Denne systematiske protokollen beskriver en ny dyremodell av posttraumatisk epilepsi etter repeterende mild traumatisk hjerneskade. Den første delen detaljer skritt for traumatisk hjerneskade induksjon ved hjelp av en modifisert vekt fall modell. Den andre delen gir instruksjoner om kirurgisk tilnærming for en- og flerkanals elektroencefalografiske datainnsamlingssystemer.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en ledende årsak til ervervet epilepsi. TBI kan resultere i en fokal eller diffus hjerneskade. Fokal skade er et resultat av direkte mekaniske krefter, noen ganger penetrerer gjennom kraniet, og skaper en direkte lesjon i hjernevevet. Disse er synlige under hjerneavbildning som områder med kontusjon, kutting og blødning. Fokale lesjoner induserer nevronal død og glial arrdannelse og er tilstede hos 20%−25% av alle mennesker som pådrar seg en TBI. Men i de fleste TBI tilfeller, skade er forårsaket av akselerasjon-retardasjon krefter og påfølgende vev klipping, noe som resulterer i ikke-fokal, diffus skade. En underpopulasjon av TBI-pasienter fortsetter å utvikle posttraumatisk epilepsi (PTE) etter en ventetid på måneder eller år. For tiden er det umulig å forutsi hvilke pasienter som vil utvikle PTE, og anfall hos PTE-pasienter er utfordrende å kontrollere, noe som krever videre forskning. Inntil nylig var feltet begrenset til bare to dyre-/gnagermodeller med validerte spontane posttraumatiske anfall, som begge presenterer med store fokale lesjoner med massivt vevstap i cortex og noen ganger subkortikale strukturer. I motsetning til disse tilnærmingene ble det fastslått at diffus tbi indusert ved hjelp av en modifisert vektdråpemodell er tilstrekkelig til å initiere utvikling av spontane konvulsive og ikke-konvulsive anfall, selv i fravær av fokale lesjoner eller vevstap. I likhet med menneskelige pasienter med ervervet posttraumatisk epilepsi, presenterer denne modellen med en ventetid etter skade før anfall utbruddet. I denne protokollen vil samfunnet bli utstyrt med en ny modell av posttraumatisk epilepsi, som beskriver hvordan man induserer diffus ikke-lesjonelt TBI etterfulgt av kontinuerlig langsiktig video-elektroencefalografisk dyreovervåking i løpet av flere måneder. Denne protokollen vil detalj dyr håndtering, vekt fall prosedyre, elektrode plassering for to oppkjøpssystemer, og hyppige utfordringer oppstått under hvert av trinnene i kirurgi, postoperativ overvåking, og datainnsamling.
Hvert år påvirker TBI anslagsvis 60 millioner mennesker over hele verden. Berørte individer har høyere risiko for å utvikle epilepsi, noe som kan manifestere år etter den første skaden. Selv om alvorlige TBIer er forbundet med en høyere risiko for epilepsi, øker selv mild TBI en persons sjanse til å utvikle epilepsi1,2,3,4. Alle TBO-er kan klassifiseres som fokal, diffuse eller en kombinasjon av begge. Diffus hjerneskade, tilstede i mange om ikke alle TBIer, er et resultat av hjernevev av forskjellige tettheter som skjærer mot hverandre på grunn av akselerasjonsretardasjon og rotasjonskrefter. Per definisjon oppstår diffus skade bare isolert i mild /hjernerystelse, ikke-gjennomtrengende hjerneskade, der ingen hjerneskader er synlige på beregnede tomografiskanninger5.
Det er for tiden to kritiske problemer i behandling av pasienter som har, eller er i fare for, å utvikle posttraumatisk epilepsi (PTE). Den første er at når PTE har manifestert, anfall er resistente mot tilgjengelige antiepileptiske legemidler (AEDs)6. For det andre er AEDer like ineffektive for å forhindre epileptogenese, og det finnes ingen effektive alternative terapeutiske tilnærminger. For å løse dette underskuddet og finne bedre terapeutiske mål og kandidater til behandling, vil det være nødvendig å utforske nye cellulære og molekylære mekanismer ved roten av PTE6.
En av de fremtredende trekk ved posttraumatisk epilepsi er den latente perioden mellom den første traumatiske hendelsen og utbruddet av spontane, uprovoserte, tilbakevendende anfall. Hendelsene som oppstår i dette tidsmessige vinduet er et naturlig fokus for forskere, fordi dette tidsvinduet kan tillate behandling og forebygging av PTE helt. Dyremodeller brukes oftest til denne forskningen fordi de tilbyr flere forskjellige fordeler, ikke minst av dem er at kontinuerlig overvåking av menneskelige pasienter vil være både upraktisk og kostbart over slike potensielt lange tidsspenn. I tillegg kan cellulære og molekylære mekanismer ved roten av epileptogenesis bare utforskes i dyremodeller.
