Ett system för att spåra dynamiken i sociala preferenser beteende i små gnagare

Summary

Beskrivs här är ett nytt automatiserat experiment system som erbjuder ett alternativ till tre kammare test och löser också flera varningar. Detta system levererar flera beteendemässiga parametrar som möjliggör rigorös analys av små gnagare beteendemässiga dynamik under social preferens och sociala nyhet preferens tester.

Abstract

Utforska de neurobiologiska mekanismerna i socialt beteende kräver beteendemässiga tester som kan tillämpas på djurmodeller på ett opartisk och observatör oberoende sätt. Sedan början av årtusendet, har tre kammare test använts i stor utsträckning som en standard paradigm för att utvärdera sällhet (social preferens) och sociala nyhet preferens i små gnagare. Emellertid, detta test lider av flera begränsningar, inklusive dess beroende av rumslig navigering och vårdslöshet av beteendemässiga dynamik. Presenteras och validerade här är ett nytt experiment system som erbjuder ett alternativ till tre kammare test, samtidigt lösa några av dess varningar. Systemet kräver en enkel och prisvärd experimentell apparat och allmänt tillgängliga öppen källkod analyssystem, som automatiskt mäter och analyserar flera beteendemässiga parametrar på individ-och populationsnivå. Det möjliggör detaljerad analys av beteendemässiga dynamiken hos små gnagare under någon social diskriminering test. Vi visar effektiviteten i systemet för att analysera dynamiken i socialt beteende under social preferens och sociala nyhet preferens tester som utförs av vuxna manliga möss och råttor. Dessutom validerar vi förmågan hos systemet att avslöja modifierade dynamiken i socialt beteende hos gnagare efter manipulationer såsom morrhår trimning. Sålunda, systemet möjliggör noggrann utredning av socialt beteende och dynamik i små gnagare modeller och stöder mer exakta jämförelser mellan stammar, villkor, och behandlingar.

Introduction

Att avslöja de biologiska mekanismerna bakom neurologiska utvecklingsstörningar (NDDs) är en av de största utmaningarna inom neurovetenskap¹. Att ta itu med denna utmaning kräver beteendemässiga paradigm och experimentella system som kännetecknar beteendet hos gnagare på ett standardiserat och opartisk sätt. En inflytelserik studie publicerad mer än ett decennium sedan av Moy och kollegor² presenterade tre kammare test. Sedan dess har detta test varit allmänt används för att undersöka socialt beteende i gnagare modeller av NDDs. Detta testar utvärderar två medfödda tendenser av gnagare: 1) att bo i närheten av en social stimulans över en anmärka (sociabilityen, också kallat social preferens [SP]) och 2) att föredra närheten av en ny social stimulans över en bekant (social nyhet preferens [SNP])^3,4. Flera efterföljande studier föreslog metoder för automatiserad analys av tre kammartest med hjälp av datoriserade metoder^5,6.

Detta test lider fortfarande av flera varningar. Först undersöker det främst social plats preferens snarare än motivationen i ämnet att direkt interagera med en social stimulans, även om vissa grupper också mäta lukt utredning (sniffa) tid, antingen manuellt⁷ eller använda kommersiella datoriserade system^8,9,10. För det andra, den tre-kammare test används främst för att mäta den totala tid som spenderas av ämnet i varje kammare, och det försummar beteendemässiga dynamik. Slutligen förlitar det sig på endast en aspekt av det sociala beteendet, som är den tid som används av ämnet i varje kammare (eller sniffa tid, om mätt).

Här presenterar vi ett nytt och prisvärt experiment system som är ett alternativ till tre kammar apparater. Det ger också prestanda för samma beteendemässiga tester samtidigt lösa de ovannämnda förbehåll. Det presenterade beteende systemet automatiskt och mäter direkt det undersökande beteendet hos en gnagare mot två stimuli. Dessutom analyserar den beteendemässiga dynamiken i en observatör oberoende sätt. Dessutom, detta system mäter flera beteendemässiga parametrar och analyserar dessa på både individ och populationsnivå; således stöder den en rigorös analys av socialt beteende och dess dynamik under varje test. Dessutom, slumpmässig ompositionering av kamrarna i motsatta hörn av arenan under de olika testfaserna neutraliserar alla effekter av rumsligt minne eller preferens. Detta system kan också användas för andra diskrimineringstest, såsom könsdiskriminering. Den anpassade apparaten är lätt att producera, och analyssystemet är allmänt tillgängligt som en öppen källkod, vilket möjliggör dess användning i alla laboratorier. Vi visar förmågan hos detta system att mäta flera parametrar av socialt beteende i gnagare stammar med distinkta pälsfärger under social preferens och social nyhet preferenser tester. Vi validerar också förmågan hos systemet att avslöja modifierade dynamiken i socialt beteende hos gnagare efter manipulationer, såsom morrhår trimning.

TrackRodent programvara: tre algoritmer skrevs i MATLAB (2014a-2019a) för att spåra försöks ämnet och dess interaktioner med stimuli. Alla algoritmer har deponerats i GitHub, finns på < https:/github.com/Shainetser/trackrodent >. Huvudsyftet med alla fyra algoritmer är att spåra konturerna av motivet kropp att upptäcka någon direkt kontakt med stimuli områden.

