Et system til sporing af dynamikken i social præference adfærd i små gnavere

Summary

Beskrevet her er en ny automatiseret eksperimentel system, der tilbyder et alternativ til tre-kammer test og også løser flere forbehold. Dette system leverer flere adfærdsmæssige parametre, der muliggør grundig analyse af små gnaver adfærdsmæssige dynamik under social præference og social nyhed præference tests.

Abstract

Udforskning af neurobiologiske mekanismer af social adfærd kræver adfærdsmæssige tests, der kan anvendes til dyremodeller på en upartisk og observatør-uafhængig måde. Siden begyndelsen af tusindårsriget, tre-kammer test har været meget anvendt som et standard paradigme til at evaluere selskabelighed (social præference) og social nyhed præference i små gnavere. Men denne test lider af flere begrænsninger, herunder dens afhængighed af rumlig navigation og uagtsomhed af adfærdsmæssige dynamik. Præsenteret og valideret her er et nyt eksperimentelt system, der tilbyder et alternativ til tre-kammer test, samtidig med at løse nogle af sine forbehold. Systemet kræver et enkelt og overkommeligt forsøgs apparat og offentligt tilgængeligt open source-analyse system, som automatisk måler og analyserer flere adfærdsmæssige parametre på individ-og populationsniveau. Det giver mulighed for detaljeret analyse af de adfærdsmæssige dynamik små gnavere under enhver social diskrimination test. Vi demonstrerer effektiviteten af systemet i at analysere dynamikken i social adfærd under den sociale præference og social nyhed præference tests som udføres af voksne mandlige mus og rotter. Desuden validerer vi systemets evne til at afsløre modificeret dynamik i social adfærd i gnavere efter manipulationer såsom hale-trimning. Således systemet giver mulighed for stringent undersøgelse af social adfærd og dynamik i små gnaver modeller og understøtter mere præcise sammenligninger mellem stammer, betingelser, og behandlinger.

Introduction

Afslørende de biologiske mekanismer underliggende neuroudviklingsmæssige lidelser (NDDs) er en af de største udfordringer inden for neurovidenskab¹. Tackle denne udfordring kræver adfærdsmæssige paradigmer og eksperimentelle systemer, der karakteriserer adfærd gnavere i en standard og upartisk måde. En indflydelsesrig undersøgelse offentliggjort for mere end et årti siden af Moy og kolleger² præsenterede tre-kammer test. Siden da har denne test været meget brugt til at undersøge social adfærd i gnavere modeller af Ndd'er. Denne test evaluerer to medfødte tendenser af gnavere: 1) at bo i nærheden af en social stimulus over et objekt (selskabelighed, også betegnet social præference [Sp]), og 2) at foretrække nærhed af en roman social stimulus over en velkendt en (social nyhed præference [SNP])^3,4. Flere efterfølgende undersøgelser foreslog metoder til automatiseret analyse af tre-kammer testen ved hjælp af edb-metoder^5,6.

Denne test stadig lider af flere forbehold. For det første, det primært undersøger sociale sted præference snarere end motivering af emnet til direkte interagere med en social stimulus, selv om nogle grupper også måle olfaktoriske undersøgelse (sniffing) tid, enten manuelt⁷ eller ved hjælp af kommercielle edb-systemer^8,9,10. For det andet bruges tre-kammer testen for det meste til at måle den samlede tid brugt af emnet i hvert kammer, og det forsømmer adfærdsmæssige dynamik. Endelig, det bygger på kun ét aspekt af den sociale adfærd, som er den tid, der bruges af emnet i hvert kammer (eller sniffing tid, hvis målt).

Her præsenterer vi et nyt og overkommeligt eksperimentelt system, der er et alternativ til trekammer apparatet. Det giver også mulighed for udførelse af de samme adfærdsmæssige tests, mens løse de ovennævnte forbehold. Den præsenterede adfærdsmæssige system automatisk og direkte måler den efterforsknings adfærd af en gnaver mod to stimuli. Derudover analyserer den adfærds dynamikken på en observatør uafhængig måde. Desuden, dette system måler flere adfærdsmæssige parametre og analyserer disse på både individ og befolkning niveauer; således, det understøtter en grundig analyse af social adfærd og dens dynamik under hver test. Desuden neutraliserer tilfældige Repositionering af kamrene i modsatte hjørner af arenaen under de forskellige test stadier enhver effekt af rumlig hukommelse eller præference. Dette system kan også anvendes til andre diskriminations tests, såsom kønsdiskrimination. Det brugerdefinerede apparat er let at producere, og analysesystemet er offentligt tilgængeligt som en open-source-kode, hvilket gør det muligt at bruge det i ethvert laboratorium. Vi demonstrerer evnen af dette system til at måle flere parametre for social adfærd i gnavere stammer med særskilte pels farver under den sociale præference og social nyhed præference tests. Vi validerer også systemets evne til at afsløre modificeret dynamik i social adfærd i gnavere efter manipulationer, såsom hale-trimning.

TrackRodent software: tre algoritmer blev skrevet i MATLAB (2014a-2019a) at spore forsøgsemnet og dets interaktioner med stimuli. Alle algoritmer blev deponeret i GitHub, findes på < https:/github.com/shainetser/trackrodent >. Hovedformålet med alle fire algoritmer er at spore konturerne af motivet krop til at detektere enhver direkte kontakt med stimuli områder.

