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Immunology and Infection

Imagen tridimensional de células bacterianas para representaciones celulares precisas y localización precisa de proteínas

Published: October 29, 2019 doi: 10.3791/60350
Automatic Translation
2, 1, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, 2Department of Molecular Biology and Lewis-Sigler Institute of Integrative Genomics, Princeton University

Summary

Este protocolo explica cómo preparar y montar muestras bacterianas para imágenes tridimensionales en vivo y cómo reconstruir la forma tridimensional de E. coli a partir de esas imágenes.

Abstract

La forma de una bacteria es importante para su fisiología. Muchos aspectos de la fisiología celular como la motilidad celular, la depredación y la producción de biopelículas pueden verse afectados por la forma celular. Las células bacterianas son objetos tridimensionales (3D), aunque rara vez se tratan como tales. La mayoría de las técnicas de microscopía dan como resultado imágenes bidimensionales (2D) que conducen a la pérdida de datos relacionados con la forma real de las células 3D y la localización de proteínas. Ciertos parámetros de forma, como la curvatura gaussiana (el producto de las dos curvaturas principales), solo se pueden medir en 3D porque las imágenes 2D no miden ambas curvaturas principales. Además, no todas las células se encuentran planas cuando el montaje y las imágenes 2D de células curvas pueden no representar con precisión las formas de estas células. La medición precisa de la localización de proteínas en 3D puede ayudar a determinar la regulación espacial y la función de las proteínas. Se ha desarrollado una técnica de convolución hacia adelante que utiliza la función de desenfoque del microscopio para reconstruir formas celulares 3D y localizar con precisión proteínas. Aquí, se describe un protocolo para preparar y montar muestras para imágenes celulares vivas de bacterias en 3D tanto para reconstruir una forma celular precisa como para localizar proteínas. El método se basa en la preparación simple de muestras, la adquisición de imágenes fluorescentes y el procesamiento de imágenes basado en MATLAB. Muchos microscopios fluorescentes de alta calidad se pueden modificar simplemente para tomar estas medidas. Estas reconstrucciones de células son intensivas desde el punto de vista computacional y se recomienda el acceso a recursos computacionales de alto rendimiento, aunque no es necesario. Este método se ha aplicado con éxito a múltiples especies bacterianas y mutantes, modalidades de imágenes fluorescentes y fabricantes de microscopios.

Introduction

Las células de todo tipo regulan sus formas para funciones específicas. Por ejemplo, las neuronas tienen una forma diferente a las células sanguíneas y tienen diferentes funciones. Del mismo modo, las células bacterianas vienen en una variedad de formas y tamaños, aunque el propósito de estas formas no siempre se conoce1,2. Por lo tanto, es importante que la forma de las células bacterianas se determine con precisión. El método descrito muestra una forma fácil de recopilar datos adecuados para el análisis 3D de la mayoría de las células bacterianas vivas o fijas.

El método descrito permite tomar imágenes 3D de células bacterianas con el fin de representar con precisión la forma de la célula 3D de la muestra y localizar con precisión las proteínas dentro de estas formas. Las técnicas tradicionales de microscopía toman imágenes 2D, lo cual es problemático cuando se estudian células que tienen formas anormales o no simétricas, como mutantes de Escherichia coli,o bacterias curvas como Vibrio cholerae y Helicobacter pylori. Aunque las imágenes 3D de alta resolución son la entrada clave de este método, el método no devuelve una imagen con resolución mejorada. Más bien, este método reconstruye las coordenadas de superficie 3D y la forma de la celda utilizando un algoritmo de convolución hacia adelante utilizando contornos activos y la función de desenfoque aparente del microscopio3 (Figura 1). Se ha utilizado para estudiar el homolog de actina bacteriana MreB en E. coli4,5,6,7, el novedoso elemento periesquelético CrvA en V. cholerae8, y el putativo putativo bactofilinCcmA en Helicobacter pylori9 (Figura 2).