Body-baserad algoritm: denna algoritm har tre versioner som spårar konturerna av en icke-kabelansluten mörk mus på en vit bakgrund (BlackMouseBodyBased), en vit mus på en mörk bakgrund (WhiteMouseBodyBased), eller en vit råtta på en mörk bakgrund (WhiteRatBodyBased ). Det grafiska användargränssnittet (GUI) av programvaran kräver att försöksledaren väljer ett experiment med antingen möss eller råttor och sedan väljer rätt kod. För varje version av algoritmen finns det två valfria koder: en som presenterar spårningsprocessen på skärmen medan den utför analysen, och en som inte (därav, det går snabbare och kallas "snabb"). Namnen på de relevanta koderna för algoritmen BlackMouseBodyBased är till exempel: "BlackMouseBodyBased23_7_14" och "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Alla algoritmer som slutar med "fast" visar inte spårningen online och användarna måste spara data direkt i resultatfilen (. mat-filen). Alla kroppsbaserade algoritmer kräver att du ställer in ett enda tröskelvärde ("låg tröskel" i programvarans GUI) för att identifiera ämnes kroppen.

Huvud-Directionality baserad algoritm: den andra algoritmen, som är tillgänglig endast för svart möss, är baserad på den kroppsbaserade algoritmen, förutom att bestämma huvudet Directionality. Denna algoritm detekterar interaktionerna hos Subject ' s Head med "stimuli"-områdena, och undviker därmed falska positiva identifieringar som kan uppstå genom slumpmässiga kontakter av ämnet med dessa områden. För den här algoritmen definieras två detektions trösklar för mus kroppens konturer: hög tröskel, vilket inkluderar den ljusare svansen på svarta möss och låg tröskel, vilket inkluderar kroppen utan svans. Därefter passar algoritmen en ellipsoid till de identifierade gränserna med det lägre tröskelvärdet och definierar placeringen av mus huvudet och svansen (utan åtskillnad mellan de två). Den slutliga diskrimineringen mellan svansen och huvudet är baserad på de gränser som definieras av den högre tröskeln.

Wired Animal algoritm: den tredje algoritmen syftar till att minimera artefakter till följd av kablar (dvs., elektrisk tråd eller optisk fiber) ansluten till djuret, vilket möjliggör analys av djurens beteende när den är ansluten till en kabel. Denna algoritm har koder endast för svarta möss och vita råttor. Koden för råttor kräver att försöksledaren definierar både låga och höga tröskelvärden, medan mus koden kräver endast ett lågt tröskelvärde.

Protocol

Alla beskrivna metoder har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid universitetet i Haifa.

1. experimentell uppsättning

1. Arena
   1. Konstruera den experimentella arenan för möss (figur 1a, D) genom att placera en vit eller svart (beroende på djurets färg) plexiglaslåda (37 cm x 22 cm x 35 cm) mitt i en akustisk kammare (60 cm x 65 cm x 80 cm, tillverkad av 2 cm tjockt trä belagt på insidan med 2 cm tjockt skum). För ljuset, ta bort en remsa (2 cm bred, 10 cm under taket av kammaren) av skummet runt den akustiska kammaren (förutom dörren), och bifoga en LED-remsa med antingen röda eller vita glödlampor. Se till att ljuset är så enhetligt som möjligt runt arenan för att förhindra reflektioner.
   2. Konstruera arenan för råttor på samma sätt som den som beskrivs ovan för möss, med olika dimensioner som på lämpligt sätt passar storleken på Sprague-Dawley (SD) råttor (figur 1G). Placera en svart plexiglasbox (50 cm x 50 cm x 40 cm) i mitten av en akustisk kammare (90 cm x 60 cm x 85 cm, tillverkad av 2 cm tjockt trä belagt på insidan med 2 cm tjockt skum).
2. Kammare
   1. För möss, skapa två svarta eller vita (beroende på päls färg) trekantiga kamrar (12 cm likbent, 35 cm höjd, med golv stängda) från 6 mm tjockt plexiglas. Lokalisera dem i två slumpmässigt utvalda motsatta hörn av arenan (figur 1B, E). Stick ett metallnät (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm hål) i nedre delen av varje kammare med epoxilim för att möjliggöra direkt interaktion med stimulans genom mesh (figur 1C, F). Märk varje kammare på ett sätt som tillåter diskriminering från de andra i en video utan att ge ledtrådar till ämnena (se figur 1B, E för exempel).
      Anmärkning: Varje kammare kommer så småningom att innehålla en social stimulans (mus) eller objekt (plast leksak, 5 cm x 5 cm x 5 cm, med en distinkt form och färg; Figur 1C, I -insatser). Låt epoxin limma lukten avduns i minst en vecka före användning.
   2. För råttor, skapa två svarta trekantiga kamrar (20,5 cm likbent, 40 cm höjd, tillverkad av 6 mm tjockt plexiglas, med golv stängda) och placera dem i två slumpmässigt utvalda motsatta hörn av arenan (figur 1H), vardera med ett metallnät (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm hål) som täcker dess nedre del (figur 1I).
3. Placera en monokromatisk kamera av hög kvalitet, utrustad med ett vidvinkelobjektiv, högst upp i den akustiska kammaren och Anslut den till en dator för att möjliggöra tydlig visning och inspelning av försökspersonernas beteende med kommersiell programvara (se tabell över material för förslag).

2. beteendemässiga paradigm

Anmärkning: Steg 2.1-2.7 Beskriv beteendemässiga paradigm för möss. Se avsnitt 2,8 för specifika instruktioner som involverar råttor.

