Summary
Ekstracellulære matrix ligander kan mønstrede på polyacrylamid silicagelrogeler for at muliggøre kulturen af humane embryonale stamceller i indelukkede kolonier på kompatible substrater. Denne metode kan kombineres med Traction Force mikroskopi og biokemiske analyser for at undersøge samspillet mellem vævs geometri, celle genererede kræfter og skæbne specifikation.
Abstract
Humane embryonale stamceller viser en unik evne til at reagere på morfogener in vitro ved selvorganiserende mønstre af celle skæbne specifikation, der svarer til primær kimlag dannelse under embryogenese. Således, disse celler repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at undersøge de mekanismer, der kører tidligt menneskelig udvikling. Vi har udviklet en metode til dyrkning af humane embryonale stamceller i lukkede kolonier på kompatible substrater, der giver kontrol over både Koloniernes geometri og deres mekaniske miljø for at rekapitulere de fysiske parametre, der ligger til grund for embryogenesis. Det vigtigste træk ved denne metode er evnen til at generere polyacrylamid silicagelrogeler med definerede mønstre af ekstracellulære matrix ligand på overfladen for at fremme celle fastgørelse. Dette opnås ved fabrikning stencils med de ønskede geometriske mønstre, ved hjælp af disse stencils til at skabe mønstre af ekstracellulære matrix ligand på glas dæksedler, og overføre disse mønstre til polyacrylamid silicagelrogeler under polymerisering. Denne metode er også kompatibel med Traction Force mikroskopi, så brugeren kan måle og kort fordelingen af celle-genererede kræfter inden for de lukkede kolonier. I kombination med standard biokemiske assays, kan disse målinger bruges til at undersøge den rolle mekaniske signaler spiller i skæbne specifikation og morfogenese under tidlig menneskelig udvikling.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) holder stort løfte om anvendelse i regenerativ medicin og vævsteknik applikationer. Den pluripotente karakter af disse celler giver dem mulighed for at differentiere sig til enhver voksen celletype. Mens der er gjort store fremskridt med hensyn til at dirigere hESCs skæbne til bestemte celletyper, har det været meget vanskeligt at generere hele væv eller organer de Novo1,2,3,4, 5. Dette skyldes for en stor del, at en begrænset forståelse af de mekanismer, der drev dannelsen af disse væv under menneskelig udvikling. For at udfylde dette hul i viden er der i de senere år blevet udviklet en række metoder til at modellere det tidlige embryon og de efterfølgende udviklingsstadier med embryonale stamceller6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kort efter afledningen af de første hESC linjer14, blev det påvist, at embryooide organer dannet af hESCs var i stand til spontant at producere celler af de tre primære kimlag6. Men på grund af den iboende mangel på kontrol over størrelsen og morfologi af embryooid organer, organiseringen af kimlag varierede betydeligt og undlod at matche organiseringen af det tidlige embryo. For nylig, Warmflash et al. udviklet en metode til at begrænse kolonier af hESCs på glas substrater via micropatterning, der giver kontrol og konsistens over størrelsen og geometri af kolonierne8. I nærværelse af BMP4, en vigtig morphogen i tidlig udvikling, disse lukkede kolonier var i stand til selv at organisere reproducerbare mønstre specifikation til skæbner, der repræsenterer de primære kimlag. Selv om dette gav en nyttig model for at studere de mekanismer, som primære kimlag er etableret, de mønstre af skæbne specifikation ikke præcist matche organisationen og morfogenesis observeret under embryo Genesis15. En mere trofast rekapitaliering af tidlig fosterudvikling blev opnået ved at indlejre hESCs i en tredimensionel ekstracellulær matrix (ECM) af matrigels11, hvilket giver de stærkeste beviser til dato for evnen af hESCs til selv-organisere og model de tidlige stadier af embryogenese ex vivo. Men denne metode giver inkonsekvente resultater og er derfor uforenelig med en række analyser, der kunne bruges til at afsløre de underliggende mekanismer for selvorganisering og skæbne specifikation.
I betragtning af disse eksisterende metoder og deres respektive begrænsninger søgte vi at udvikle en metode til reproducerbart dyrkning af hESC-kolonier af definerede geometrier under forhold, der modellere det ekstracellulære miljø i det tidlige embryon. For at opnå dette, brugte vi polyacrylamid silicagelrogeler af tunbar elasticitet til at kontrollere de mekaniske egenskaber af substratet. Ved hjælp af atomkraften mikroskopi på gastrulation-Stage kylling embryoner, vi fandt, at elasticiteten i epiblast varierede fra hundredvis af Pascal til et par kilopascals. Derfor fokuserede vi på at generere polyacrylamid silicagelrogeler med elasticitet i dette interval for at fungere som substrat for hesc-kolonier. Vi ændrede vores tidligere metoder til dyrkning af hESCs på polyacrylamid silicagelrogeler7,9 for at give solid kontrol over koloniens geometri. Vi opnåede dette ved første mønstring ECM ligands, nemlig matrigel, på glas dæksedler gennem mikrofremstillede stencils, som tidligere rapporteret16. Derefter designede vi en ny teknik til at overføre det mønstrede ligand til overfladen af polyacrylamid silicagelrogeler under Polymeriseringen. Den metode, vi beskriver her, involverer brug af fotolitografi til at fabrikere en silicium wafer med de ønskede geometriske mønstre, skabe stempler af disse geometriske egenskaber med Polydimethylsiloxan (PDMS), og ved hjælp af disse stempler til at generere de stencils, der i sidste ende tillader mønstret af ligand på overfladen af glas dæksedler og overførsel til polyacrylamid.
Ud over at rekapitulere det mekaniske miljø i det tidlige embryon gør det at begrænse hESC-kolonier på polyacrylamid det muligt at målecelle genererede kræfter med trækkraft mikroskopi (TFM), som rapporteret i vores tidligere metode9. Kort sagt kan fluorescerende perler indlejres i polyacrylamid og anvendes som fiducial markører. Celle genererede kræfter beregnes ved at afbilde forskydningen af disse perler efter såning af hESCs på det mønstrede substrat. Desuden kan de resulterende trækkraft kort kombineres med traditionelle assays, såsom immun farvning, at undersøge, hvordan fordelingen af celle-genererede kræfter i lukkede hESC kolonier kan regulere eller moduere downstream signalering. Vi forventer, at disse metoder vil afsløre, at mekaniske kræfter spiller en afgørende rolle i mønstret af celle skæbne specifikation under tidlig fosterudvikling, der i øjeblikket overset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her vedrørende brugen af hESCs er blevet godkendt af human gamete, embryo og stamcelleforskning (GESCR) udvalg på University of California San Francisco.