Body-baserede algoritme: denne algoritme har tre versioner, der sporer konturerne af en ukablet mørk mus på en hvid baggrund (BlackMouseBodyBased), en hvid mus på en mørk baggrund (WhiteMouseBodyBased), eller en hvid rotte på en mørk baggrund (WhiteRatBodyBased ). Den grafiske brugergrænseflade (GUI) af softwaren kræver, at eksperimentatoren vælger et eksperiment ved hjælp af enten mus eller rotter og derefter vælger den korrekte kode. For hver version af algoritmen er der to valgfrie koder: en, der præsenterer sporingsprocessen på skærmen, mens den udfører analysen, og en, der ikke (derfor kører den hurtigere og kaldes "hurtig"). For eksempel er navnene på de relevante koder for BlackMouseBodyBased algoritmen: "BlackMouseBodyBased23_7_14" og "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Alle algoritmer, som slutter med "fast", viser ikke sporing online, og brugerne skal gemme dataene direkte i resultatfilen (. mat-fil). Alle krop-baserede algoritmer kræver fastsættelse af en enkelt tærskel ("lav tærskel" i softwarens GUI) til at detektere kroppen af motivet.

Head-directionalitetsbaseret algoritme: den anden algoritme, som kun er tilgængelig for sorte mus, er baseret på den krops baserede algoritme, ud over at bestemme hoved direktionalitet. Denne algoritme registrerer samspillet mellem motivet hoved med "stimuli" områder, og dermed undgå falske positiver, der kan opstå fra tilfældige kontakter af emnet ' med disse områder. For denne algoritme er to detekterings tærskler for muse kropskonturer defineret: høj tærskel, som omfatter den lysere hale af sorte mus og lav tærskel, som omfatter kroppen uden hale. Derefter, algoritmen passer en ellipsoide til de fundne grænser ved hjælp af den nedre tærskel og definerer placeringen af musen hoved og hale (uden skelnen mellem de to). Den endelige diskrimination mellem halen og hovedet er baseret på de grænser, der er defineret af den højere tærskel.

Wired animalske algoritme: den tredje algoritme har til formål at minimere artefakter som følge af kabler (dvs. elektrisk ledning eller optisk fiber) forbundet til dyret, så analyse af dyrets adfærd, mens forbundet til et kabel. Denne algoritme har koder kun for sorte mus og hvide rotter. Koden for rotter kræver, at eksperimententer definerer både lave og høje tærskler, mens muse koden kun kræver en lav tærskel.

Protocol

Alle de beskrevne metoder er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) på universitetet i Haifa.

1. eksperimentel opsætning

1. Arena
   1. Konstruere den eksperimentelle arena for mus (figur 1A, D) ved at placere en hvid eller sort (afhængigt af dyrets farve) plexiglas boks (37 cm x 22 cm x 35 cm) i midten af et akustisk kammer (60 cm x 65 cm x 80 cm, lavet af 2 cm tykt træ belagt på indersiden med 2 cm tykt skum). For lyset, fjerne en strimmel (2 cm bred, 10 cm under loftet af kammeret) af skummet omkring den akustiske kammer (udover døren), og vedhæfte en LED strimmel med enten røde eller hvide pærer. Sørg for, at lyset er så ensartet som muligt omkring arenaen for at forhindre refleksioner.
   2. Konstruere arenaen for rotter på samme måde som den ovenfor beskrevne for mus, med forskellige dimensioner, der passende passer størrelsen af Sprague-Dawley (SD) rotter (figur 1G). Placer en sort plexiglas boks (50 cm x 50 cm x 40 cm) midt i et akustisk kammer (90 cm x 60 cm x 85 cm, fremstillet af 2 cm tykt træ belagt indvendigt med 2 cm tykt skum).
2. Kamre
   1. For mus, oprette to sorte eller hvide (afhængigt af pels farve) trekantede kamre (12 cm isosceler, 35 cm højde, med gulve lukket) fra 6 mm tyk plexiglas. Find dem i to tilfældigt udvalgte modsatte hjørner af arenaen (figur 1B, E). Sæt en metalnet (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm huller) i den nederste del af hvert kammer ved hjælp af epoxy lim til at tillade direkte interaktioner med stimulus gennem masken (figur 1C, F). Marker hvert kammer på en måde, der tillader diskrimination fra de andre i en video uden at give fingerpeg til emnerne (Se figur 1B, E for eksempler).
      Bemærk: Hvert kammer vil i sidste ende indeholde en social stimulus (mus) eller objekt (plastik legetøj, 5 cm x 5 cm x 5 cm, med en tydelig form og farve; Figur 1C, I Insæt). Lad epoxy lim lugt fordampe i mindst en uge før brug.
   2. For rotter, Opret to sorte trekantede kamre (20,5 cm isosceler, 40 cm højde, lavet af 6 mm tykt plexiglas, med gulve lukket) og Placer dem i to tilfældigt udvalgte modsatte hjørner af arenaen (figur1H), hver med en metalnet (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm huller) dækker sin nedre del (figur 1I).
3. Placer et monokromatisk kamera af høj kvalitet, der er udstyret med et vidvinkelobjektiv, øverst i det akustiske kammer, og forbind det til en computer for at muliggøre klar visning og registrering af emneens opførsel ved hjælp af kommerciel software (Se tabel over materialer for forslag).

2. adfærds paradigme

Bemærk: Trin 2.1-2.7 beskriver det adfærdsmæssige paradigme for mus. Se afsnit 2,8 for specifikke instruktioner, der involverer rotter.