La localización de proteínas puede dar una idea de sus funciones. Por ejemplo, las proteínas implicadas en la división celular normalmente se localizan en la celda media10,11. Se han realizado estudios de alto rendimiento para localizar todas las proteínas de una bacteria con la esperanza de obtener información sobre sus funciones12. Desafortunadamente, estos estudios se realizaron con imágenes 2D y análisis 1D o 2D, lo que imposibiliza medir aspectos específicos de la localización de proteínas, como la localización de características geométricas celulares.

Por ejemplo, MreB, una proteína dinámica necesaria para la forma de varilla de muchas bacterias, se presume que funcione dirigiendo la localización de la síntesis de la pared celular, y su localización refleja la localización de la síntesis de la pared celular7,13. MreB de múltiples especies muestra enriquecimiento geométrico4,6,7,14,15. Los polímeros de superficie dinámicos, como MreB, pueden acoplar la geometría de la superficie al perfil de enriquecimiento promediado en el tiempo16 y pueden ser capaces de orientarse a geometrías específicas minimizando la energía asociada con la unión a la membrana17. Aunque la importancia de la torsión, la agrupación, la flexión y la dinámica no se ha resuelto por completo para MreB, es importante tener en cuenta que las mediciones precisas de ambas curvaturas principales de una superficie requieren una representación 3D completa de la celda. Por lo tanto, para medir con mayor precisión las curvaturas a las que se localizan las proteínas, es preferencial utilizar imágenes 3D, en lugar de imágenes 2D. Las imágenes 3D eliminan la necesidad de estimar computacionalmente aquellas curvaturas que no se pueden medir en 2D, una estimación que podría no ser precisa en celdas asimétricas18.

Aunque las imágenes 2D de las células son más rápidas y no requieren tanto trabajo computacional postimagen, las imágenes 3D proporcionan una representación más precisa de la célula, así como la capacidad de medir las entidades de la superficie, como la curvatura, que no se puede medir en 2D. Por lo tanto, a medida que las imágenes 3D se vuelven más comunes, se harán posibles nuevos conocimientos sobre la forma celular y la localización de proteínas.

Protocol

1. Preparación de muestras

  1. Haga fluorescente E. coli para la toma de imágenes, ya sea innitiándolas para expresar una proteína fluorescente citoplasmasmática6 o utilizando un tinte de membrana5. Se pueden utilizar otras especies bacterianas en lugar de E. coli.
    1. Transforma las células a través de la electroporación con un plásmido que codifica la proteína fluorescente citoplasmática mCherry.
      NOTA: Se pueden utilizar diferentes proteínas fluorescentes de otros colores.
    2. Cultivar los transformadores en una placa de LB con el antibiótico adecuado a 37 oC. Obtener colonias individuales e identificar clones positivos mediante microscopía. Las colonias resistentes a los antibióticos que aparecen de color rojo bajo el microscopio contienen el plásmido que transporta mCherry.
  2. Crecer 2 ml del cultivo nocturno en medios líquidos LB con los antibióticos adecuados a 37 oC en una incubadora de agitación. Utilice una colonia de un plato o una pequeña cantidad de un material de congelador como el inóculo.
    NOTA: Utilice los medios necesarios para las células bacterianas seleccionadas para el experimento.
  3. Subcultura el cultivo nocturno 1:1,000 en 5 ml de medios LB frescos y dejar que las células crezcan hasta la fase exponencial a 37 oC en una incubadora de temblores durante 3 x 4 h. Mida la OD600 de las células para confirmar que están en la fase exponencial (es decir. , OD600 a 0,2 x 0,4).
    NOTA: Las imágenes se pueden realizar en cualquier etapa de crecimiento dependiendo del experimento que se realice.

2. Preparación de diapositivas

NOTA: Es importante utilizar medios que tienen baja autofluorescencia. Se puede utilizar cualquier medio que tenga baja autofluorescencia. En este experimento, se requiere un 1% de agarosa M63 con almohadillas de medios mínimas y sellado con VaLaP19 para crear imágenes de células en 3D.