1. Se till att burar av alla djur (försökspersoner: 2-4 månad gamla möss; stimuli: 21-30 dag-gamla juvenila möss) kvar i experiment rummet för minst 1 h innan du påbörjar beteende experiment.
2. Efter acklimatisering period, infoga två tomma kammare i arenan slumpmässigt på två motsatta hörn. Placera motivet i mitten av arenan för 15 min av habituation. Under den tiden, placera de två sociala stimuli, var i en annan kammare som ligger utanför arenan för habituation. Placera ett föremål (en plast leksak, 5 cm x 5 cm x 5 cm, med en distinkt form och färg) i en annan kammare.
3. För att utföra testet för social preferens (SP), starta videoinspelning och behåll inspelningen till slutet av testet.
4. Ta bort de två tomma kamrarna och sätt omedelbart in objektet och en av de sociala stimuli, var och en i en distinkt kammare. Lokalisera dessa kammare slumpmässigt i motsatt hörn av arenan som var tomma under habituation. Låt motivet interagera med stimuli för 5 min av SP-test. Stoppa inspelningen i slutet av testet.
5. Efter SP-testet, ta bort stimuli som innehåller kamrarna från arenan och lämna motivet i den tomma arenan i 15 min. Rengör kamrarna utifrån med 10% etanol våtservetter.
6. För att utföra den sociala nyhet preferens (SNP) test, starta videoinspelning och sätta in två kammare i arenan: en som innehåller samma sociala stimulans som används för SP-test (välbekanta stimulans), och den andra innehåller den nya sociala stimulans. Placera dessa kammare slumpmässigt i två motsatta hörn av arenan, se till att dessa platser inte användes för SP-test. Låt motivet interagera med stimuli för 5 min av SNP-testet.
7. Vid slutet av SNP test, stoppa videoinspelning, ta bort motivet och kamrarna från arenan, och Placera motivet tillbaka i sin hem bur. Lämna stimuli i kamrarna för nästa experiment (med ett annat ämne) eller returnera dem till deras hem burar. Rengör arenan och kamrarna med rinnande vatten följt av 10% etanol och låt torka.
8. Beteendemässiga paradigm för råttor
   1. För råttor, upprepa beteendemässiga paradigm som beskrivs i steg 2.1-2.7, med två modifieringar: 1) hantera råtta försökspersonerna och vänja den sociala stimuli till kamrarna för 2 dagar (10 min varje dag) före experimentet; och 2) förlänga SP-testet i 15 minuter för att ge råttorna en längre period av exponering för sociala stimuli. Senare, begränsa analysen av SP-test till den initiala 5 min.
      Anmärkning: Minst en Arena och fem kamrar behövs för att kunna köra en enda session.

3. använda TrackRodent GUI för beteendeanalys

Anmärkning: Se den övre panelen i figur 2A för gränssnittet trackrodent.

1. Öppna MATLAB (testat med 2014a-2019a) och välj mappen TrackRodent.
2. Lägg till alla undermappar till arbetsbanan genom att högerklicka på varje mapp och välja Lägg till i sökväg | Valda mappar och undermappar.
3. Skriv TrackRodent i kommandofönstret och tryck på RETUR.
4. Ladda upp en enda fil eller flera videofiler (AVI eller MP4-format) genom att välja load session File (AVI).
5. En filminspektör, som gör det möjligt att inspektera videoklippet bildruta för bildruta, öppnas omedelbart för den första filen i listan (bild 2a). Använd den för att undersöka videoklippet och definiera de första och sista bildrutorna i segmentet som ska analyseras. Registrera siffrorna för dessa ramar, som kommer att krävas senare. Stäng fönstret när du är klar.
6. Om du vill inspektera ytterligare videofiler öppnar du video granskaren när som helst genom att trycka på inspektera film och välja en specifik videofil.
7. Välj den testade arten (mus eller råtta; musen är standard).
8. Utesluta alla områden som kan avbryta spårningen, i enlighet med färgerna i motivet och arenan (svart eller vit).
   1. Om du vill utesluta ett givet område trycker du på exkludera områdeoch markerar alla hörn av området för uteslutning när markören ändras till en kors form. När du är klar, högerklicka på musen, sedan dubbla vänsterklicka på mitten av det markerade området. Det uteslutna området kommer att bli en röd nyans på skärmen. Upprepa proceduren om du vill utesluta så många områden som behövs.
9. För att ta bort ett område från uteslutning, tryck på ta bort undantagna område, sedan (med den korsade markören) Klicka på det område som ska tas bort från uteslutning.
10. För att definiera varje kammare som en "stimulans" område, för automatisk detektering av dess utredning av ämnet, Välj formen på "stimulus" område att vara antingen polygon eller elliptiska genom att markera lämplig ruta, sedan trycka på stimulus X (där "X" representerar 1, 2, eller 3). Markera "stimulus" områden på samma sätt som de uteslutna områdena, som sedan blir gul i färg. För att ändra placeringen av ett visst "stimulus"-område, tryck på stimulus X igen och markera den nya områdes platsen (detta kommer automatiskt att uppdatera platsen).
    Anmärkning: Välj olika stimuli nummer på ett konsekvent sätt för alla filer (dvs objekt som stimulus 1 för alla SP testfiler).
11. För att spåra närvaron av ämnet i ett specifikt virtuellt fack inne i arenan, Välj formen på "fack" område (polygon eller elliptisk), tryck sedan på fack X (där "X" motsvarar 1, 2, 3, 4, eller 5). Markera "kupé" områden på samma sätt som de uteslutna eller stimuli områden, som sedan blir blå i färg. För att ändra placeringen av ett specifikt "fackområde", tryck på fack X igen och markera den nya områdes platsen (detta kommer automatiskt att uppdatera platsen).
12. Välj önskad algoritm (BlackMouseBodyBased användes för videon) från listan (se tillgängliga algoritmer i figur 2B).
13. Skriv antalet start-och slutbildrutor för analysen i motsvarande redigeringsrutor i GUI.
14. Välj ett tröskelvärde för att identifiera ämnestexten.
    Anmärkning: De flesta algoritmer använder bara "låg" tröskel, medan huvudet Directionality-baserade algoritmer använder "hög" tröskel, samt. För den "låga" tröskeln, Välj en nivå som inkluderar musen/råtta kroppen utan svansen (så mycket som möjligt), medan den "höga" tröskeln bör också omfatta svansen. När det gäller att använda huvudet Directionality-baserade algoritmer, programvaran kommer att avgöra huvudet plats som motsatsen till svansen plats.
    Anmärkning: Programvaran kommer senare ignorerar små objekt som upptäckts med den valda tröskeln.
15. Om du vill utvärdera automatisk identifiering av ämnes kantlinjerna för ett givet tröskelvärde infogar du ett värde i fältet relevant tröskelvärde och trycker på RETUR på tangentbordet.
16. När du väljer flera filer flyttar du till nästa fil (med knappen Nästa överst) och väljer lämpliga definitioner för varje fil. När du är klar, kontrollera parametrarna och området platser för alla filer genom att flytta mellan varje, med hjälp av föregående och nästa knappar överst i GUI.
    Anmärkning: Definitionerna av alla områden och parametrar är specifika för en given fil.
17. För att starta beteendeanalys av alla valda filer, flytta till den första filen och tryck på Start.
18. I slutet av analysen sparas en resultatfil (. mat-fil) för varje film i samma katalog i filmfilerna.
    Anmärkning: Om den långsamma (icke-snabb) version av algoritmen används, kommer det också att spara en version av filmen med ett vitt kors i mitten av kroppen massa, som ändrar sin färg varje bildruta som upptäcks som Investigatory, om inte Spara analyserade filmen växlingsknappen i GUI är avmarkerad. Den här versionen av filmen (Sparad i samma katalog, med samma namn som originalfilmen, med suffixet "analyserad film") kan användas offline för att utvärdera kvaliteten på den automatiska detektering som utförs av systemet.