1. Sørg for, at bure af alle dyr (fag: 2-4 måneder gamle mandlige mus; stimuli: 21-30 daggamle Juvenile mus) forbliver i forsøgs lokalet i mindst 1 time før påbegyndelse af adfærds eksperimentet.
2. Efter akklikalationsperioden skal du indsætte to tomme kamre i arenaen tilfældigt i to modsatte hjørner. Placer motivet i midten af arenaen for 15 min habituation. I løbet af denne tid, placere de to sociale stimuli, hver i et andet kammer placeret ud af arenaen for habituation. Placer et objekt (et plastik legetøj, 5 cm x 5 cm x 5 cm, med en tydelig form og farve) i et andet kammer.
3. For at udføre den sociale præference (SP) test, starte videooptagelse og holde optagelsen indtil slutningen af testen.
4. Fjern de to tomme kamre og straks indsætte objektet og en af de sociale stimuli, hver i et særskilt kammer. Find disse kamre tilfældigt i de modsatte hjørner af arenaen, der var tomme under habituation. Lad motivet interagere med stimuli for 5 min af SP-testen. Stop optagelsen ved slutningen af testen.
5. Efter SP-testen skal du fjerne de stimuli-holdige kamre fra arenaen og lade motivet stå i den tomme Arena i 15 minutter. Rengør kamrene udefra med 10% ethanol klude.
6. For at udføre den sociale nyhed præference (SNP) test, start videooptagelse og Indsæt to kamre i arenaen: en, der indeholder den samme sociale stimulus, der anvendes til SP-testen (velkendt stimulus), og den anden indeholder den nye sociale stimulus. Placer disse kamre tilfældigt i to modsatte hjørner af arenaen, og sørg for, at disse steder ikke blev brugt til SP-testen. Lad motivet interagere med stimuli for 5 min af SNP-testen.
7. I slutningen af SNP testen, stoppe videooptagelse, fjerne emnet og kamre fra arenaen, og placere motivet tilbage i sit hjem bur. Lad stimuli i kamrene til det næste eksperiment (med et andet emne) eller returnere dem til deres hjem bure. Rengør arenaen og kamrene med rindende vand efterfulgt af 10% ethanol og lad tørre.
8. Adfærdsmæssige paradigme for rotter
   1. For rotter, Gentag adfærds paradigme beskrevet i trin 2.1-2.7, med to modifikationer: 1) håndtere rotte og habituerer de sociale stimuli til kamrene i 2 dage (10 min hver dag) forud for forsøget; og 2) forlænge SP test for 15 min at give rotter en længere periode med eksponering for sociale stimuli. Senere, begrænse analysen af SP test til den indledende 5 min.
      Bemærk: Mindst én Arena og fem kamre er nødvendige for at køre en enkelt session.

3. brug af TrackRodent GUI til adfærdsmæssig analyse

Bemærk: Se det øverste panel af figur 2A for den trackrodent GUI.

1. Åbn MATLAB (testet med 2014a-2019a), og Vælg mappen TrackRodent.
2. Føj alle undermapper til arbejds stien ved at højreklikke på hver mappe og vælge Føj til kurve | Valgte mapper og undermapper.
3. Skriv TrackRodent i kommandovinduet, og tryk på ENTER.
4. Upload en enkelt fil eller flere videofiler (AVI eller MP4-format) ved at vælge Load session File (AVI).
5. En film inspektør, der tillader inspektion af videoklippet ramme for ramme, vil straks blive åbnet for den første fil på listen (figur 2A). Brug den til at undersøge videoklippet og definere de første og sidste billeder af det segment, der skal analyseres. Registrer numrene på disse rammer, som vil blive krævet senere. Luk vinduet, når du er færdig.
6. For at inspicere yderligere videofiler, åbne video Inspector til enhver tid ved at trykke på Undersøg film og vælge en bestemt videofil.
7. Vælg de testede arter (mus eller rotte, mus er standard).
8. Udelad alle de områder, der kan afbryde sporingen, i overensstemmelse med farverne på motivet og arenaen (sort eller hvid).
   1. Hvis du vil udelukke et givet område, skal du trykke på Udeluk område, og når markøren ændres til en kryds figur, skal du markere alle hjørner af området for udelukkelse. Når du er færdig, Højreklik på musen, derefter dobbelt venstre-klik på midten af det markerede område. Det udelukkede område bliver en rød nuance på skærmen. Gentag denne procedure for at udelukke så mange områder som nødvendigt.
9. Hvis du vil fjerne et område fra eksklusion, skal du trykke på Fjern ekskluderet område, derefter (ved hjælp af den krydsede markør) Klik på det område, der skal fjernes fra udelukkelse.
10. For at definere hvert kammer som et "stimulus" område, til automatisk påvisning af sin undersøgelse af emnet, skal du vælge formen af ' stimulus ' området for at være enten polygon eller elliptisk ved at kontrollere den relevante boks, og derefter trykke på stimulus X (hvor "X" repræsenterer 1, 2 eller 3). Marker ' stimulus ' områder på samme måde som de udelukkede områder, som derefter bliver gule i farve. Hvis du vil ændre placeringen af et bestemt ' stimulus '-område, skal du trykke på stimulus X igen og markere den nye område placering (Dette opdaterer automatisk placeringen).
    Bemærk: Vælg de forskellige stimuli nummer på en ensartet måde for alle filer (dvs. objekt som stimulus 1 for alle SP test filer).
11. For at spore tilstedeværelsen af motivet i et bestemt virtuelt rum inde i arenaen, skal du vælge formen af ' rum ' området (polygon eller elliptisk), og tryk derefter på rum X (hvor "X" repræsenterer 1, 2, 3, 4 eller 5). Marker ' rum ' områder på samme måde som de ekskluderede eller stimuli områder, som derefter bliver blå i farve. For at ændre placeringen af et bestemt ' rum ' område, skal du trykke på rum X igen og markere den nye område placering (dette vil automatisk opdatere placeringen).
12. Vælg den ønskede algoritme (BlackMouseBodyBased blev brugt til videoen) fra listen (Se tilgængelige algoritmer i figur 2B).
13. Skriv antallet af start-og billeder til analysen i de tilsvarende redigeringsfelter i GUI.
14. Vælg en tærskel for registrering af emne legemet.
    Bemærk: De fleste algoritmer bruger kun den "lave" tærskel, mens hoved directionalitetsbaserede algoritmer også bruger den "høje" tærskel. For den "lave" tærskel, skal du vælge et niveau, der omfatter musen/rotte krop uden halen (så meget som muligt), mens den "høje" tærskel også bør omfatte halen. I tilfælde af at bruge hoved direktionalitet-baserede algoritmer, vil softwaren bestemme hoved placeringen som værende modsat halen placering.
    Bemærk: Softwaren vil senere ignorere små objekter detekteret ved hjælp af den valgte tærskel.
15. Hvis du vil evaluere automatisk registrering af emne kanterne for en given tærskel, skal du indsætte en værdi i det relevante tærskel felt og trykke på ENTER på tastaturet.
16. Når du vælger flere filer, skal du flytte til den næste fil (ved hjælp af knappen Næste øverst) og vælge de relevante definitioner for hver fil. Når du er færdig, skal du kontrollere parametrene og områdets placeringer for alle filer ved at flytte mellem hver ved hjælp af knapperne forrige og næste øverst i GUI.
    Bemærk: Definitionerne af alle områder og parametre er specifikke for en given fil.
17. Hvis du vil starte adfærdsmæssig analyse af alle valgte filer, skal du flytte til den første fil og trykke på Start.
18. I slutningen af analysen gemmes en resultatfil (. mat-fil) for hver film i den samme mappe i filmfilerne.
    Bemærk: Hvis den langsomme (ikke-hurtige) version af algoritmen bruges, vil den også gemme en version af filmen med et hvidt kryds af midten af Body Mass, som ændrer dens farve hvert billede, der opdages som undersøger, medmindre den Gem analyserede film til/fra-knappen i GUI er umarkeret. Denne version af filmen (gemt i samme mappe med samme navn som den originale film med suffikset ' analyseret film ') kan bruges offline til at evaluere kvaliteten af den automatiske registrering, der udføres af systemet.