1. fremstilling af silicium wafer med geometriske egenskaber
- Opret en Mask med ønskede geometriske egenskaber. Brug computerstøttet redaktionel software til at designe funktionerne. Til brug med negative photoresist, gøre funktioner uigennemsigtige og resten af masken gennemsigtig.
Bemærk: til mønster på 18 mm diameter dæksedler, gruppe funktioner for hver eksperimentel tilstand i 10 x 10 mm områder for at sikre, at stencils genereret i trin 3 passer på dæksedlerne. - Spin coat negative fotoresist på en 100 mm silicium wafer. Brug fotoresist-databladet til at bestemme hastigheden og længden af spin for at generere en filmtykkelse på 100-250 μm.
Bemærk: filmens tykkelse skal justeres således, at størrelsesforholdet af bredden af mønstrene til højden af stencilen er så tæt på 1:1 som muligt. Vi anbefaler dog en minimumstykkelse på 100 μm, da noget mindre producerer sarte stencils, der nemt rives ned. - Behandl fotoresist i henhold til produktdatabladet. Dette indebærer typisk en blød bage, UV eksponering med Mask i en maske aligner, post eksponering bage, udvikling, og hård bage. Som et eksempel er den procedure, der anvendes til at behandle de wafere, der anvendes i denne protokol, skitseret i tabel 1.
Bemærk: Vær forsigtig, når du håndterer silicium wafere, da de er skrøbelige. Når det er genereret, wafere kan bruges gentagne gange, så længe de ikke er beskadiget.
2. klargøring af dæksedler
-
Fremstilling af syre vasket "top" dæksedler
- Placer en diameter på 18 mm #1 tykkelse i en glaspetri skål. Det korrekte antal dæksedler afhænger af parabol størrelsen. For en 100 mm skål, Forbered 50-100 dæksedler ad gangen. Volumen beløb givet gennem resten af dette afsnit svarer til en 100 mm parabol.
- Tilsæt 20 mL 1 M HCl til Petri skålen og Ryst forsigtigt skålen for at sprede dæksedlerne. Sørg for, at alle dæksedler er nedsænket, og frigør luftbobler mellem dæksedlerne. Inkuber natten over ved stuetemperatur med blid rystning.
Forsigtig: HCl er sur og ætsende. Vær forsigtig og bær passende PV, mens du arbejder med HCl. - Decant HCl fra skålen. Der tilsættes 20 ml ultrarent vand og vaskes med blid omrystning i 10 min. kassér vand og Gentag for i alt fem skyller.
- Efter kassere den endelige vask tilsættes 20 mL 100% ethanol til skålen. Ved hjælp af pincet skal du fjerne dæksedlerne enkeltvis og arrangere mellem to stykker filtrerpapir for at tørre.
- Opbevar tørrede dæksedler i en forseglet beholder. Syrevaskede dæksedler kan tilberedes på forhånd og opbevares i en måned eller længere i støvfri forhold.
-
Fremstilling af glutaraldehyd-aktiverede "bund" dæksedler
Bemærk: Se tidligere metoder for yderligere detaljer7,9.- Placer en diameter på 18 mm #1 tykkelse i en Petri skål.
- Tilsæt 20 mL 0,2 M HCl til Petri skålen og Ryst forsigtigt skålen for at sprede dæksedlerne. Sørg for, at alle dæksedler er nedsænket, og frigør luftbobler mellem dæksedlerne. Inkuber natten over ved stuetemperatur med blid rystning.
- Decant HCl fra skålen. Der tilsættes 20 ml ultrarent vand og vaskes med blid omrystning i 10 min. kassér vand og Gentag for i alt fem skyller.
- Efter kassning af den endelige vask tilsættes 20 mL 0,1 M NaOH og rystes forsigtigt for at sprede og under flette dæksedler. Inkuber ved stuetemperatur med blid omrystning i 1 time.
- Decant NaOH fra skålen. Der tilsættes 20 ml ultrarent vand og vaskes med blid omrystning i 10 min. kassér vand og Gentag for i alt fem skyller.
- Efter kassning af den endelige vask tilsættes 20 ml af en 1:200 fortynding af 3-aminopropyltrimethoxysilane i ultrarent vand og rystes forsigtigt for at sprede og nedsænkes dæksedler. Inkuber ved stuetemperatur med blid omrystning i 1 time eller natten over.
Forsigtig: 3-aminopropyltrimethoxysilane er brændbart og kan forårsage hudirritation. Håndter med omhu, bær passende PV og kassér affald i henhold til lokale bortskaffelses regler. - Decant den fortyndede 3-aminopropyltrimethoxysilane opløsning fra skålen. Der tilsættes 20 ml ultrarent vand og vaskes med blid omrystning i 10 min. kassér vand og Gentag i alt mindst fem skyller. Det er vigtigt at fjerne alle 3-aminopropyltrimethoxysilane før du fortsætter.
- Efter udsmid af den endelige vask tilsættes 20 mL af en 1:140 fortynding på 70% glutaraldehyd i fosfatbuffer saltvand (PBS) og rystes forsigtigt for at sprede og nedsænkes dæksedler. Inkuber ved stuetemperatur med blid omrystning i 1 time eller natten over.
Forsigtig: 70% glutaraldehyd er giftigt og kan forårsage hudirritation. Håndter med omhu, bær passende PV og kassér affald i henhold til lokale bortskaffelses regler. - Fortyndet glutaraldehyd opløsning fra skålen. Der tilsættes 20 ml ultrarent vand og vaskes med blid omrystning i 10 min. kassér vand og Gentag for i alt fem skyller.
- Efter kassere den endelige vask tilsættes 20 mL 100% ethanol. Ved hjælp af pincet skal du fjerne dæksedlerne enkeltvis og arrangere mellem to stykker filtrerpapir for at tørre.
