligents ou précipités.
En plus des étapes critiques mentionnées ci-dessus, il y a un certain nombre d'autres étapes qui peuvent nécessiter des modifications et des dépannages lors de l'adaptation de ce protocole pour différentes applications. Alors que les modèles démontrés ici sont sur l'échelle de longueur de centaines de microns à un millimètre, la génération de caractéristiques à motifs sur les gaufrettes de silicium avec des masques photode transparence et photoresist négatif permet de tailles de fonctionnalités tout le chemin jusqu'à 7-10 'm. Ainsi, ce protocole pourrait être adapté pour confiner la géométrie des cellules simples ou des colonies plus petites de quelques cellules sur des substrats conformes.
Deux paramètres qui nécessiteront probablement une optimisation lors de l'adaptation de ce protocole pour différents types de cellules sont le type de ligand ECM utilisé et la concentration du ligand en solution lors de l'adsorption à la couverture de verre à travers les pochoirs. Une concentration totale de ligands de 250 g/mL était suffisante pour produire des modèles homogènes de matrigel et faciliter l'attachement des HESC(figure 1B et figure 2), bien qu'il puisse être possible d'obtenir des résultats similaires avec des Concentrations. D'autre part, il peut être nécessaire d'augmenter davantage la concentration de ligand pour les types de cellules qui sont moins adhérents ou pour des applications qui nécessitent des temps d'incubation plus courts. Une concentration accrue de ligand peut également être nécessaire pour différents ligands ECM, tels que la fibronectine ou le collagène, qui sont moins hydrophobes que le matrigel et ne peuvent donc pas adsorb à l'hydrogel aussi fortement. Étant donné que le transfert de ligand de la couverture à l'hydrogel se produit lors de la polymérisation de l'hydrogel, les techniques couramment utilisées pour relier solidement le ligand ECM à la surface de l'hydrogel (comme le traitement sulfo-SANPAH) sont impossibles. L'utilisation de ligands ECM étiquetés fluorescents pour permettre la visualisation des modèles à chaque étape du protocole est extrêmement utile lors de l'optimisation et du dépannage de ces paramètres.
En outre, le protocole pour les cellules d'ensemencement peut nécessiter une optimisation en fonction du type de cellule et des conditions des médias utilisés. Pour les cellules qui adhèrent plus rapidement ou plus efficacement, une densité d'ensemencement plus faible peut être nécessaire pour prévenir les adhérences cellulaires qui s'étendent entre les modèles et donnent des agrégats plutôt que des colonies de monocouches à motifs. Pour les cellules qui présentent un attachement très faible, une plus grande densité d'ensemencement ou une plus longue période de temps avant l'échange initial de médias peut être nécessaire pour faciliter la formation complète de colonies confinées (figure 4B).
La principale limitation de cette méthode est sa complexité technique, qui se traduit par des résultats relativement faibles par rapport à des méthodes similaires qui impliquent la culture des cellules sur des substrats de verremodelé8. Cependant, cet inconvénient est largement compensé par la pertinence physiologique obtenue par la culture des colonies hESC confinées sur des substrats conformes. En récapitulant efficacement les propriétés mécaniques de l'embryon précoce, nous sommes en mesure de mieux modéliser et comprendre les processus qui mènent à l'auto-organisation des couches germinales primaires.
Un autre avantage de confiner les colonies hESC sur les hydrogels polyacrylamide est qu'il permet l'utilisation de TFM pour examiner le lien entre l'organisation d'une colonie hESC, comme un modèle de l'embryon précoce, et la distribution des forces générées par les cellules qui peuvent sous-tendent la morphogénèse et la spécification du destin cellulaire. Les colonies de hESC confinants entraînent des distributions de contraintes de traction qui dépendent de la géométrie des colonies (figure 3B). Malgré la non-uniformité de ces contraintes de traction, les cellules des colonies demeurent pluripotentes dans des conditions d'entretien(figure 3C). Cependant, nous émettons l'hypothèse que les distributions de stress de traction peuvent être impliquées dans la régulation des modèles de spécification de destin cellulaire en accordant la réponse aux signaux d'induction, tels que les morphogènes solubles. Nous prévoyons que cette méthode nous permettra, ainsi qu'à d'autres groupes, de mieux modéliser l'embryon humain précoce avec des HESC, ce qui permettra de mieux comprendre les processus fondamentaux qui sous-tendent l'embryogenèse humaine.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à souligner le financement de la subvention RB5-07409 du CIRM. J.M.M. tient à remercier FuiBoon Kai, Dhruv Thakar et Roger Oria pour les différentes discussions qui ont guidé la génération et le dépannage de cette méthode. J.M.M. remercie également la bourse de découverte de l'UCSF pour le soutien continu de son travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
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