4. brug af TrackRodent GUI til resultater præsentation

Bemærk: Se den nederste panel af figur 2A for resultater præsentation.

1. Hvis du vil undersøge resultaterne af hver filmfil, skal du trykke på Indlæs resultatfil og vælge de. mat-filer, der genereres af den adfærdsmæssige analyse.
2. Flyt mellem til/fra-knapperne for at undersøge en af følgende analyser på skærmen: sporing af muse placering (figur 2A); Segmenter besættelse langs session (hvis ' rum ' blev defineret, ikke vist); Stimuli udforskning langs sessionen (figur 2C); Samlet tid i rum (hvis» rum «er defineret, ikke vist) og samlede stimuli efterforsknings tiden (figur 2D).
   Bemærk: ' Stimulus ' områder er områder, hvor softwaren evaluerer emne interaktion, mens ' rum ' områder er områder, hvor softwaren sporer tilstedeværelsen af motivet. Hvis du stopper analysen ved hjælp af knappen stop analyse , gemmes de resultater, der er genereret op til den sidst analyserede ramme, automatisk. For de fleste computere, bør det være muligt at uploade og analysere så mange som 20 film på én gang (afhængigt af computerens ydeevne).

5. brug af TrackRodentPopulationSummary GUI til Populationsanalyse (figur 2E)

1. Åbn MATLAB (testet med 2014a-2019a), og Vælg mappen TrackRodent.
2. Skriv Trackrodentpopulationsummary i kommandovinduet, og tryk på Enter.
3. Upload flere TrackRodent resultater filer (. mat format) ved at trykke på Vælg resultater filer.
4. Udfyld numrene på den sidste ramme til analyse, test navn, stimulus 1-navnog stimulus 2-navn.
5. Vælg de ønskede analyser på listen over valgfrie analyser ved at markere alle relevante rubrikker.
6. Vælg eksportresultaterne til et speadsheet ved at markere det relevante felt for at udtrække alle resultaterne af de kontrollerede analyser som en enkelt regnearksfil.
7. Tryk på Start, og vent, indtil analysen er fuldført.
   Bemærk: Dette afslutter analysen. Softwaren kan bruges til at analysere resultaterne af så mange filmfiler som ønsket, da de alle var adfærds mundtlig analyseret ved hjælp af TrackRodent software. Den analyse, der udføres af softwaren antager videooptagelse med en frame rate på 30 Hz. I tilfælde af, at en anden billedhastighed blev brugt, multipliceres tiden med 30 og divideres med den billedhastighed, der bruges til optagelse, for at konvertere den til den korrekte værdi (er).

Representative Results

Brug af systemet til social præference test i C57BL/6J mus
Figur 1 viser tre versioner af den eksperimentelle opsætning. Den første version (figur 1A-C) er designet til mus med mørke pels farver, såsom C57BL/6j mus. Den anden (figur 1D-F) er planlagt til mus med lyse pels farver, såsom Balb/c eller ICR (CD-1) mus. Den tredje er større (figur 1G-I) og designet til rotter med lyse pels farver, såsom SD-rotter. De første undersøgte emner var naive voksne (8-12 uger gamle), gruppe-opstaldet (to til fem dyr pr bur) mandlige C57BL/6J mus. Sociale stimuli var juvenil (21-30 dage gamle), gruppe-opstaldet (to til seks dyr pr bur), mandlige C57BL/6J mus. Objekt stimuli var lugtfri plastik legetøj med forskellige farver (Indsæt i figur 1C, i). Video filer af forsøgene blev analyseret ved hjælp af TrackRodent software (Body-baseret algoritme, se eksemplificeret skærmbillede og GUI i figur 2A), som automatisk og kontinuerligt spores emne placering baseret på 1) Body Center og 2) kontakten af dens krop konturer med de stimuli-holdige kamre.