- Opbevar tørrede dæksedler i en forseglet beholder. Glutaraldehyd-aktiverede dæksedler kan tilberedes på forhånd og opbevares i op til seks måneder.
3. generering af stencils til mønstret ECM ligand
- Generering af Polydimethylsiloxan (PDMS) mellemliggende frimærker
- Bland PDMS base med PDMS hærdende middel ved en 10:1 ratio, efter vægt. Bland grundigt.
Bemærk: ved den første anvendelse af PDMS skal der forberedes ca. 100 g PDMS til at fylde en 100 mm skål. For efterfølgende applikationer, fjerne PDMS fra kun midten af skålen, hvor silicium wafer funktioner er placeret og forberede 20-30 g nye PDMS. - Degas PDMS blandingen i en ekssikkator til 30-60 min eller indtil alle luftbobler er fjernet.
- Placer den modificerede silicium wafer fra trin 1 i en plastik 100 mm skål. På overfladen af waferen hældes PDMS-blandingen langsomt og jævnt. Tryk på skålen på arbejdsoverfladen for at frigøre eventuelle luftbobler fra overfladen af waferen.
- Degas PDMS blandingen hældes over wafer i 10 min eller indtil alle luftbobler er fjernet eller er kommet til overfladen af PDMS.
- Bages PDMS ved 70 °C i 2 timer. lad det køle af til stuetemperatur.
- Ved hjælp af en skalpel eller box cutter skæres afsnittet af PDMS fra midten af skålen, der indeholder de geometriske funktioner.
- Opskær PDM'ER i ca. 10 x 10 mm firkanter, der hver indeholder funktionerne for en enkelt eksperimentel tilstand. Disse betegnes som "frimærker" i de efterfølgende trin i protokollen.
- Bland PDMS base med PDMS hærdende middel ved en 10:1 ratio, efter vægt. Bland grundigt.
- Generering af flade plader af PDMS
- Bland PDMS base med PDMS hærdende middel ved en 8:1 ratio, efter vægt. Forbered ca. 20 g for hver 100 mm skål, der skal anvendes. Bland grundigt.
- Degas PDMS blandingen i en ekssikkator til 30-60 min eller indtil alle luftbobler er fjernet.
- Derefter hældes PDM'ER langsomt og jævnt i en ren 100 mm skål. Tryk på skålen på arbejdsoverfladen for at frigøre eventuelle luftbobler.
- Bages PDMS ved 70 °C i 2 timer. lad det køle af til stuetemperatur.
- Fjern PDMS fra skålen. Inverter sådan, at overfladen af PDMS, der var i kontakt med bunden af skålen vender opad.
- For hvert stempel genereret i trin 3,1, skæres en 15 x 15 mm kvadrat af PDMS. Disse omtales som "flade plader" i de efterfølgende trin i protokollen.
- Generering af stencils
- Arranger flade plader af PDMS på låget på en 150 mm skål eller en anden flad overflade for nemmere håndtering. Sørg for tilstrækkelig afstand mellem plader (f. eks. til en 150 mm skål, Arranger ni flade plader med jævnt mellemrum).
- Inverter hvert stempel genereret i trin 3,1 på en flad plade af PDMS, således at funktionerne på stemplet er i kontakt med den flade plade af PDMS. Tryk forsigtigt på toppen af stemplet med pincet for at sikre selv kontakt.
- Forsigtigt prop låget holder PDMS stempel/slab par op på bunden af skålen, således at låget hviler i en vinkel. Dette hjælper den fugtspredende af UV-helbredelig polymer i næste trin.
- Placer en lille dråbe UV-helbredelig polymer på den øverste grænseflade for hvert stempel/slab-par. Polymeren vil være ond mellem de to ved overfladespænding, bistået af tyngdekraften.
Bemærk: mange forskellige UV-helbredelig polymerer kan arbejde i denne protokol. Vi valgte Norland Optical klæbemiddel 74 for følgende egenskaber: i) hurtig hærdning ved udsættelse for UV-lys, II) nem fjernelse fra PDMS frimærker ved hærdning, III) robust vedhæftning til glas dæksedler med manuelt tryk. - Når polymeren har været helt ond igennem, Placer låget med stempel/slab par fladt på arbejdsoverfladen. Placer en lille dråbe UV-helbredelig polymer på hver af de resterende tre sider af hver stempel/slab-grænseflade.
- Brug en 200 μL pipettespids til at forbinde dråber af polymer omkring kanterne af stempel/slab-grænsefladen. Derved oprettes en kant, der holder ligand-løsningen i trin 4.
Bemærk: Vær forsigtig, når du arbejder polymeren omkring kanterne af stemplet. Hvis stemplet/slab-grænsefladen afbrydes, vil polymeren væge Underfunktionerne, og stencilen vil ikke danne sig ordentligt. - Placer forsigtigt stempel/slab-parrene i en UV-steriliserings boks. Brug den sterile "Str"-effektindstilling, og Udsæt den i 10 minutter.
- Fjern stempel/slab-par fra UV-steriliserings boksen. Ved hjælp af to par pincet fjerner du forsigtigt PDMS-stemplet, mens du holder den flade plade og stencil, der dannes fra den UV-helbredelig polymer.
- Ved hjælp af pincet skal du forsigtigt fjerne stencilen og invertere den, så den overflade, der var i kontakt med den flade plade af PDMS, vender opad.
Bemærk: stencilerne er sarte. Vær forsigtig, mens du afleverer dem, især mens du oprindeligt fjerne dem fra PDMS, så de ikke rive. - Placer de inverterede stencils tilbage i en UV-steriliserings boks. Brug den sterile "Str"-effektindstilling, og Udsæt den i 3 min.
4. mønstret ECM ligand på dæksedler
-
Presning af stencils på syrevaskede dæksedler
- Anbring en syre vasket dækseddel for hver stencil på et rent stykke laboratorie film.
- Brug pincet, Placer forsigtigt hver stencil, flad side ned, på en syre-vasket dækseddel. Sted, så funktionerne er centreret på coversedlen.
- Placer et lille stykke laboratorie film oven på hver stencil. Fast og jævnt Tryk ned på stencilen for at skabe stærk kontakt mellem stencilen og coversedlen.