  1. Preparar una solución del 1% de agarosa en 20 ml de medios mínimos.
    1. Microonda la solución hasta que la agarosa se disuelva por completo y la solución parezca clara.
    2. Conservar la solución en un baño de agua a 60oC hasta que esté lista para usar.
      NOTA: Esta solución se puede solidificar y fundir según sea necesario o puede ser alícuota en cantidades más pequeñas que se derriten según sea necesario. Después de múltiples usos, el medio puede decolorarse y debe reemplazarse.
  2. Derretir el sellador VaLaP en una placa caliente a 80 o 100 oC.
    NOTA: Preparar VaLaP, para ser utilizado como sellador, derritiendo 50 g cada uno de vaselina, lanolina y parafina juntos en un vaso de precipitados en una placa caliente a 80 o 100 oC. Esta gran cantidad de VaLaP se puede almacenar a temperatura ambiente indefinidamente y será suficiente para >500 diapositivas. La calefacción a >100 oC hará que se degrade y su color se oscurecerá.
  3. Coloque dos pilas cada una de tres resbalones de cubierta de 20 mm x 20 mm en los extremos opuestos de una diapositiva (seis tapas totales).
  4. Pipetear 200 l de solución de almohadilla de agarosa en la corredera.
    NOTA: Si no se utiliza una mancha fluorescente de ingeniería, se puede añadir un tinte de membrana a la solución de almohadilla de agarosa antes de este paso. Resuspenda el tinte en agua y agregue el tinte a 1 ml de la solución de almohadilla de agarosa a una concentración final de 5 g/ml.
  5. Coloque inmediatamente y firmemente un segundo deslizamiento hacia abajo en la pila de resbalones de la cubierta para aplanar el agar y dejar que se solidifique durante 1 min a temperatura ambiente.
  6. Deslice con cuidado la diapositiva superior.
  7. Utilice el extremo grande de una punta de pipeta de 200 ml para cortar almohadillas individuales del gel (5 mm de diámetro) en la corredera y deseche el gel malformado o innecesario.
    NOTA: Si se toma imágenes de múltiples cepas o condiciones, se necesitará una almohadilla separada para cada una. Si solo se va a crear una deformación unitaria, haga 3 x 4 almohadillas para ayudar a apoyar el cubreobjetos.
  8. Pipetear las células hacia arriba y hacia abajo varias veces para interrumpir los grumos celulares y asegurarse de que el cultivo esté bien mezclado. Pipeta de 1 l de subcultivo del paso 1.3 sobre una almohadilla.
    NOTA: Las reconstrucciones de la forma celular requieren células individuales que no están tocando otras células. Si se utilizan cultivos de fase estacionaria o de alta densidad celular, puede ser necesario diluir la muestra 1:10 antes de colocarla en la almohadilla.
  9. Deje que la muestra se seque al aire durante 5 x 10 minutos. Si queda algún líquido, las células se moverán en el líquido y no se pueden crear imágenes.
  10. Coloque un resbalón de cubierta en la parte superior de las almohadillas.
  11. Selle el resbalón de la cubierta con VaLaP derretido cepillando suavemente alrededor del borde del resbalón de la cubierta con un hisopo de algodón. Asegúrese de mantenerlo alejado de la parte superior del resbalón de la cubierta donde se tocará el objetivo. El VaLaP se endurecerá en cuestión de segundos, sellando la muestra.
  12. Inmediatamente imagen de la muestra.
    NOTA: La muestra debe ser imagee tan pronto como se prepare la diapositiva. Las células pueden crecer en las almohadillas, y si dividen las reconstrucciones será más difícil.

3. Requisitos de imagen

  1. Asegúrese de que la z o el eje de enfoque del microscopio pueden realizar movimientos precisos de menos de 50 nm. Utilice las etapas z piezoeléctricas (ver Tabla de materiales),disponibles en microscopios de grado de investigación, ya que los dispositivos de enfoque motorizados típicos no pueden proporcionar esta precisión.
    NOTA: Suponiendo que el criterio de muestreo Nyquist-Shannon20, uno necesita tener la capacidad de mover 0.5x el tamaño de paso deseado más pequeño, o 2 veces la frecuencia espacial deseada. Para los pasos de 100 nm necesarios en este protocolo, se requiere una etapa con una precisión de 50 nm o menos.
  2. Asegúrese de que el microscopio contiene un objetivo 100x con una apertura numérica mínima (NA) de 1.45.
    1. Recoja las pilas z de entre 200-400 células diferentes para asegurarse de que se obtengan suficientes celdas para las aplicaciones descendentes.
      NOTA: El número de células necesarias depende de la variabilidad subyacente de la muestra de interés. Algunas de las células recogidas en este punto no lo harán a través de los pasos de reconstrucción.
  3. Asegúrese de que la pila z coincida con la configuración utilizada para el canal de forma si se mide un canal fluorescente secundario (proteína, etiqueta metabólica, etc.).