Analysen omfattede følgende procedurer. Efter upload af en filmfil og grafisk definering af områder, der skal udelukkes fra analysen, har eksperimententer grafisk defineret to områder, der hver omfatter et særskilt kammer, som "stimuli" (figur 2a, gullige områder). Brugerne kan også definere op til fem områder som virtuelle "segmenter". Derefter, brugere vælger den "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" algoritme fra listen over mulige algoritmer (figur 2B). Efter at have trykket på knappen Start analyse , den software spores dyret placering frame-by-frame og afbildet musen placering spor i arenaen (figur 2A, blå linje). Under denne analyse, softwaren også sporet kontakter mellem ' stimuli ' områder og krops kontur af emnet (figur 2C). Sådanne kontakt hændelser blev defineret som undersøgte og tjente til at beregne undersøgelsestiden for hver stimulus og det tidspunkt, hvor der ikke blev vist nogen undersøgelses adfærd (figur 2D). Som det fremgår af figur 2C, D viser den analyserede film, højere undersøgelsestid for ' stimulus 2 blev observeret ', som var den sociale stimulus, sammenlignet med objektet, som i dette tilfælde blev defineret som ' stimulus 1 '.

Populationsanalyse af den sociale præference test i C57BL/6J-mus
Efter at have ladet TrackRodent software til at analysere alle videofiler af den eksperimentelle gruppe, en populationsanalyse for denne gruppe blev udført ved hjælp af "TrackRodentPopulationSummary" GUI (figur 2E), mens du vælger alle mulige analyser af denne software. De særskilte output af disse analyser for SP-testen udført med 58 C57BL/6J voksne mandlige mus vises i figur 3, præcis som de optrådte på computerskærmen, med alle fejllinjer, der SKILDRER SEM. statistiske analyser af disse resultater blev tidligere offentliggjort¹¹.

Den gennemsnitlige samlede undersøgelsestid for populationen af mod hver af de to stimuli (samme køn juvenil social stimulus og en genstand) vises i figur 3a, som skildrer en klar præference af emnet mod den sociale stimulus. Selvom algoritmen er enkel, blev der observeret en fremragende korrelation (r² = 0,91, p < 10^-6, pearson's korrelation) mellem undersøgelsestiden manuelt målt af en uddannet observatør og den værdi, der beregnes af softwaren. Dynamikken i denne præference kan ses i figur 3B, hvor den gennemsnitlige undersøgelsestid for hver stimulus afbildes langs tiden i 20 s-beholdere. Som vist, social præference vedligeholdes af emnerne i løbet af sessionen, selv om det syntes lidt stærkere i de tidlige stadier.

Figur 3C skildrer undersøgelsestiden for hver stimulus, kategoriseret efter bout varighed i kort (≤ 6 s), medium (> 6 s, ≤ 19 s), og lange (> 19 s) anfald, sammen med den samlede undersøgelsestid. Fordelingen af undersøgelsestid for hver stimulus i henhold til Bout varighed i 1 s siloer vises i figur 3D. Som vist i figur 3C, D, var der ingen forskel mellem stimuli i de korte anfald, mens medium og lange anfald viste klare sociale præferencer. Disse resultater tyder på, at i C57BL/6J mus, korte anfald afspejler nysgerrighed, mens lange anfald afspejler en interaktion mellem motivet og stimuli. Den relative varighed af undersøgelsen (RDI, [social-Object]/[sociale + Object]) værdier for hver kategori (kort, medium og lange anfald), samt for den samlede undersøgelsestid, er vist i figur 3E. Som vist, den højeste RDI værdi opnås med de lange anfald, tyder på, at de bedst afspejler de sociale præferencer af.

At analysere dynamikken i undersøgelsen bout under testen, fordelinger over tid for hver kategori blev separat plottet. Fordelingen over tid af den korte (figur 3F) og medium (figur 3G) undersøgelse anfald tyder på en gradvis reduktion af disse anfald over tid. I modsætning hertil viser en lignende analyse af de lange anfald (figur 3H) en gradvis stigning i løbet af testen. Denne tendens afspejles også af fordelingen af den gennemsnitlige bout varighed (figur 3I), der viser en gradvis stigning over tid. Således ser det ud som om de emner udstillet nysgerrighed primært i de tidlige stadier af testen, mens de senere viste mere interaktion med stimuli. Det skal bemærkes, at der i sidste øjeblik er en iboende skævhed i analysen mod korte anfald, fordi lange anfald blev kunstigt afsluttet ved afslutningen af sessionen. Derfor, når man overvejer tidsforløbet af undersøgelsen anfald, bør det sidste minut ignoreres.