Bemærk: dette er et kritisk skridt! Tryk fast og på tværs af hele overfladen af stencilen. Hvis der ikke oprettes tilstrækkelig kontakt, vil ligand-løsningen lække mellem stencilen og dæksedlerne, og mønstret vil mislykkes. Valgfrit: for at bekræfte tilstrækkelig kontakt mellem stencilen og dæksedlen skal du afpipettere 100 μl ultrarent sterilt vand på overfladen af hver stencil og inkubere ved stuetemperatur. Efter 1 time, tjek for lækage. Aspirere vand fra succes bundne stencils og fortsætte.
-
Plasma rengøring af overfladen af de stenciled dæksedler for at øge hydrophilicity
- Anbring dæksedlerne med stencils i en plasma renser. Anvend høj effekt plasma til 30 s.
-
Klargøring af ECM-ligand-opløsning
Bemærk: alle efterfølgende trin skal gennemføres under sterile forhold, hvis det er muligt.- Placer sterile 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 opløsning på is. Når iskold, tilsættes matrigel og kollagen for at opnå koncentrationer på henholdsvis 225 μg/mL og 25 μg/mL. Valgfrit: for fejlfinding eller for ligand visualisering, Medtag en fluorescently Tagged ligand i ligand løsning.
- Bemærk: forskellige ECM-ligander kan bruges med denne metode. For forskellige ligands kan yderligere optimering være nødvendig for at bestemme ideel koncentration, inkubationstid, og inkubationstemperatur. Se diskussionsafsnittet for at få flere oplysninger.
- Afpipettér ligand-opløsningen på overfladen af hver stencil. For stencils lavet af 10 x 10 mm firkantede frimærker, anvende 100 μL pr stencil.
- Kontroller, om der er luftbobler i stencil funktioner. Brug om nødvendigt fintippet pincet eller en 2 μL pipettespids for at fjerne luftbobler fra funktioner.
Bemærk: dette er et kritisk skridt! Hvis luftbobler forbliver fanget på overfladen af dæksedlen, vil ligand ikke adsorbseres til overfladen, og det resulterende mønster vil være ufuldstændig. - Placer de stenciled dæksedler med ligand i en skål, wrap med laboratorie film, og Inkuber ved 4 °C natten over.
- Placer sterile 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 opløsning på is. Når iskold, tilsættes matrigel og kollagen for at opnå koncentrationer på henholdsvis 225 μg/mL og 25 μg/mL. Valgfrit: for fejlfinding eller for ligand visualisering, Medtag en fluorescently Tagged ligand i ligand løsning.
5. overførsel af ligand til polyacrylamid gel
- Fjernelse af ligand-løsning og stencil fra hver dækglas
- Aspirer ligand-opløsningen fra overfladen af en stencil. Ligand-opløsningen kan opsamles og opbevares ved 4 °C og genbruges i op til en måned.
- Ved hjælp af pincet skal du kortlægge dæksedlen med stencilen i en skål, der indeholder steril PBS til vask.
- Kort Nedsænk dækglas med stencil i en anden skål af sterile PBS at vaske.
- Fjern stencilen fra overfladen af coversedlen. Vær omhyggelig med ikke at bryde dæksedlen.
- Nedsænk kort coveret i en skål, der indeholder ultrarent sterilt vand, for at fjerne salte fra PBS-vaskene. Tryk på kanten af coveret til en delikat opgave sletning for at væge overskydende vand væk.
- Tør dæksedlen af med en inaktiv gas, såsom nitrogen. Markér undersiden af dæksedlen for at holde styr på retningen fra dette punkt fremad. Vær omhyggelig med at holde mønstrede side opad.
- Gentag trin 5.1.1 til 5.1.6 for hver stenciled Cover liste.
- Fremstilling af polyacrylamid silicagelrogeler med mønstrede dæksedler
Bemærk: Se tidligere metoder for yderligere detaljer7,9 Steriliser alle hætte holdere, rør og spacere, der bruges til at lave polyacrylamid geler ved vask med 10% blegemiddel natten over, skylning med vand mindst fem gange for at fjerne blegemiddel, og vask kortvarigt i 70% ethanol. Placer alle brikker på sarte opgave servietter i en steril biosikkerhed kabinet til at tørre før brug.- Tilbered polyacrylamid opløsning for at opnå den ønskede hydrogel elasticitet (tabel 2). Bland alle komponenter undtagen fluorescerende mikrosfærer og kalium persulfat (PPS).
Bemærk: Forbered 1% kalium persulfat opløsning frisk hver gang. - Degas polyacrylamid opløsning, mikrokugler, og PPS i separate rør under vakuum i 30 min.
- For hver mønstret dækseddel, Forbered en glutaraldehyd-aktiveret "bund" dækseddel med en spacer (18 mm udvendig diameter, 14 mm indvendig diameter) placeret på toppen.
- Efter afgasning, kort soniklere mikrokugler og tilsæt passende volumen til polyacrylamid opløsning. Bland ved pipettering op og ned, at være omhyggelig med ikke at indføre luftbobler. Kortvarigt sonicate.
- Tilsæt en passende mængde PPS til polyacrylamid opløsningen. Pipetten op og ned for at blande opløsningen, idet du er omhyggelig med ikke at indføre luftbobler.
Bemærk: efter tilsætning af PPS, arbejde hurtigt at fuldføre trin 5.2.6 gennem 5.2.11 før polyacrylamid polymeriserer. - Pipetten 75-150 μL (afhængigt af tykkelsen af spacer) til midten af hver glutaraldehyd-aktiverede Cover seddel.
- Brug pincet til at anbringe et mønstret dækstykke på hver glutaraldehyd-aktiverede dækseddel med polyacrylamid og spacer, således at det mønstrede ligand vender mod polyacrylamid opløsningen. Hvis der tilsættes tilstrækkelig polyacrylamid opløsning, vil overfladespændingen væge polyacrylamid mellem de to dæksedler, og ingen luftbobler vil være til stede.
- Pick up hver polyacrylamid "sandwich" og forsigtigt røre ved siden til en delikat opgave tørre at væge væk overskydende polyacrylamid opløsning.