4. använda TrackRodent GUI för resultat presentation

Anmärkning: Se den nedre panelen i figur 2A för resultat presentation.

1. Om du vill granska resultaten för varje filmfil trycker du på Ladda resultatfil och väljer de. mat-filer som genereras av beteende analysen.
2. Flytta mellan växlingsknapparna för att undersöka skärmen någon av följande analyser: spårning av mus position (figur 2a). Utrymmen yrke längs sessionen (om "fack" definierades, inte visas); Stimuli utforskning längs sessionen (figur 2C); Total tid i fack (om "fack" definierades, visas inte); och total stimuli prospekterings tid (figur 2D).
   Anmärkning: "Stimulus" områden är områden där programvaran utvärderar ämnes interaktion, medan "fack" områden är områden där programvaran spårar närvaron av ämnet. Om du stoppar analysen med knappen stoppa analys sparas automatiskt de resultat som genererats fram till den senast analyserade ramen. För de flesta datorer bör det vara möjligt att ladda upp och analysera så många som 20 filmer samtidigt (beroende på datorns prestanda).

5. använda TrackRodentPopulationSummary GUI för populationsanalys (figur 2E)

1. Öppna MATLAB (testat med 2014a-2019a) och välj mappen TrackRodent.
2. Skriv Trackrodentpopulationsummary i kommandofönstret och tryck på RETUR.
3. Överför flera TrackRodent-resultatfiler (. mat-format) genom att trycka på Välj resultatfiler.
4. Fyll i numren på den sista bildrutan för analys, test namn, stimulus 1-namn och stimulus 2-namn.
5. Välj önskade analyser i listan med valfria analyser genom att markera alla lämpliga rutor.
6. Välj Exportera resultaten till ett i genom att markera lämplig ruta för att extrahera alla resultat av de kontrollerade analyserna som en enda kalkylbladsfil.
7. Tryck på Start och vänta tills analysen är slutförd.
   Anmärkning: Detta avslutar analysen. Programvaran kan användas för att analysera resultaten av så många filmfiler som önskas, med tanke på att de alla behaviorally analyseras med hjälp av TrackRodent programvaran. Analysen som utförs av programvaran förutsätter videoinspelning med en bildhastighet på 30 Hz. Om en annan bildrutehastighet har använts multiplicerar du tiden med 30 och dividerar med den bildrutehastighet som används för inspelningen för att konvertera den till rätt värde (er).

Representative Results

Använda systemet för social preferens test i C57BL/6J möss
Figur 1 visar tre versioner av den experimentella uppsättningen. Den första versionen (figur 1A-C) är designad för möss med mörka pälsfärger, såsom C57BL/6j möss. Den andra (figur 1D-F) planeras för möss med ljusa PÄLSFÄRGER, såsom Balb/c eller ICR (CD-1) möss. Den tredje är större (figur 1G-I) och utformad för råttor med ljusa pälsfärger, såsom SD råttor. De första försökspersonerna som undersökts var naiva vuxna (8-12 veckor gamla), grupp-inrymt (två till fem djur per bur) manliga C57BL/6J möss. Sociala stimuli var juvenila (21-30 dagar gamla), grupp-inrymt (två till sex djur per bur), manliga C57BL/6J möss. Objekt stimuli var luktfri plastleksaker med distinkta färger (insatser i figur 1C, i). Videofiler av experimenten analyserades med hjälp av TrackRodent programvara (Body-baserad algoritm, se exemplifieras skärmbild och GUI i figur 2A), som automatiskt och kontinuerligt spåras ämne plats baserat på 1) Body Center och 2) kontakten av kroppens konturer med stimuli-innehållande kammare.