4. Imágenes

  1. Inserte la corredera sellada en el microscopio y déjela sentarse durante 5 minutos para equilibrar la temperatura con el entorno, ya que la sala del microscopio puede estar a una temperatura diferente a la sala de preparación de la muestra.
  2. Tome una pila z fluorescente de la muestra.
    NOTA:     La pila z debe cubrir completamente la muestra con un espaciado z inferior a la profundidad de campo. Para un objetivo de 1,45 NA 100x y células de E. coli de 1 m de espesor, 40 pasos a 100 nm por paso funcionan bien. Para células o células más grandes que no se encuentran perfectamente planas en la superficie, pueden ser necesarias 50 o más pasos. Incluya suficientes pasos y asegúrese de que la muestra esté completamente borrosa por encima y por debajo.
    1. Utilice el software asociado con el microscopio (ver Tabla de Materiales)para controlar el microscopio.
    2. Concéntrese en la mitad de la célula utilizando las ruedas de enfoque del microscopio. En Adquisición ND marque la casilla Z para tomar una pila z. Haga clic en el botón Inicio para establecer el centro de la celda como punto de partida. Establezca el tamaño del paso en 0,1 m y establezca el rango en 4 m. Asegúrese de que el dispositivo Z esté ajustado a la fase piezoeléctrica.
    3. Establezca los canales fluorescentes en la ventana de Lambda en la configuración de las moléculas fluorescentes que se están creando imágenes. En este experimento se utilizaron GFP y mCherry.
      NOTA: Tome una pila z adicional con el mismo tamaño de paso y rango en el segundo canal de color si se desea la distribución 3D de un canal fluorescente adicional. En este experimento, se utilizó mCherry citoplasmático para determinar la forma de la célula y MreB-GFP se utilizó como un segundo canal de color21.
    4. Asegúrese de que el Orden del experimento esté establecido en lambda (serie z) para que tome una pila z completa en cada canal de color antes de cambiar.
    5. Haga clic en Ejecutar ahora para iniciar la adquisición de la imagen y guardar el archivo onece uno o ambas pilas z están completas.
    6. Muévase a un área nueva en el pad y repita los pasos 4.2.2-4.2.5.

5. Reconstrucción celular

  1. Recorte celdas individuales y guarde las imágenes como un archivo tiff apilado para que solo haya una celda por archivo. Asegúrese de que esta celda esté bien aislada de cualquier otra celda (es decir, aproximadamente 5 veces la mitad máxima de ancho completo de la función de desenfoque en xy.
    NOTA:     Esto se puede hacer utilizando el software de análisis de imágenes disponible libremente (consulte Tabla de materiales).
    1. Dibuje un cuadro alrededor de una celda individual y Duplique esa celda 2x, una vez para cada canal. Asegúrese de que el cuadro de hiperpila duplicado esté marcado y cambie el canal a 1 o 2, asegurándose de que los sectores incluyan toda la pila z.
      NOTA: Si toma imágenes solo de la forma de las células y no de una proteína fluorescente adicional, solo habrá un canal.
    2. Una vez que ambas pilas estén disponibles, vaya a Imágenes . Pilas ? Herramientas ? Concatenar para combinar las imágenes con el canal de proteína primero y el canal de forma segundo.
    3. Guarde la nueva imagen como un archivo tiff.
  2. Mida la función de desenfoque del microscopio utilizando perlas fluorescentes limitadas de subdifracción22. Esto debe hacerse para cada objetivo de microscopio y microscopio, pero se puede realizar antes o después de tomar imágenes de las muestras de interés.
    1. Promedio de múltiples perlas independientes con alguna intervención manual utilizando el software disponible (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: El producto final debe ser una imagen 3D de la función de desenfoque con el mismo espaciado xyz que las muestras de interés.
  3. Ejecute los scripts de reconstrucción de la forma de la celda de convolución hacia delante utilizando el software disponible. La última versión de estos scripts se puede descargar libremente desde https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
    1. Haga una carpeta dentro de una carpeta en el escritorio que contenga las imágenes recortadas y el archivo cell_shape_settings_tri.txt de shae-cellshape-public/exampleData_tri.
    2. Edite cell_shape_setting_tri.txt para tener la configuración correcta para el experimento de interés. Para este experimento, el archivo de configuración incluye las siguientes líneas:
      nm_per_pixel 70
      Z_scale 0.65
      stack_z_size 41
      stack_t_size 1
      Fstack_z_size 41
      Fstack_t_size 1
      stack_seperation_nm 100
      Fstack_seperation_nm 100
      psfScript -999 osuPSF20180726
      gradiente 1