- Placer forsigtigt hver polyacrylamid "sandwich" i en hætte holder med tråde, der er kompatible med 15 mL koniske bund rør. Retningen skal være således, at bunden af glutaraldehyd dæksedlen er i kontakt med bunden af hætten holderen, og den mønstrede dækseddel er på toppen.
- Skru en 15 mL konisk-bund slange ind i hver hætte holder for at holde polyacrylamid "sandwich" på plads. Rørene skal være stramme for at undgå lækage, men vær omhyggelig med ikke at over stramme og knække dæksedlerne.
- Centrifuger polyacrylamid "sandwich" i rørene i sving-spande ved 200 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern rørene fra centrifugen og Placer dem i Rørstativer for at opretholde retningen for yderligere 50 min for at sikre fuld polymerisering. Opbevares dækket med folie for at forhindre blegning af fluorescerende mikrosfærer.
Bemærk: centrifugering er afgørende, når du bruger denne metode til at udføre TFM. Centrifugal kraften flytter alle mikrosfærerne til et enkelt plan, som i sidste ende vil være lige under overfladen af hydrogel. Dette er ideelt til billeddiagnostiske mikrosphere forskydninger, der bruges til at beregne celle genererede trækkraft belastninger. Hvis der ikke udføres TFM, kan mikrosfærerne lades ud af polyacrylamid opløsningen, og polymerisering kan forekomme i stationære uden centrifugering. - Fjern polymeriseret polyacrylamid "sandwich" fra rørene og Nedsænk i PBS i en 100 mm skål. Pak i laboratorie folie og Inkuber i 3 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
- Tilbered polyacrylamid opløsning for at opnå den ønskede hydrogel elasticitet (tabel 2). Bland alle komponenter undtagen fluorescerende mikrosfærer og kalium persulfat (PPS).
- Fremstilling af mønstrede geler til såning af celler
- Brug en skalpel og tang til forsigtigt at fjerne den mønstrede dækseddel og spaceren fra polyacrylamid "sandwich", mens den forbliver nedsænket i PBS. Den mønstrede ligand vil have overført til polyacrylamid under Polymeriseringen og vil forblive efter fjernelse af dæksedlen. Polyacrylamid-gelen vil forblive fastgjort til den glutaraldehyd-aktiverede dækseddel.
Bemærk: dette er et kritisk skridt! Polyacrylamid skal nedsænkes i PBS, mens dæksedlen fjernes, eller ligand-mønstrene ødelægges. - Anbring hver dækseddel med mønstret polyacrylamid i en hætte holder. Anbring en pakning (18 mm udvendig diameter, 14 mm indvendig diameter) oven på dæksedlen og omkring polyacrylamid, hvor afstandsstykket er placeret. Skru en Save-off 15 mm konisk-bund rør ind i hætten holderen, danner en brønd med mønstret polyacrylamid i bunden. Disse samlinger passer ind i brøndene af en standard 12-brønd plade for nem håndtering.
- Vask hver gel ved at tilsætte 500 μL PBS til brønd samlingen. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur med blid rystning. Fjern PBS og Gentag to gange for i alt tre skyller.
- Efter den sidste PBS vask tilsættes 500 μL knockout-DMEM-medier til gels og Inkuber ved 37 °C natten over. Geler kan opbevares ved 37 °C med medier i op til 5 dage før såning celler.
- Dagen før såning celler, Udskift knockout-DMEM for komplette KSR medier og inkubere ved 37 °C natten over.
- Brug en skalpel og tang til forsigtigt at fjerne den mønstrede dækseddel og spaceren fra polyacrylamid "sandwich", mens den forbliver nedsænket i PBS. Den mønstrede ligand vil have overført til polyacrylamid under Polymeriseringen og vil forblive efter fjernelse af dæksedlen. Polyacrylamid-gelen vil forblive fastgjort til den glutaraldehyd-aktiverede dækseddel.
6. dyrkning af hESCs på mønstrede geler
Bemærk: Hvis du planlægger at fastsætte prøver til immun farvning efter TFM, skal du tage billeder af ustressede mikrosphere positioner forud for såning celler. I dette tilfælde skal fluorescently Tagged ligand anvendes i trin 4.3.1, således at de eventuelle placeringer af celler vil være kendt før såning og mikrosfærer kan afbildet i disse regioner.
- Vedligehold lager hESC-kulturer og sekundære feeder-frie kulturer tilberedt på matrigel-belagte plader i konditionerede KSR-medier før såning på mønstrede polyacrylamid-geler som tidligere beskrevet9.
Bemærk: Generer konditionerede KSR-medier ved at dyrkning bestrålet mus embryonale fibroblaster i KSR medier suppleret med 4 ng/ml grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bfgf). Saml og Udskift medierne hver 24 h. - Aspirere medierne fra hESCs. Vask kortvarigt med knockout-DMEM-mediet. Tilsæt 0,05% trypsin-EDTA suppleret med 10 μM Y27632 (Rho kinasehæmmer) og Inkuber ved 37 °C i 5-10 min.
- Tilsæt medier med serum for at hæmme trypsin. Aspirér forsigtigt mediet og pipetten over skålen for at fjerne cellerne. Fortsæt pipettering forsigtigt for at fjerne alle celler og dissociere celle klynger til enkeltceller.
- Opsaml cellesuspensionen og centrifugeres ved 200 x g i 3 min.
- Aspirér supernatanten, og resuspender pellet i et tilsvarende volumen af KSR-medier for at vaske. Centrifugeres ved 200 x g i 3 min.
- Aspirér supernatanten og resuspension pellet i konditioneret KSR medier suppleret med 10 ng/mL bFGF og 10 μM Y27632.
- Tæl cellerne med et hemocytometer og Juster cellesuspensionen til en koncentration på 300.000 celler pr. mL. Pipette 500 μL af cellesuspensionen på hver mønstrede gel (150.000 celler pr. gel).
- 3 h efter såning skal du bruge en pipette til forsigtigt at aspirere mediet fra hver gel og udskifte med frisk konditioneret KSR-medie suppleret med 10 ng/mL bFGF og 10 μM Y27632. Dette fjerner overskydende celler, der ikke overholder mønstrede områder af polyacrylamid.