Analysen omfattade följande procedurer. Efter att ha laddat upp en filmfil och grafiskt definierat områden som ska uteslutas från analysen, definierade försöksledaren grafiskt två områden, var och en med en distinkt kammare, som "stimuli" (figur 2a, gulaktiga områden). Användare kan också definiera upp till fem områden som virtuella "fack". Sedan väljer användarna "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" algoritm från listan över möjliga algoritmer (figur 2B). Efter att ha tryckt på Start Analysis -knappen, spårade programvaran djur platsen ram-för-Frame och avbildas musen plats spår i arenan (figur 2A, blå linje). Under denna analys, programvaran spårade också kontakter mellan "stimuli" områden och kroppens kontur av ämnet (figur 2C). Sådana kontakt händelser definierades som undersökande och tjänade till att beräkna undersökningstiden för varje stimulus och den tid under vilken inget utrednings beteende visades (figur 2D). Som framgår av figur 2C, D visar den analyserade filmen, högre utredning tid för "stimulus 2 observerades", vilket var den sociala stimulansen, jämfört med objektet, som i detta fall definierades som "stimulus 1".

Populationsanalys av den sociala preferensen testar i C57BL/6J möss
Efter att ha gjort det möjligt för TrackRodent programvara för att analysera alla videofiler i den experimentella gruppen, en populationsanalys för denna grupp utfördes med hjälp av "TrackRodentPopulationSummary" GUI (figur 2E), samtidigt välja alla möjliga analyser av denna programvara. De distinkta utgångarna av dessa analyser för SP-testet som utfördes med 58 C57BL/6J vuxna hanmöss visas i figur 3, precis som de visades på datorskärmen, med alla felstaplar som skildrar SEM. statistiska analyser av dessa resultat publicerades tidigare¹¹.

Den genomsnittliga totala undersökningstiden för populationen av försökspersoner mot var och en av de två stimuli (samkönade juvenila sociala stimulans och ett objekt) visas i figur 3a, som skildrar en tydlig preferens för ämnet mot den sociala stimulansen. Även om algoritmen är enkel, en utmärkt korrelation observerades (r² = 0,91, p < 10^-6, Pearson ' s korrelation) mellan undersökningstiden manuellt mätt med en utbildad observatör och det värde som beräknats av programvaran. Dynamiken i denna preferens kan ses i figur 3B, där den genomsnittliga undersökningstiden för varje stimulus ritas längs tiden i 20 s lagerplatser. Som visad, social preferens upprätthålls av ämnena under hela sessionen, även om det verkade liten starkare i tidiga skeden.

Figur 3C visar undersökningstiden för varje stimulus, kategoriserade efter skjutningens varaktighet till kort (≤ 6 s), medium (> 6 s, ≤ 19 s), och långa (> 19 s) anfall, tillsammans med den totala undersökningstiden. Fördelningen av undersökningstiden för varje stimulus enligt skjutningen varaktighet i 1 s papperskorgar visas i figur 3D. Som visas i figur 3C, D, det fanns ingen skillnad mellan stimuli i den korta skjutningarna, medan medellång och lång skjutningar visade tydliga sociala preferenser. Dessa resultat tyder på att i C57BL/6J möss, korta skjutningar återspeglar nyfikenhet, medan långa anfall återspeglar en interaktion mellan motivet och stimuli. Den relativa varaktigheten av undersökningen (RDI, [social-Object]/[sociala + Object]) värden för varje kategori (kort, medellång och lång skjutningar), liksom för den totala undersökningstiden, visas i figur 3E. Som visad, det högsta RDI-värdet uppnås med de långa skjutningarna, vilket tyder på att de bäst återspeglar de sociala preferenser ämnen.

För att analysera dynamiken i utredningen bout under testet, fördelningar över tid för varje kategori var separat plottas. Fördelningarna över tiden av kort stavelse (figurera 3F) och medlet (figurera 3G) utredning anfall föreslå en gradvist för minskning av dessa skjutningar över tid. En liknande analys av de långa skjutningarna (figur 3H) visar däremot en gradvis ökning under testets gång. Denna tendens återspeglas också av fördelningen av den genomsnittliga matchen varaktighet (figur 3I), som visar en gradvis ökning med tiden. Sålunda, det verkar som om ämnena uppvisade nyfikenhet främst under de tidiga stadierna av testet, medan senare de visade mer interaktioner med stimuli. Det bör noteras att under den sista minuten, det finns en inneboende bias av analysen mot korta skjutningar, eftersom långa skjutningarna var artificiellt avslutades i slutet av sessionen. Därför, när man överväger tidsförloppet för utredningen skjutningarna, bör den sista minuten ignoreras.