      NOTA: Este archivo de texto se organiza en secciones y cada sección se analiza en su propia variable. Si bien muchos de los ajustes no necesitan ser cambiados de experimento a experimento, uno debe asegurarse de que el tamaño de la z-stack (stack_z_size para la forma, Fstack_z_size para la proteína de interés), espaciado de la z-pila (stack_seperation_ nm, Fstack_seperation_nm), desplazamiento focal relativo del microscopio (Z_scale)23, el tamaño de píxel en xy (nm_per_pixel), y el nombre del script que carga la función de desenfoque del microscopio (psfScript ) coinciden con el experimento. El campo de degradado debe establecerse en 1 si el canal de forma está lleno citoplasmay a 0 si se trata de un objeto teñido de membrana.
    3. Ejecute la función Cell_shape_detector3dConvTriFolder (shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/) con la cadena en la ubicación de la carpeta seguida del número de la celda en la que se va a iniciar y el número de celdas que desea ejecutar.
      NOTA: Un ejemplo de la entrada tendrá el siguiente aspecto: Cell_shape_detector3dConvTriFolder ('ruta a la carpeta con imágenes recortadas', índice inicial en la carpeta, número de celdas). Una célula típica puede tomar entre 5 y 20 minutos para que la reconstrucción converja y termine.
  4. Realice la pantalla de las reconstrucciones celulares para asegurarse de que son correctas antes de usar las celdas para cualquier análisis estadístico.
    1. Ejecute ScreenFits (shae-cellshape-public/shae-fitViewerGui/) para visualizar visualmente las reconstrucciones de celdas individuales.
    2. Haga clic en el botón Seleccionar carpeta cuando se abra la interfaz gráfica de usuario (GUI) y, a continuación, seleccione la carpeta con los archivos de datos de reconstrucción (TRI.mat) creados en el paso 5.3.
    3. Seleccione la casilla situada junto a la reconstrucción de celdas si una celda aparece deformada o no convergente completamente(Figura 3). Esto podría parecer una celda con un agujero, un lado plano o una rama saliendo de ella. Esto añadirá 'FLAG' al nombre de archivo para que pueda ser excluido de cualquier análisis descendente.
      NOTA: La celda reconstruida se puede comparar con las imágenes originales. Esto puede ser especialmente importante si las células provienen de una población heterogénea de formas.
  5. Ejecute enrichmentSmoothingSpline (shae-cellshape-public/) para crear un perfil de enriquecimiento de la concentración relativa de la proteína de interés en función de la curvatura gaussiana en la superficie.
    1. Seleccione cada carpeta con archivos TRI.mat creados en el paso 5.3.3.
    2. Seleccione el archivo curve.mat recién creado (5.5.1).
      NOTA: Se creará un archivo curve.mat para cada carpeta seleccionada en 5.5.1. Todos los perfiles de enriquecimiento se presentarán en un gráfico. Si se requieren gráficos individuales que la ejecución 5.5 para cada carpeta.
      NOTA: Además de la localización geométrica precisa de una proteína fluorescente, hay muchas otras formas de analizar los datos del canal secundario, incluyendo contar el número, tamaño y orientación de los objetos4.