Bemærk: dette er et kritisk skridt! På dette stadium celler vil blive løst overholdt den mønstrede ligand. Vær meget forsigtig, når du bytter medier til ikke at løsne cellerne. Der bør udvises samme omhu med hver af medie swaps i de efterfølgende trin. - 24 timer efter såning, brug en pipette til forsigtigt at aspirere medierne og udveksling for konditioneret KSR-medier suppleret med 10 ng/mL bFGF og 5 μM Y27632.
- 48 h efter såning, brug en pipette til forsigtigt at aspirere medierne og udveksling for konditioneret KSR-medier suppleret med 10 ng/mL bFGF. Dette fjerner Rho kinase-hæmmer fra medierne og eksperimenter kan begynde den næste dag, 72 h efter såning.
7. udførelse af TFM
- Når det ønskes, udføres TFM som tidligere beskrevet9 under de ønskede forsøgsbetingelser.
- Hvis ustressede mikrosphere positioner blev afbildet før såning celler, fastsætte cellerne efter at have taget stressede mikrosfæren positioner og udføre immun farvning for at bestemme lokalisering af proteiner af interesse i forhold til regioner med høje og lave trækkraft kræfter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den største udfordring at overvinde i forsøget på at kultur hESCs i kolonier af kontrolleret geometri på kompatible substrater er at generere et homisk mønster af ECM-ligand på overfladen af substratet. Den strategi, der præsenteres i denne metode, indebærer først at generere det ønskede mønster på overfladen af en glas dækseddel og derefter overføre dette mønster til overfladen af en polyacrylamid hydrogel under polymerisering af gelen (figur 1 A). det er således vigtigt at sikre, at det ønskede mønster skabes med succes på overfladen af glas coveret, før der fortsættes med polymerisering af hydrogel og overførsel af mønsteret (figur 1B). Baseret på Imaging af fluorescerende ligand mønstre overføres til polyacrylamid, ligand synes at være til stede kun i et enkelt plan på overfladen af polyacrylamid, selv om vi ikke præcist karakterisere tykkelsen af dette lag. Der er to almindelige typer af defekter observeret efter mønster generation på glasset coverslip, hver med sin egen kilde til fejl. Den første er udseendet af fluorescerende ligand strækker sig ud over margenerne af det ønskede mønster (figur 1C, top), som skyldes lækage af fluorescerende ligand løsning på grund af en lille tåre i stencilen eller utilstrækkelig forsegling af stencilen til glas dæksedlen. Den anden er udseendet af et ufuldstændigt mønster (figur 1C, bund), som typisk skyldes en luftboble fanget ved dækglas-grænsefladen, der forhindrer adsorptions af det fluorescerende ligand.
Det ultimative mål for succes for denne metode er evnen til at kultur hESCs i ønskede geometrier på mønstrede silicagelrogeler (figur 2). For at opnå dette seedes hESCs med en relativ høj densitet (300.000 celler/mL) i nærværelse af en Rho kinasehæmmer (Y27632) og inkuberet i 3 timer for at lette vedhæftning til ligand-mønstrene. Mediet erstattes derefter for at fjerne celler, der ikke er overholdt. I løbet af 72 h, er Y27632 gradvist fortyndet ud af medierne ved en række medier udvekslinger på 24 og 48 h efter såning. Typisk, de hESCs formere sig at fuldføre mønstrede geometrier af 48-72 h, således at eksperimenter kan begynde på 72 h efter såning, når Y27632 er helt fjernet fra medierne.
Dyrkning af hESC-kolonier i lukkede geometrier på polyacrylamidhydrogels gør det muligt at målecelle genererede trækkraft styrker ved hjælp af TFM. Disse målinger er lavet ved at indlejre fluorescerende mikrokugler i hydrogel og billeddannelse positionerne af disse perler før og efter såning hESCs (figur 3A). Forskydningen af perlerne efter celle såning er en funktion af celle genererede kræfter og elasticiteten af hydrogel, således at billederne af vulst positionerne kan bruges til at generere kort over vulst forskydninger og derefter anvendes til at beregne den underliggende trækkraft belastninger. I cirkulære kolonier af hESCs, de største trækkraft belastninger findes nær den perifere kant af kolonierne, mens centrum af kolonierne viser ensartet lav trækkraft belastninger (figur 3B). Interessant, de højeste trækkraft belastninger findes i klynger nær kanten af kolonierne, snarere end at danne en kontinuerlig ring af maksimal stress. Dette indebærer, at selv om koloni geometri spiller en central rolle i fastsættelsen af fordelingen af trækkraft belastninger, mere lokaliseret regulering og feedback bestemmer den nøjagtige placering af maksimal stress. Derudover, så længe billedet af mikrosfære positioner uden at blive holdt celler er taget før celle såning, hesc kolonier kan fastsættes for immun farvning af proteiner af interesse efter trækkraft målinger. På trods af de observerede ikke-ensartede fordelinger af trækkraft understreger hESCs, som dyrkes som mønstrede cirkler under vedligeholdelsesforhold, et ensartet udtryk for pluripotens markør Oct3/4 og celle adhæsions molekyle E-cadherin (figur 3C ).
Den præsenterede metode til at bruge stencils til at generere mønstre af ligand er påviseligt bedre end den almindelige teknik til mikrokontakt trykning for de relativt store geometrier, der anvendes i denne metode (dvs. for cirkulære kolonier 1 mm i diameter samt trekanter og kvadrater af tilsvarende område). Mikrokontakt trykning mønstre af ligand på denne længde skala resulterer i heterogene overførsel i kanterne af mønstre, med meget lidt ligand deponeret i de centrale områder af mønstrene (figur 4A). Dette er tydeligvis utilstrækkeligt til konsekvent at producere hESC-kolonier af specifikke geometrier. Reduktion af celle såning tæthed fører også til inkonsistens i at opnå afsluttede kolonier. Celler seedet ved 200.000 celler/mL, snarere end 300.000 celler/mL, er ikke i stand til at generere tilstrækkelige celle celle kontakter til at overleve den reducerede koncentration af Y27632 ved 24 h efter såning (figur 4B). Det kan være muligt at generere komplette mønstre med lavere celle tætheder ved at forlænge perioden med Y27632 fortynding; men generelt er det mere effektivt at frø på de højere 300.000 celler/mL tæthed. Lejlighedsvis bliver fejl i mønster generering, som ikke opdages tidligere i protokollen, synlige ved såning af hESCs. En sådan fejl er lækage af ligand løsning under stencilen på grund af dårlig kontakt med coverslip. Dette resulterer i sidste ende i, at ligand overføres til regioner i polyacrylamid uden for de ønskede geometrier, og en uafgrænset vækst i hESCs ved såning (figur 4C).