Vi analyserade också intervallen mellan successiva undersökningar anfall mot samma stimulans (dvs. den tid det tog ämnet att återvända till samma stimulans efter utgången av varje utredning bout). Den här parametern återspeglar driften av motivet för att återgå till samma stimulans och undersöka. Här var intervallen också indelade i korta (≤ 5 s), medel (> 5 s, ≤ 20 s), och långa (> 20 s) anfall, som visas tillsammans med totala tidsintervall för varje stimulus i figur 3J. Histogrammet för intervallen i 1 s papperskorgar i visas i figur 3K. Som framgår av figur 3J, K, intervallen mellan undersökningarna av den sociala stimulansen var mycket kortare än de mellan utredningar av objektet. I enlighet med detta gav RDI-värdena för intervall i det långa intervallet det högsta absoluta värdet (figur 3L). Därför kan de användas som en undersökande tidsoberoende variabel som bedömer den sociala preferensen. Fördelningarna över tiden för intervaller som ritas upp separat för varje kategori (figur 3M-O) tyder på en successiv minskning av korta och medellånga intervaller och en motsatt förändring av lång mellanrum mellan utrednings anfall, som med största sannolikhet återspeglar den generella förlängningen av utrednings anfall. I likhet med fördelningen av undersöknings anfall, är den sista minuten av intervaller partisk mot korta värden och bör ignoreras.

Vi analyserade också de övergångar som observerats i ämnen från en stimulans till en annan. Denna tomt visas i figur 3P, vid vilken varje tidpunkt ämnet började undersöka en ny stimulans markeras med en blå prick, varje rad representerar ett distinkt ämne och den röda linjen representerar den genomsnittliga övergångs hastigheten. Som uppenbar var övergångs graden högst (~ 1,5 övergångar/min) under de första 2 min av testet och sänktes gradvis till mindre än 50% av toppen. Samma tendens framgår av fördelningen av medel övergångs graden över tid (figur 3Q).

Slutligen, heatmaps av utredningen anfall mot social stimulans (figur 3R) och objekt (figur 3s) under loppet av testet för varje ämne visas, med färgerna Markera skjutningen varaktighet (figur 3S). Sammantaget tyder resultaten på att i C57Bl/6J möss, SP-testet är grovt uppdelad i en tidig undersökande fas (kännetecknas av en hög övergång och korta undersöknings anfall) och en sen interaktion fas (kännetecknas av låg övergångsfrekvens och lång utredning anfall).

Populationsanalys av sociala nyhet preferens test i SD råttor
Figur 4 visar samma analys som ovan för SNP test som utförs av 59 SD råttor. Typiskt, preferensen av Roman vs. välbekanta sociala stimuli är svagare än preferens mot en ny social stimulans kontra ett föremål, utställda av möss i SP-provet (figur 3). Ändå, den sociala nyhet preferens återspeglas tydligt av alla parametrar. I synnerhet, som ingåtts ovan från SP-testet på möss, är den långa undersökningen anfall och långa intervaller de parametrar som tydligast uppvisar skillnader mellan stimuli, vilket återspeglas av deras högsta absoluta RDI-värden (figur 4E, L; det bör noteras att RDI-värden för SNP-testet definieras som [välbekant-roman]/[bekant + roman]).

Förlust av polisongar försämrar social preferens i både C57BL/6J möss och SD råttor
För att utvärdera effekterna av somatosensorisk manipulation på dynamiken i socialt beteende, analys utfördes av SP-testet avslutades med 29 C57BL/6j möss och 33 SD råttor efter morrhår trimning (genomfördes 3-7 dagar före testning). Därefter jämfördes dessa resultat med kontrolldjur. Som visas i figur 5a-F, den Whisker-trimmade möss inte föredrar den sociala stimulans över objektet, vilket återspeglas av bristen på skillnad i undersökningstiden mellan de två stimuli (jämför figur 5a till figur 5D) och förlusten av långa utredningen anfall mot social stimulans (jämför figur 5B till figur 5E). Intressant, den Whisker-trimmade möss visade också ökad övergång jämfört med kontroll möss (jämför figur 5C till figur 5F).

Sammantaget tyder dessa data på att morrhår-trimmade möss markant reducerade varaktigheten av deras interaktioner med den sociala stimulansen. I motsats till möss, Whisker-trimmade råttor inte förlora sina sociala preferenser (figur 5G-L). Men de förändrade avsevärt sitt beteende under den första minuten av testet, när de hade färre långa utredning anfall (jämför figur 5H till figur 5K) och många fler övergångar (jämför figur 5I till figur 5L). Sålunda, morrhår trimning signifikant modifierade beteendet hos både råttor och möss i SP-test, men på ett mycket annorlunda sätt mellan de två arterna. Dessa resultat tyder på en distinkt roll för Whisker-beroende somatosensorisk stimulering i sociala interaktioner av råttor och möss.