Representative Results

Las bacterias vienen en una amplia variedad de formas y tamaños que pueden determinar sus funciones en la naturaleza1. El resultado de este procedimiento es una representación 3D precisa de las celdas a partir de la convolución hacia adelante de una pila z de imágenes(Figura 1). Este método es especialmente importante cuando se trata de celdas curvas(Figura 2), o con celdas con formas anormales(Figura 4A),ya que una representación 2D no refleja la curvatura de las celdas con precisión. Para utilizar el método de convolución hacia adelante(Figura 1A),las células deben estar manchadas periféricamente o tener una mancha citoplasmática(Figura 2B izquierda vs. derecha).

El cuadro 4 muestra la localización MreB en la célula. Se realizó una fusión GFP a la proteína de actina bacteriana MreB21 con el fin de estudiar su localización precisa tanto en células de tipo salvaje como mutantes de E. coli 4. Debido a que MreB está asociado con la membrana, se requiere imágenes 3D para reproducir fielmente su posición en la célula. Al realizar estas mediciones en 3D, pudimos reconstruir las formas de las células mutantes de tipo salvaje y rodZ (Figura 4A). Se demostró que la localización de MreB se enriquecía en pequeñas curvaturas gaussianas, una característica geométrica que sólo se puede medir en 3D, de forma dependiente de RodZ(Figura 4B).

Figure 1
Figura 1: El método de convolución hacia delante reconstruye las celdas sin conocimiento previo de la forma de la célula. (A) La salida final del método es una reconstrucción de células 3D derivada comparando una forma de prueba con la función de desenfoque calibrada del microscopio. Esto se compara con la pila z observada hasta que la imagen 3D observada coincide con la hipotética. La imagen que se muestra aquí es una representación de la reconstrucción de una célula de C. crescentus. (B) La tubería de reconstrucción actualiza iterativamente las posiciones estimadas de los elementos de superficie en función de la pila de imágenes observada. Para obtener detalles algorítmicos completos del método, véase Nguyen3. (C) La tubería de reconstrucción comienza sin conocimiento a priori de la forma de la celda y actualiza la posición y el número de vértices de superficie para que coincidan con la pila z observada. Las imágenes representativas de cada 30 pasos durante la reconstrucción 3D se muestran desde tres ángulos diferentes de una célula V. cholerae. Las posiciones de superficie de esta forma se actualizan para minimizar la diferencia entre las pilas simuladas y observadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Reconstrucciones 3D representativas de tres especies bacterianas de diferentes formas. Las reconstrucciones tridimensionales pueden hacerse a partir de células con su membrana teñida (izquierda) o llenas de un fluoróforo citoplasmático (derecha). La forma y curvatura de la celda inicial no es importante, ya que una varilla doblada, varilla retorcida o varilla recta son capaces de reconstruirse con precisión. Las superficies reconstruidas se colorean en función de la curvatura gaussiana local de la superficie. Barra de escala a 1 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Las reconstrucciones pueden fallar por varias razones. Las celdas deben ser examinadas para asegurarse de que el algoritmo de reconstrucción convergió a un resultado razonable. Izquierda: tipo salvaje representativo (arriba) y rodZ mutante (abajo) Células E. coli que han pasado el control de calidad. Derecha: celdas que no se reconstruyeron correctamente y no pasaron el control de calidad. Se muestran cinco clases de convergencia fallida: (i) celdas que están demasiado cerca del borde de la región de recorte que conducen a una demarcación aguda, (ii) celdas que están demasiado cerca de otra celda, (iii) células que produjeron un divot, (iv) células que no continuaron más allá de la s inicial tarting, y (v) otros errores desconocidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Datos representativos que muestran la localización de proteínas a geometrías celulares específicas. (A) Células tridimensionales reconstruidas de tipo salvaje y células de varilla Z E. coli con curvatura gaussiana y se muestra la intensidad de fluorescencia MreB. Barra de escala a 1 m.(B) Parcelas de enriquecimiento de MreB a partir de células de tipo salvaje y varillaZ E. coli. Los valores >1 muestran el enriquecimiento y los valores <1 muestran agotamiento de MreB de estas regiones celulares en relación con la cobertura uniforme de la célula. Las áreas sombreadas indican el intervalo medio de confianza de arranque del 90 % de la media. La curva para cada deformación unitaria es una spline de suavizado cúbica y se trunca utilizando un umbral de probabilidad para curvaturas extremas de p > 5 x 10-3. Esta cifra ha sido modificada de (Bratton et al.) 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Un paso crítico en este protocolo es la adquisición de imágenes de alta calidad. Para reconstruir correctamente las celdas, debe haber suficiente desenfoque por encima y por debajo de la celda. Por lo tanto, es imperativo que la pila z tomada cubra una distancia lo suficientemente grande. El número de pasos realizados durante la adquisición de la imagen se puede ajustar para cada cepa. Por ejemplo, las células de E. coli eliminadas para rodZ son más anchas y requieren más pasos y, por lo tanto, una mayor distancia que las células de tipo salvaje. Si la muestra se desvía durante la adquisición de la imagen, la reconstrucción puede tener errores importantes. Por lo tanto, es importante dejar que la diapositiva llegue al equilibrio térmico con el microscopio antes de la toma de imágenes para evitar la deriva durante la adquisición de la pila z. Las células deben ser imágenes en almohadillas con baja autofluorescencia. Los componentes multimedia, como los que se encuentran en el medio LB común, tienen autofluorescencia que puede causar problemas al intentar reconstruir las células. La densidad de las células en el panel de imágenes es importante porque el proceso de reconstrucción se realiza de forma independiente en cada célula. Muy pocas células aumentarán el tiempo necesario para obtener imágenes de un número suficiente de células, mientras que demasiadas células darán lugar a campos de imágenes que son demasiado densos para recortar fácilmente celdas individuales. Debido a que no todas las celdas se reconstruyen correctamente, las celdas adicionales deben ser imágenes durante el paso de adquisición y todas las salidas deben ser examinadas antes de avanzar con el análisis estadístico(Figura 3).