Figur 1: mønstret for ECM-ligand på syre vaskede dæksedler og overførsel til polyacrylamidhydrogels. A) skematisk gengivelse af protokollen for mønster ECM-ligand på syrevaskede dæksedler og overførsel af det mønstrede ligand til polyacrylamid-hydrogels. B) Immunofluorescent billeder af mønstret ECM-ligand på syre vaskede dæksedler (til venstre) og efter overførsel til polyacrylamid-hydrogel (til højre). Biotin-Tagged matrigel blev mønstret på dæksedlen og mærket med Alexa fluor 555 streptavidin før overførsel til polyacrylamid. Indsættene viser zoomet ud over de komplette mønstre, der genereres. C) repræsentative fluorescerende billeder, som viser mønstret defekter af ligand på glas dæksedlen. Disse skyldes almindeligt forekommende fejl i protokollen, såsom lækage af ligand-opløsningen uden for den mønstrede geometri (top, pil indikerer lækage sted) og diffusering af luftbobler inde i stencilen mønstrede geometrier ved tilsætning af ligand-opløsningen ( bund, pil indikerer stedet for luftboble). Alle skala stænger = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 2: såning af hESCs på mønstrede polyacrylamidhydrogels. Repræsentative lysfelt-billeder, som viser en vellykket såning af hESCs på polyacrylamid silicagelrogeler med mønstret ligand. Tidslinjen øverst angiver den serie af medieændringer, der bruges til at fjerne ikke-tilknyttede celler og fortynde Y27632. Bemærk, at efter indledende såning, celler klæber stochastisk til forskellige regioner inden for det mønstrede ligand og derefter formere sig til at fylde de mønstrede regioner i løbet af 72 h. Scale bar = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Regional lokalisering af trækkraft belastninger og immunofarvning af lukkede hESC kolonier. A) fluorescerende billeder af mikrokugler inden for polyacrylamid-hydrogel før og efter såning af hESCs. (B) repræsentativt partikel billede velocimetry (PIV) plot skildrer forskydning af mikrokugler på grund af trækkraft belastninger (venstre) og tilsvarende rekonstrueret trækkraft belastninger (højre). C) immunofarvning af lukkede hesc-kolonier på mønstrede polyacrylamidhydrogels, som viser evnen til at sammenligne lokalisering af proteiner af interesse for trækkraft. Alle skala stænger = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ikke-ideelle resultater givet ved alternative metoder og fejl. A) repræsentative lysstofrør billeder af ECM ligand mønstret på syre vaskede dæksedler via mikrokontakttrykning. (B) brightfield billeder af hESCs, der undlader at danne afsluttede kolonier på grund af utilstrækkelig vedhæftning af celler. Store huller tilbage i kolonierne ved 24 timer efter såning (pile) er en tidlig indikator for dette spørgsmål. (C) brightfield billeder af hESCs, der undlader at danne lukkede kolonier på grund af fejl i mønstret, der førte til tilstedeværelsen af ligand uden for de ønskede geometrier. Alle skala stænger = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksempel SU8 wafer fabrikation | |
| 1. spin coat wafer med SU8-3050 | Spin ved 1.000 RPM for 30 s |
| 2. Soft bake wafer på kogepladen | i. 3 min ved 65 °C |
| II. 45 min ved 95 °C | |
| III. 3 min. ved 65 °C | |
| IV. kølig til stuetemperatur | |
| 3. Udsæt i maske aligner | i. Juster wafer og Mask i maske aligner |
| Ii. Eksponere med energi på 250 mJ/cm2 | |
| • F. eks. for lampe med en intensitet på 11 mW/cm2, Udsæt for 23 s | |
| 4. post eksponering bage på kogepladen | i. 1 min. ved 65 °C |
| II. 15 min. ved 95 °C | |
| III. 1 min. ved 65 °C | |
| Iv. Afkøl til stuetemperatur | |
| 5. udvikle | i. agitere i SU8 Developer, ca. 5-10 min. |
| Ii. Tjek udvikling med isopropylalkohol (IPA) | |
| • Hvis underudviklet, vil IPA-skyl producere en hvid rest | |
| 6. hård bage på kogepladen (ekstraudstyr) | 1-2 h ved 150 °C |
Tabel 1: eksempel SU8 wafer fabrikations protokol. Silicium wafere, der bruges til at generere PDMS-stempler og efterfølgende stencils, blev fabrikeret ved hjælp af trinene beskrevet i denne tabel. Denne protokol blev genereret ved hjælp af SU8 3000 databladet med det formål at skabe en filmtykkelse på ca 100-250 μm.