Figur 1: experimentell uppsättning. AenSchematisk skildring av den experimentella arenan avsedd för möss med svart päls. (B) en bild av arenan uppifrån, med hjälp av dim rött ljus, som visar en C57BL/6j ämnes mus i arenan. (C) en bild som visar det med kvadratiska maskor området i en vit kammare, genom vilken motivet interagerar med en stimulans (infällt: en bild av ett objekt stimulans som används för möss). (D-F) Som visas i panelerna A-C, en experimentell Arena och kammare utformade för möss med ljus päls. (G-I) Som visas i panelerna A-C, en experimentell Arena och kammare avsedda för råttor med ljus päls (infällt i [i]: bild av ett objekt stimulans används för råttor). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 2: programvara för TrackRodent. (A) en skärm av en dator som kör programvaran TrackRodent. Vänster: videobilden i början av den analyserade filmen (första bildruta som valts av försöksledaren), som visar den märkta "stimuli" områden och spårade rörelse Stig av C57BL/6J ämne. Höger: programvarans GUI. (B) listan över valfria koder för programvaran som ska användas med GUI. Var och en av dessa koder passar ett distinkt försöks tillstånd. C) analysen av det specifika experiment som visas i panel A, när alternativet för stimuli prospektering längs sessionen valdes i avsnittet resultat presentation i GUI. Denna tomt visar (vid varje bildruta) om motivet var i kontakt med "stimulus 1" eller "stimulus 2". I det presenterade fallet, en tydlig preferens för "stimulus 2" framgår av det högre antalet och varaktigheten av utredningen anfall upptäcks mot denna stimulans. D) analys av experimentet som visas i panelerna A och C, när alternativet för Total stimuli prospekterings tid valdes i avsnittet resultat presentation i GUI. Även här är en tydlig preferens för "stimulus 2" uppenbar från den högre nivån av utredningstiden mot denna stimulans. (E) GUI av TrackRodentPopulationSummary programvara som möjliggör analys och plottning av resultaten från en population av djur, som alla analyseras med hjälp av TrackRodent programvaran (se figur 3 för resultaten av en sådan analys). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: analysera undersöknings beteendet hos möss med C57BL/6J under SP-test med programvaran TrackRodent. Denna siffra visar de olika tomterna av alla valfria analyser av programvaran TrackRodentPopulationSummary (figur 2e) som används för en population på 58 C57BL/6j vuxna hanmöss som utför SP-provet. De olika tomter visas i en liknande ordning och sätt som de dök upp på datorskärmen (se representativa resultat avsnitt för en detaljerad förklaring av varje observationsområde). A) totaltid för undersökning av stimuli, (B) undersökning av stimuli längs tiden, (C) korta vs långa skjutningar-total tid, (D) 1s bin histogram av skjutningarna, (E) Short vs Long anfall-RDI, (F) < 6 s skjutningar längs tiden, (G) 6 − 19 s skjutningar längs tid, (H) > 19 s skjutningar längs tiden, (I) Mean bout varaktighet längs tid, (J) kort vs långa intervaller-total tid, (K) 1 s bin histogram intervaller, (L) kort kontra lång intervaller-RDI,M) < 5 s intervaller längs tiden, (N) 5 − 20 s intervaller längs tiden, (O) > 20 s intervaller längs tiden, (P) övergångar mellan stimuli-raster Plot, (Q) övergång mellan stimuli längs gånger, (R) Heat-karta över bout varaktighet med sociala, (s) Heat-karta över bout varaktighet med objekt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: analysera undersöknings beteendet hos SD-råttor under SNP-test med programvaran TrackRodent. Tomter för alla valfria analyser av programvaran TrackRodentPopulationSummary (figur 2e) som används för en population på 59 SD vuxna hanråttor som utför SNP-testet. De olika tomter visas i en liknande ordning och sätt som de dök upp på datorskärmen (se representativa resultat avsnitt för en detaljerad förklaring av varje observationsområde). (a-Q) Som beskrivs i figur 3. (R) värma-kartlägga av skjutningen varaktighet med bekant, (S) värma-kartlägga av skjutningen varaktighet med romanen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Whisker-trimning av möss och råttor försämrar differentially socialt beteende. A) Plot av genomsnittlig undersökningstid (mätt i 20 s soptunnor) under SP-provet för manliga C57BL/6j möss (n = 58). (B) distribution (1 min behållare) av genomsnittlig total tid för lång (> 19 s) undersökning skjutningar längs SP-testet visas i panel A för sociala och objekt stimuli. Notera mycket längre tid av lång utredning anfall mot den sociala stimulansen jämfört med objektet. (C) fördelning (1 min) av övergångs graden längs tiden för SP-provet som visas i (a). (D-F) Som framgår av panelerna A-C, var 29 MICE morrhår trimmade ungefär 1 vecka före testet. Dessa djur förlorade sin sociala preferens, vilket framgår avD) allmän utredningstid och (E) fördelning av långa skjutningar. De visade också en högre allmän hastighet av övergångar (F), vilket tyder på mindre ihållande interaktioner med den sociala stimulansen. (G-I) Som visas i paneler A-C, 60 SD råttor utfört SP-test. Notera de olika dynamiken i råttornas beteende jämfört med möss, med lägre övergångsfrekvens och längre perioder av långa undersöknings anfall i den tidiga fasen (2 min) av testet. (J-L) Som visas i paneler G-H, 33 råttor var Whisker-trimmas. Observera att medan råttorna inte förlora social preferens efter Whisker-trimning som möss gjorde, dynamiken i deras sociala beteende i de första 2 min av testet ändrades, visar fler övergångar och färre långa skjutningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det experimentella system som beskrivs^{här, som}har utformats som ett alternativ till tre kammar apparater^{2,5, gör}det möjligt att göra samma tester samtidigt som vissa av dess begränsningar kan lösas. Användningen av triangulära kammare, som ligger i två motsatta hörn av den rektangulära arenan begränsar ämnet-stimulus interaktion område till ett väl definierat plan, vilket möjliggör exakt automatiserad analys av utrednings beteende. En fördel är användningen av analysprogram varan (TrackRodent) för att beräkna flera beteendemässiga parametrar för varje test. Det möjliggör också ompositionering av kamrarna i slumpmässiga motsatta hörn av arenan under de olika stadierna av paradigmet, neutraliserar eventuella effekter av rumsliga navigerings färdigheter.