Muchas de las limitaciones para este método son técnicas. En el microscopio a utilizar, uno debe tener un objetivo que tenga una alta apertura numérica (típicamente >1.4), ya que esto permite el seccionamiento óptico en la escala de tamaño de las bacterias. Además, el microscopio debe estar equipado con una etapa piezoeléctrica que pueda dar pasos pequeños y precisos en la dirección z. Además, aunque no es necesario, se recomienda encarecidamente el acceso a recursos computacionales de alto rendimiento para ejecutar el software de análisis de imágenes, ya que reducirá el tiempo de procesamiento para reconstruir celdas.

Una limitación conceptual al método es que se deben elegir las escalas de energía correctas para ponderar la suavidad de la reconstrucción en relación con la relación señal-ruido de las imágenes. Para validar una selección de parámetros, los tamaños y formas de las células deben medirse utilizando métodos independientes como la microscopía electrónica de transmisión (TEM) o la microscopía de fuerza atómica (AFM). Como prueba de principio, las reconstrucciones 3D de las células se realizaron en un AFM para probar la precisión z (<50 nm) o en una cuadrícula TEM para probar la precisión xy (<30 nm)3. Este enfoque correlacionado consume mucho tiempo y es costoso. Un enfoque más simple puede ser la imagen de muestras estándar, como células de tipo salvaje o perlas esféricas de 1 m. El diámetro y la esfheriidad de las reconstrucciones se pueden utilizar para garantizar que el tamaño y las escalas de energía utilizadas en la reconstrucción sean correctos.