Vi analyserede også intervallerne mellem på hinanden følgende undersøgelser anfald mod samme stimulus (dvs. den tid, det tog emnet at vende tilbage til den samme stimulus efter afslutningen af hver undersøgelse bout). Denne parameter afspejler trangen til emnet for at vende tilbage til den samme stimulus og undersøge. Her blev intervallerne også kategoriseret i korte (≤ 5 s), medium (> 5 s, ≤ 20 s) og lange (> 20 s) anfald, som vises sammen med samlede tidsintervaller for hver stimulus i figur 3J. Histogrammet af intervallerne i 1 s placeringer i vist i figur 3K. Som det fremgår af figur 3J, K, var intervallerne mellem undersøgelserne af de sociale stimuli meget kortere end mellem undersøgelserne af objektet. Derfor gav RDI-værdierne af intervaller i det lange interval den højeste absolutte værdi (figur 3L); Derfor kan de anvendes som en undersøgende tidsuafhængig variabel vurdering af social præference. Fordelingen over tid af intervaller afbildet separat for hver kategori (figur 3M-O) tyder på en gradvis reduktion i korte og mellemstore intervaller og en modsat ændring i lange intervaller mellem undersøgelse anfald, som mest sandsynligt afspejler den generelle forlængelse af undersøgelsen anfald. Svarende til fordelingen af undersøgelsen anfald, det sidste minut af intervaller er forudindtaget mod korte værdier og bør ignoreres.

Vi analyserede også de overgange observeret i emner fra en stimulus til en anden. Dette plot vises i figur 3P, hvor hvert tidspunkt motivet begyndte at undersøge en ny stimulus er markeret med en blå prik, hver række repræsenterer et særskilt emne, og den røde linje repræsenterer den gennemsnitlige overgangs sats. Som det fremgår, var overgangs raten højest (~ 1,5 overgange/min) i løbet af de første 2 minutter af testen og blev gradvist reduceret til mindre end 50% af toppen. Den samme tendens fremgår af fordelingen af den gennemsnitlige overgangs rate over tid (figur 3Q).

Endelig, Heatmaps af undersøgelsen anfald mod den sociale stimulus (figur 3R) og objekt (figur 3s) i løbet af testen for hvert emne er vist, med farverne mærkning bout varighed (figur 3s). Tilsammen tyder resultaterne på, at i C57Bl/6J mus er SP-testen groft opdelt i en tidlig sonderende fase (karakteriseret ved en høj overgangs frekvens og korte efterforsknings anfald) og en sen interaktions fase (karakteriseret ved lav overgangs frekvens og lang efterforsknings anfald).

Populationsanalyse af den sociale nyhed præference test i SD-rotter
Figur 4 viser den samme analyse som ovenfor for SNP-testen udført af 59 SD-rotter. Typisk foretrækker Novel vs. velkendte sociale stimuli er svagere end præference mod en ny social stimulus vs. et objekt, udstillet af mus i SP-testen (figur 3). Ikke desto mindre afspejles den sociale nyheds præference tydeligt af alle parametre. Især, som konkluderet ovenfor fra SP-testen i mus, den lange undersøgelse anfald og lange intervaller er de parametre, der tydeligst udviser forskelle mellem stimuli, som afspejles af deres højeste absolutte RDI værdier (figur 4E, L; det skal bemærkes, at rdi-værdier for SNP-testen er defineret som [velkendt-roman]/[velkendt + roman]).

Tab af whiskers forringer social præference i både C57BL/6J mus og SD-rotter
For at evaluere virkningerne af somatosensorisk manipulation på dynamikken i social adfærd, analyse blev udført af SP test afsluttet af 29 C57BL/6j mus og 33 SD rotter efter hale-trimning (udført 3-7 dage før testning). Derefter blev disse resultater sammenlignet med kontroldyrene. Som vist i figur 5a-F, de Whisker-trimmet mus ikke foretrækker den sociale stimulus over objektet, som afspejlet i den manglende forskel i undersøgelsestid mellem de to stimuli (Sammenlign figur 5A til figur 5D) og tabet af lange undersøgelser anfald mod til social stimulus (Sammenlign figur 5B til figur 5E). Interessant nok viste de Whisker-trimmede mus også øgede overgangs rater i forhold til kontrol mus (Sammenlign figur 5C til figur 5F).

Tilsammen tyder disse data på, at Whisker-trimmede mus markant reducerede varigheden af deres interaktioner med den sociale stimulans. I modsætning til mus mistede Whisker-trimmede rotter ikke deres sociale præferencer (figur 5G-L). Men, de væsentligt ændret deres adfærd i løbet af det første minut af testen, når de havde færre lange undersøgelser anfald (sammen lign figur 5H til figur 5K) og mange flere overgange (Sammenlign figur 5i til figur 5L). Således, hale-trimning væsentligt ændret adfærd både rotter og mus i SP test, men på en meget anderledes måde mellem de to arter. Disse resultater tyder på en særlig rolle for Whisker-afhængige somatosensorisk stimulation i sociale interaktioner af rotter og mus.