Dessutom, de två hörnen av arenan, som lämnas tomma under varje etapp, erbjuda motivet en lämplig plats för vila och grooming och dra bort det från kamrarna, minimera falskt positiva resultat. Sålunda, systemet tillåter direktbedömning av motivet motivation att undersöka varje stimulans under SP och SNP tester. Dessutom, som beteendemässig analys av videorna görs på ett automatiserat sätt av TrackRodent programvara, en försöksledaren kan ladda flera filmer för analys, definiera rätt parametrar för varje, och låt programvaran processen över natten, vilket sparar värdefull tid. I synnerhet kan systemet användas för alla typer av sociala diskrimineringstest, såsom diskriminering mellan manliga och kvinnliga sociala stimuli eller stimuli av distinkta stammar. Dessutom, det finns inga gränser (övre/nedre) till storleken på ämnen som kan spåras med hjälp av detta system; Det kan alltså användas med juvenila eller feta djur. Detta experimentella system är billigt och enkelt att producera, och de datorkoder som används för analys är allmänt tillgängliga som en öppen källkod-koder, vilket gör att alla laboratorier för att enkelt anta metoden.

Den automatiserade upptäckten av utrednings beteende i systemet är baserad på detektering av fysisk kontakt mellan kroppens konturer av ett ämne och vart och ett av de områden som definieras av försöksledaren som "stimuli". Således, om ämnet berör "stimuli" område med sin kropp snarare än huvud, denna händelse anses utrednings (dvs, en falsk positiv). För detta ändamål, huvud-Directionality baserad algoritm genererades, som identifierar huvudet av ämnet och tar hänsyn endast kontakt mellan huvudet och "stimuli". Denna algoritm går dock betydligt långsammare än de kroppsbaserade algoritmerna. Därför rekommenderas inte för analys av ett stort antal filmer, om inte experimentella förhållanden kräver det.

Liknande resultat observerades (1,1% skillnad, n = 11 experiment, 5 min vardera, data som inte visas) mellan de två algoritmerna; Därför användes de kroppsbaserade algoritmerna oftast. Det bör noteras att även om analyser av stora djurgrupper presenteras här, behövs en mycket mindre gruppstorlek för att observera en statistiskt signifikant skillnad mellan två stimuli, baserat på den sammanlagda utredningstid som mäts av systemet. Till exempel visade effektberäkningar att Provstorlekar på endast fem och åtta djur krävs för SP-och SNP-tester av möss, respektive (α = 0,05, effekt = 0,8). Ändå, betydligt större grupper av djur användes här för att säkerställa observation av alla dynamiken i socialt beteende.

Systemet kräver att försöksledaren manuellt definierar tröskeln för detektering av ämnes kroppens konturer. Att hitta rätt tröskel som ska användas kan kräva viss erfarenhet; Därför har de flesta algoritmer som används i detta system regelbundna, långsammare versioner. Dessa versioner presentera analyserade filmen och upptäcka utredning händelser online, medan deras snabba versioner inte aktivera online presentation. Det rekommenderas att nya användare använder de vanliga versionerna och övervakar analyser online för att säkerställa att det fungerar korrekt, och att de använder "snabba" algoritmer endast efter att ha samlat erfarenhet av analysförfarandet.

En fördel med detta system över tre kammartest är att det mäter flera parametrar för utrednings beteende, vilket stöder mer detaljerade analyser. Denna fördel är två gånger. För det första behöver försöksledaren inte förlita sig enbart på den totala utredningstiden för att bestämma preferensen. Det konstaterades att den långa utredningen skjutningarna och långa intervaller är känsligare än den totala undersökningstiden när man upptäcker en preferens för en stimulans över en annan. När det gäller dessa parametrar, bör det noteras att deras värden under den sista minuten av testet är partisk nedåt, eftersom den långa utredningen anfall och intervaller avslutas i förtid i slutet av 5-min sessionen.

För det andra kan de flera parametrarna upptäcka subtila förändringar i dynamiken i social utredning efter olika manipulationer. Det konstaterades till exempel att C57BL/6J hanmöss förlorade sin sociala preferens efter Whisker-trimning. Däremot behöll SD hanråttor sin sociala preferens men förändrade sociala beteende dynamik som visas av kortare utredning anfall och högre nivåer av övergångar i den tidiga fasen av testet. Sammantaget tyder dessa data på en minskning av tendensen hos råttor och möss för sociala interaktioner efter morrhår trimning. Således stöder detta system en rigorös analys av dynamiken i socialt beteende, som kan vara mycket känsliga för olika manipulationer.

Sammanfattnings, presenterade vi här en roman, enkel och prisvärd experimentella system som stöder automatiserad analys av social utredning beteende dynamik. Detta system kommer att underlätta detaljerade analyser av sociala beteende underskott i olika stammar och genetiskt modifierade linjer av små gnagare. Dessutom, den exakta upptäckten av utredning skjutningarna visat här, kombinerat med förmågan hos detta system för att analysera beteende medan försökspersonerna är anslutna till elektriska kablar eller optiska fibrer, tillåter dess användning i experiment med inspelning hjärnaktivitet i samband med socialt beteende.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (formerly PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Monochromatic Camera
FlyCap 2.0	FLIR (formerly PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Video recording software
Home 5 minute Epoxy glue	Devocon	20845	For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Programming environment
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	For arena and stimuli chambers construction
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply	2012topdeal eBay supplier	NaN	For illumination of the acoustic chamber