Este no es el único método que busca extraer información espacial de alta resolución de imágenes de microscopía de fluorescencia. Muchos artículos de revisión describen los avances recientes en el campo de la microscopía de superresolución24,25. Técnicas de mejora de la resolución como la microscopía de desconvolución26,la microscopía confocal de disco giratorio27,la reasignación de píxeles28y la microscopía de iluminación estructurada (SIM)29 buscan mejorar la resolución de la imágenes adquiridas por el microscopio. Estos métodos no son incompatibles con el enfoque presentado. Recientemente este método fue adaptado para permitir imágenes basadas en SIM como entradas9. Mientras que el método de convolución hacia adelante comparte algunos de sus fundamentos con la microscopía de deconvolución, tiene una salida completamente diferente. Mientras que los enfoques como la microscopía de desconvolución buscan mejorar la resolución de la imagen, este enfoque no genera una imagen, sino más bien una reconstrucción de la forma celular con aproximadamente 50 nm de precisión. Las técnicas de microscopía de control activo de una sola molécula basadas en muestras escasamente etiquetadas pueden proporcionar niveles aún más altos de precisión espacial que este método. En muchos casos, estos enfoques de molécula única requieren la optimización de las construcciones fluorescentes y pueden requerir largos tiempos de adquisición, lo que hace que sean difíciles de usar con muestras vivas o dinámicas. Cada uno de estos métodos viene con una o más advertencias que este método no. Por ejemplo, los beneficios anunciados por la microscopía confocal de disco giratorio no son aplicables a las monocapas de células bacterianas, donde no hay mucho fuera de la luz plana. Además, este método proporciona una tubería para adquirir formas celulares 3D precisas y localización de proteínas sin la necesidad de ningún fluoróforo especializado. Este método tiene requisitos mínimos de hardware (es decir, z piezo, objetivo de alto NA) y requiere sólo decenas de imágenes por punto de tiempo, lo que permite investigar fácilmente estructuras 3D dinámicas6.

Ha habido un número cada vez mayor de enfoques para estudiar la organización de las células bacterianas en las estructuras 3D. Estos incluyen enfoques conceptualmente similares a esto que aprovechan imágenes de fluorescencia 3D de alta calidad30,31,32. Este enfoque requiere células bien aisladas y no hace suposiciones a priori sobre la geometría celular. Sin embargo, para moverse en densos agregados celulares o biopelículas, se supone que las células son como varillas. Esta vista de resolución más baja todavía permite investigar los arreglos de embalaje de las células, aunque la alta densidad de células en el biofilm impide el análisis de la localización subcelular de factores específicos.

En el futuro, puede ser interesante desarrollar un marco para integrar los enfoques de una sola molécula y campo ancho con esta técnica de reconstrucción 3D. Además, puede ser posible incluir este enfoque de convolución hacia adelante con las herramientas de segmentación de visión artificial32 para permitir reconstrucciones de racimos de células más densos.

Por qué las células evolucionaron a formas específicas es un problema complejo que debe reflejar el entorno complejo en el que viven. Comprender la evolución y la función de las formas celulares requiere tomar mediciones precisas y precisas de esas formas, que es lo que proporciona este método.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Jeffrey Nguyen y Joshua Shaevitz por ayudar a desarrollar este método.
Financiación: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - Glenn Centers for Aging Research y National Science Foundation PHY-1734030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 nm fluorescent beads Invitrogen F8795 these are used to measure the blurring function of the microscope
Agarose sigma-Aldrich A9539
Cotton Swab Puritan Medical Products Company LLC S304659 used to appy VaLaP
Cover Slips VWR 16004-302
Fiji ImageJ https://fiji.sc used to cro cells
FM4-64 Invitrogen LST3166 membrane dye used to stain cells
Huygens Software Scientific Volume Imaging Huygens essential or professional Use to measure blurring function of microscope
Lanolin Sigma-Aldrich L7387 combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP
LB growth medium BD Difco DF0446173
M63 medium US Biological M1015
MATLAB Mathworks Needed to run forward convolution scripts
Microscope Slides Fisher 12-550-133
NIS Elements Nkon
Paraffin Sigma-Aldrich 327212
Petroleum Jelly Equate 49035-038-27
Piezo z stage Nikon 77011589
Pipet tips -p200 USA Scientific 1111-0730
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Imagen tridimensional de células bacterianas para representaciones celulares precisas y localización precisa de proteínas
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Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization. J. Vis. Exp. (152), e60350, doi:10.3791/60350 (2019).

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