Figur 1: eksperimentel opsætning. A) en skematisk skildring af den eksperimentelle Arena designet til mus med sort pels. (B) et billede af arenaen ovenfra, ved hjælp af svagt rødt lys, der viser en C57BL/6j emne mus i arenaen. C) et billede, der viser det maskerede område i et hvidt kammer, hvorigennem motivet interagerer med en stimulus (inset: et billede af et objekt stimulus, der anvendes til mus). (D-F) Som vist i paneler A-C, en eksperimentel Arena og kamre designet til mus med lyse pels. (G-I) Som vist i paneler A-C, en eksperimentel Arena og kamre designet til rotter med lyse pels (inset i [i]: billede af en genstand stimulus anvendes til rotter). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: TrackRodent software. A) en skærm på en computer, der kører TrackRodent-softwaren. Venstre: videobilledet i begyndelsen af den analyserede film (første billede valgt af eksperimententer), der viser de mærkede ' stimuli ' områder og sporet bevægelse sti af C57BL/6J emne. Til højre: softwaren GUI. (B) listen over valgfrie koder for den software, der skal anvendes med GUI. Hver af disse koder passer til en tydelig eksperimentel tilstand. C) analysen af det specifikke eksperiment, der er vist i panel A, når muligheden for stimuli udforskning langs sessionen blev valgt i resultatpræsentationen del af GUI. Dette plot viser (ved hver ramme), om motivet var i kontakt med ' stimulus 1 ' eller ' stimulus 2 '. I den fremlagte sag, en klar præference i retning af "stimulus 2" er indlysende ved det højere antal og varighed af undersøgelsen anfald opdaget i retning af denne stimulus. D) analysen af det eksperiment, der er vist i panel A og C, når muligheden for Total stimuli efterforsknings tiden blev valgt i afsnittet resultater præsentation af GUI. Også her er en klar præference i retning af "stimulus 2" tydelig fra den højere grad af undersøgelsestid i retning af denne stimulans. (E) GUI af TrackRodentPopulationSummary software, der muliggør analyse og plotning af resultaterne fra en population af dyr, som hver analyseres ved hjælp af TrackRodent software (Se figur 3 for resultaterne af en sådan analyse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: analysere undersøgelsen opførsel af C57BL/6J mus under SP test ved hjælp af TrackRodent software. Dette tal viser de forskellige observationsområder for alle fakultative analyser af TrackRodentPopulationSummary-softwaren (figur 2E), der er ansat i en population på 58 C57BL/6j voksne hanmus, der udfører SP-testen. De forskellige parceller vises i en lignende rækkefølge og måde, som de optrådte på computerskærmen (Se afsnittet om repræsentative resultater for en detaljeret forklaring af hvert plot). (A) samlet tid for stimuli undersøgelse, (B) undersøgelse af stimuli langs tid, (C) korte vs lange anfald-samlet tid, (D) 1s bin histogram af anfald, (E) korte vs lang anfald-rdi,f) < 6 s med tiden, (G) 6-19 s anfald langs tid, (H) > 19 s med tiden, (I) gennemsnitlig bout varighed langs tid, (J) korte vs lange intervaller-samlet tid, (K) 1 s bin histogram af intervaller, (L) kort vs lang intervaller-RDI, (M) < 5 s intervaller langs tid, (N) 5 − 20 s intervaller langs tid, (O) > 20 s intervaller langs tid, (P) overgange mellem stimuli-raster plot, (Q) omstilling mellem stimuli langs gange, (R) varme-kort af bout varighed med social, (s) varme-kort over bout varighed med objekt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: analysere undersøgelsen opførsel af SD-rotter under SNP test ved hjælp af TrackRodent software. Observationsområder for alle fakultative analyser af TrackRodentPopulationSummary-softwaren (figur 2E), der anvendes til en population af 59 SD voksne hanrotter, der udfører SNP-testen. De forskellige parceller vises i en lignende rækkefølge og måde, som de optrådte på computerskærmen (Se afsnittet om repræsentative resultater for en detaljeret forklaring af hvert plot). (A-Q) Samme som beskrevet i figur 3. (R) varme-kort over bout varighed med velkendte, (S) varme-kort over bout varighed med roman. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Whisker-trimning af mus og rotter differentielt forringer social adfærd. A) den gennemsnitlige undersøgelsestid (målt i 20 s-beholdere) under SP-testen for mandlig C57BL/6j-mus (n = 58). B) distribution (1 min. skraldespande) af den gennemsnitlige samlede tid for lange (> 19 s) undersøgelser, der er en følge af den SP-test, der er vist i panel A for sociale og objektstimuli. Bemærk den meget længere tid af lange undersøgelser anfald mod den sociale stimulus i forhold til objektet. C) fordeling (1 min. skraldespande) af overgangshastigheden på tidspunktet for den i litra a) viste SP-test. (D-F) Som vist i paneler A-C blev 29 Mures whiskers trimmet ca. 1 uge før testen. Disse dyr mistede deres sociale præference, hvilket afspejles afD) den generelle undersøgelsestid og (E) distribution af lange anfald. De viste også en højere generel sats for overgange (F), hvilket tyder på mindre vedvarende interaktioner med den sociale stimulus. (G-I) Som vist i paneler A-C, 60 SD rotter udført SP test. Bemærk de forskellige dynamik i rotters adfærd i forhold til mus, med lavere overgangs rater og længere perioder med lange undersøgelser anfald i den tidlige fase (2 min) af testen. (J-L) Som vist i paneler G-H, 33 rotter var Whisker-trimmet. Bemærk, at mens rotterne ikke miste social præference efter Whisker-trimning som mus gjorde, dynamikken i deres sociale adfærd i de første 2 min af testen blev ændret, viser flere overgange og færre lange anfald. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Det eksperimentelle system, der er beskrevet her, og som er udformet som et alternativ til 3-kammer apparatet^{2,5, giver}mulighed for udførelse af de samme^{tests, samtidig}med at nogle af dets begrænsninger kan løses. Brugen af trekantede kamre, som er placeret i to modsatte hjørner af den rektangulære Arena begrænser emnet-stimulus interaktion område til en veldefineret plan, hvilket muliggør præcis automatiseret analyse af efterforsknings adfærd. En fordel er brugen af Analysis software (TrackRodent) til at beregne flere adfærdsmæssige parametre for hver test. Det giver også mulighed for Repositionering af kamrene i tilfældige modsatte hjørner af arenaen i de forskellige stadier af paradigmet, neutralisere eventuelle virkninger af rumlige navigation færdigheder.