| Formuleringer af polyacrylamid-gel | |||||||||
| Volumener til 1 mL komplet opløsning | |||||||||
| Elastisk modulus (PA) | Endelig% acrylamid | Endelig% bis-acrylamid | ddH2O (μl) | 40% acrylamid (μL) | 2% bis-acrylamid (μL) | 10x PBS (μL) | 1% TEMED i ddH2O (μl) | Mikrosfærer 0,5% tørstof i Hedeselskabet2O (μl) | 1% KKS i ddH2O (μl) |
| 1050 | 3 | 0,1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7,5 | 0,035 | 485 | 187,5 | 17,5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7,5 | 0,05 | 477,5 | 187,5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7,5 | 0,07 | 467,5 | 187,5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
Tabel 2: formuleringer af polyacrylamid-gel. Volumener af komponenter til generering af polyacrylamid silicagelrogeler af forskellige elastiske moduli med fluorescerende mikrokugler til TFM. Volumener kan skaleres op eller ned baseret på mængden af nødvendig polyacrylamid opløsning. Alle komponenter undtagen fluorescerende mikrosfærer og PPS blandes sammen før afgasning. PBS = fosfat-bufferet saltvand, TEMED = tetramethylethylenediamin, PPS = kalium persulfat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at forenkle en lang og detaljeret protokol består denne metode af tre kritiske stadier: 1) generering af ECM ligand på glas dæksedler, 2) overførsel af mønstrene til polyacrylamid silicagelrogeler under Polymeriseringen af gelen og 3) såning af hESCs på mønstrede hydrogel. Der er kritiske skridt, der skal tages i betragtning i hver af disse tre etaper. For at skabe high-fidelity mønstre på glasset dæksedler, skal stencilen være solidt presset på dækglas for at forhindre lækage af ligand opløsning og alle luftbobler skal fjernes efter tilsætning ligand løsning på overfladen af stencilen ( Figur 1C). Hvis ligand-opløsningen lækker gennem stencilen på grund af dårlig kontakt med dæksedlen, vil ligand blive overført til hele overfladen af polyacrylamid-hydrogel, og hESCs vil ikke være begrænset til den ønskede koloni geometri (figur 4C). Det vigtigste trin i overførslen af det mønstrede ligand til polyacrylamid er forsigtigt at adskille den øverste dækseddel fra hydrogel, mens alle komponenter forbliver nedsænket i PBS. Hvis hydrogel ikke forbliver nedsænket under adskillelse, kan mønstrene være fuldstændig ødelagt. Desuden, hvis adskillelsen sker for hurtigt, kan overfladen af hydrogel rive eller blive på anden måde beskadiget. Jo blødere hydrogel, jo mere er det i fare for skader under adskillelse. Endelig skal brugeren pipetter meget omhyggeligt, når de udveksler medier undersåning og kultur af hESCs på mønstrede hydrogels. De hESCs forbliver løst overholdt i hele protokollen, og de mønstrede kolonier kan let forstyrres af uforsigtig eller forhastet pipettering.
Ud over de kritiske trin diskuteret ovenfor, er der en række andre trin, der kan kræve ændring og fejlfinding, når du tilpasser denne protokol til forskellige applikationer. Mens de viste mønstre her er på længden skala af hundredvis af mikron til en millimeter, genererer mønstrede funktioner på silicium wafere med gennemsigtighed photomspørger og negative fotoresist giver mulighed for feature størrelser hele vejen ned til 7-10 μm. Denne protokol kan således tilpasses til at begrænse geometrien for enkeltceller eller mindre kolonier af nogle få celler på kompatible substrater.
To parametre, der sandsynligvis kræver optimering, når denne protokol tilpasses til forskellige celletyper, er den type ECM-ligand, der anvendes, og koncentrationen af ligand i opløsningen under adsorptions til glas coveret gennem stencils. En samlet ligand-koncentration på 250 μg/mL var tilstrækkelig til at producere homogene mønstre af matrigel og lette fastgørelse af hESCs (figur 1B og figur 2), selv om det kan være muligt at opnå lignende resultater med lavere Koncentrationer. På den anden side kan det være nødvendigt yderligere at øge koncentrationen af ligand for celletyper, der er mindre overholder eller for applikationer, der kræver kortere inkubationstider. Øget koncentration af ligand kan også være påkrævet for forskellige ECM-ligands, såsom fibronektin eller kollagen, som er mindre hydrofobe end matrigel og derfor kan ikke adsorbe til hydrogel så stærkt. Fordi overførslen af ligand fra dækglas til hydrogel opstår under Polymeriseringen af hydrogel, er almindeligt anvendte teknikker til robust kryds sammenkædning af ECM-ligand til hydrogel overfladen (såsom sulfo-sanpah-behandling) umulige. Brug af fluorescently-mærkede ECM ligander for at muliggøre visualisering af mønstrene på hvert trin i protokollen er yderst hjælpsom, når optimering og fejlfinding af disse parametre.
Desuden kan protokollen for såning celler kræve optimering afhængigt af celletype og medie betingelser, der anvendes. For celler, der holder sig hurtigere eller mere effektivt, kan det være nødvendigt med en lavere såningstæthed for at forhindre celle sammenvoksninger, der spænder mellem mønstre og resulterer i aggregater i stedet for mønstrede enkeltlags kolonier. For celler, der viser meget dårlig fastgørelse, en større såning tæthed eller længere tid før den indledende medie swap kan være nødvendig for at lette fuldstændig dannelse af indesluttet kolonier (figur 4B).
Den centrale begrænsning af denne metode er dens tekniske kompleksitet, som resulterer i relativt lave gennemløb resultater sammenlignet med lignende metoder, der involverer dyrkning celler på mønstrede glas substrater8. Denne ulempe opvejes imidlertid langt af den fysiologiske relevans, der er opnået ved dyrkning af lukkede hESC-kolonier på kompatible substrater. Ved effektivt at rekapitulere de mekaniske egenskaber af det tidlige embryon, er vi i stand til bedre at modellere og forstå de processer, der fører til selvorganisering af de primære kimlag.
En yderligere fordel ved at begrænse hesc kolonier på polyacrylamid silicagelrogeler er, at det gør det muligt at bruge TFM til at undersøge forbindelsen mellem organiseringen af en hesc koloni, som en model af det tidlige embryon, og fordelingen af celle-genererede kræfter, der kan ligger grund for morfogenesis og celle skæbne specifikation. Begrænser hESC kolonier resulterer i fordelinger af trækkraft belastninger, der er afhængige af koloni geometri (figur 3B). På trods af ikke-ensartethed af disse trækkraft belastninger, celler i hele kolonier forbliver pluripotente i vedligeholdelsesforhold (figur 3C). Men vi hypotese størrelse, at trækkraft stress distributioner kan være involveret i reguleringen af mønstre af celle skæbne specifikation ved tuning reaktionen på induktions signaler, såsom opløselige morfogener. Vi forventer, at denne metode vil gøre det muligt for os og andre grupper bedre at modellere det tidlige menneskelige embryo med hESCs, hvilket fører til en mere fuldstændig forståelse af de grundlæggende processer, der ligger bag menneskelig embryogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende finansieringen fra CIRM Grant RB5-07409. J.M.M. vil gerne takke FuiBoon Kai, Dhruv thakar og Roger Oria for forskellige diskussioner, der guidede generering og fejlfinding af denne metode. J.M.M. også takke UCSF Discovery Fellowship for den løbende støtte af hans arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