Desuden er de to hjørner af arenaen, som efterlades tomme i hvert trin, tilbyde emnet et bekvemt sted for hvile og grooming og trække det væk fra kamrene, minimere falsk-positive resultater. Således giver systemet mulighed for direkte vurdering af motivering til at undersøge hver stimulus under SP-og SNP-testene. Desuden, som adfærdsmæssige analyse af videoerne sker på en automatiseret måde af TrackRodent software, en eksperimententer kan indlæse flere film til analyse, definere de korrekte parametre for hver, og lad softwaren proces natten, hvilket sparer kostbar tid. Systemet kan især anvendes til enhver form for social diskriminationstest, såsom diskrimination mellem mænd og kvinder sociale stimuli eller stimuli af særskilte stammer. Desuden er der ingen grænser (øvre/nedre) til størrelsen af emner, der kan spores ved hjælp af dette system; således kan det anvendes med ungfisk eller fede dyr. Dette eksperimentelle system er billigt og enkelt at producere, og de edb-koder, der anvendes til analyse er offentligt tilgængelige som en open-source-koder, så ethvert laboratorium til nemt at vedtage metoden.

Den automatiserede påvisning af efterforsknings adfærd i systemet er baseret på påvisning af fysisk kontakt mellem et forsøgs krops konturer og hvert af de områder, som eksperimententer definerer som "stimuli". Således, hvis emnet rører "stimuli" område med sin krop snarere end hoved, denne begivenhed betragtes undersøgte (dvs., en falsk positiv). Til dette formål blev den Head-directionalitetsbaserede algoritme genereret, som identificerer lederen af emnet og tager kun hensyn til kontakten mellem hovedet og "stimuli". Men denne algoritme kører betydeligt langsommere end de krops baserede algoritmer; Derfor anbefales det ikke til analyse af et stort antal film, medmindre eksperimentelle betingelser kræver det.

Lignende resultater blev observeret (1,1% forskel, n = 11 eksperimenter, 5 min hver, data ikke vist) mellem de to algoritmer; Derfor blev de krops baserede algoritmer oftest brugt. Det skal bemærkes, at selv om analyserne af store grupper af dyr er præsenteret her, en meget mindre gruppe størrelse er nødvendig for at observere en statistisk signifikant forskel mellem to stimuli, baseret på den samlede undersøgelsestid målt af systemet. F. eks. afslørede effekt beregninger, at der kun kræves prøvestørrelser på fem og otte dyr til SP-og SNP-test af mus (α = 0,05, Power = 0,8). Endnu, betydeligt større grupper af dyr blev brugt her for at sikre observation af alle dynamikken i social adfærd.

Systemet kræver, at eksperimententer manuelt definerer tærsklen for påvisning af motivet krops konturer. At finde den rette tærskel, der skal anvendes, kan kræve en vis erfaring; Derfor, de fleste algoritmer, der anvendes i dette system har regelmæssig, langsommere versioner. Disse versioner præsenterer den analyserede film og opdager efterforsknings begivenheder online, mens deres hurtige versioner ikke aktiverer online præsentation. Det anbefales, at nye brugere anvender de almindelige versioner og overvåger analyser online for at sikre, at de fungerer korrekt, og at de kun bruger de "hurtige" algoritmer efter at have samlet erfaringer med analyseproceduren.

En fordel ved dette system over tre-kammer test er, at det måler flere parametre for undersøgelse adfærd, og dermed støtte mere detaljerede analyser. Denne fordel er to gange. For det første behøver eksperimentatoren ikke udelukkende at basere sig på den samlede undersøgelsestid for at bestemme præferencen. Det blev konstateret, at den lange undersøgelse anfald og lange intervaller er mere følsomme end den samlede undersøgelse tid, når afsløre en præference for en stimulus over en anden. Med hensyn til disse parametre skal det bemærkes, at deres værdier i det sidste minut af testen er partisk nedad, da den lange undersøgelse anfald og intervaller afsluttes for tidligt i slutningen af 5-min session.

For det andet tillader de mange parametre afsløring af subtile ændringer i dynamikken i social undersøgelse efter forskellige manipulationer. For eksempel blev det konstateret, at C57BL/6J mandlige mus mistede deres sociale præference efter Whisker-trimning. I modsætning hertil beholdt SD hanrotter deres sociale præference, men ændrede social adfærd dynamik som vist ved kortere undersøgelse anfald og højere niveau af overgange i den tidlige fase af testen. Samlet set tyder disse data på en reduktion i tendensen hos rotter og mus for sociale interaktioner efter hale-trimning. Således, dette system understøtter en grundig analyse af dynamikken i social adfærd, som kan være meget følsom over for forskellige manipulationer.

Kort sagt, vi præsenterede her en roman, enkel, og overkommelige eksperimentelle system, der understøtter automatiseret analyse af social Investigation adfærd dynamik. Dette system vil lette detaljerede analyser af sociale adfærdsmæssige underskud i forskellige stammer og genetisk modificerede linjer af små gnavere. Endvidere, den præcise påvisning af undersøgelse anfald demonstreret her, kombineret med evnen af dette system til at analysere adfærd, mens emner er forbundet til elektriske kabler eller optiske fibre, tillader dets anvendelse i eksperimenter, der involverer optagelse hjerneaktivitet i forbindelse med social adfærd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (formerly PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Monochromatic Camera
FlyCap 2.0	FLIR (formerly PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Video recording software
Home 5 minute Epoxy glue	Devocon	20845	For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Programming environment
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	For arena and stimuli chambers construction
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply	2012topdeal eBay supplier	NaN	For illumination of the acoustic chamber