Dyremodeller med spontane posttraumatiske anfall og epilepsi foretrekkes fremfor modeller der anfall induseres etter TBI med mindre fysiologisk relevante midler, for eksempel ved chemoconvulsants eller elektrisk stimulering akutt, kronisk eller ved opptenning. Spontane posttraumatiske anfallsmodeller tester hvordan TBI endrer det sunne hjernenettverket som fører til epileptogenese. Studier som bruker ekstra stimulering etter TBI vurderer hvordan eksponering for TBI reduserer anfallsterskelen og påvirker mottakelighet for anfall. Fordelene med dyremodeller med anfall indusert kjemisk eller med elektrisk stimulering er i testing av de spesifikke mekanismene for refractoriness til AEDer og effekten av eksisterende og nye AEDer. Likevel kan graden av relevans og oversettelse av disse dataene til mennesker væretvetydige 7 på grunn av følgende: 1) anfallsmekanismer kan være forskjellig fra de som induseres av TBI alene; 2) ikke alle disse modellene fører til spontane anfall7; 3) lesjoner skapt av konvulsiv tupp middel selv, med kanylen som kreves for levering, eller ved å stimulere elektrodeplassering i dybdestrukturer (f.eks. hippocampus eller amygdala) kan allerede forårsake økt anfallsfølsomhet og til og med hippocampal epileptiformfeltpotensialer7. Videre produserer noen konvulsive midler (dvs. kainic syre) direkte hippocampal lesjoner og sklerose, som ikke er typisk etter diffus TBI.
Inntil nylig, bare to dyr modeller av posttraumatisk epilepsi eksisterte: kontrollert kortikal innvirkning (CCI, fokal) eller væske perkusjon skade (FPI, fokal og diffus)8. Begge modellene resulterer i store fokale lesjoner sammen med vevstap, blødning og gliose hos gnagere8. Disse modellene etterligner posttraumatisk epilepsi indusert av store fokale lesjoner. En fersk studie viste at gjentatt (3x) diffus TBI er tilstrekkelig for utvikling av spontane anfall og epilepsi hos mus selv i fravær av fokale lesjoner9, og legger til en tredje gnager PTE-modell med bekreftede spontane tilbakevendende anfall. Denne nye modellen etterligner cellulære og molekylære endringer indusert av diffuse TBI, som bedre representerer den menneskelige befolkningen med milde, hjernerystelser. I denne modellen, latent perioden på tre uker eller mer før anfall utbruddet og fremveksten av sent, spontane, tilbakevendende anfall gjør det mulig å undersøke de grunnleggende årsakene til posttraumatisk epileptogenesis, teste effekten av forebyggende tilnærminger og nye terapeutiske kandidater etter anfall utbruddet, og har potensial for utvikling av biomarkører av posttraumatisk epileptogenesis fordi omtrent halvparten av dyrene utvikler posttraumatisk epilepsi.
Valget av dyremodell for studiet av posttraumatisk epilepsi avhenger av det vitenskapelige spørsmålet, typen hjerneskade undersøkt, og hvilke verktøy som skal brukes til å bestemme de underliggende cellulære og molekylære mekanismene. Til syvende og sist må enhver modell av posttraumatisk epilepsi demonstrere både fremveksten av spontane anfall etter TBI og en innledende ventetid i en undergruppe av TBI-dyr, fordi ikke alle pasienter som pådrar seg en TBI, fortsetter å utvikle epilepsi. For å gjøre dette brukes elektroencefalografi (EEG) med samtidig videooppkjøp i denne protokollen. Det er avgjørende å forstå de tekniske aspektene bak datainnsamlingsmaskinvare og tilnærminger for nøyaktig datatolkning. De kritiske maskinvareaspektene inkluderer typen opptakssystem, type elektroder (skrue eller ledningsledning) og materiale de er laget av, synkronisert videoanskaffelse (som en del av EEG-systemet eller tredjeparten), og egenskapene til datasystemet. Det er viktig å sette de riktige oppkjøpsparametrene i alle typer systemer avhengig av studiemål, EEG-hendelser av interesse, videre analysemetode og bærekraft av datalagring. Til slutt må metoden for elektrodekonfigurasjon (montasje) vurderes, da hver har fordeler og ulemper og vil påvirke datatolkningen.
Denne protokollen beskriver hvordan du bruker den modifiserte Marmarou vektfallmodell10,11 for å indusere diffus skade som resulterer i spontan, uprovosert, tilbakevendende anfall hos mus, beskriver kirurgiske tilnærminger for å skaffe seg en enkelt- og flerkanals kontinuerlig, og synkronisert video EEG ved hjelp av monopolar, bipolar eller blandet montasje.
I motsetning til CCI- og FPI-modeller som induserer enten fokus eller kombinasjon av fokal og diffus skade, gjør modellen av repeterende diffus TBI beskrevet i denne protokollen mulighet for induksjon av diffus skade i fravær av fokal hjerneskade og krever ikke hodebunn eller kraniale åpninger og tilhørende betennelse. En ekstra fordel med fraværet av kraniektomy i denne modellen er at det gjør det mulig å ikke bare implantere elektrodene for kronisk kontinuerlig EEG-opptak, men også etableringen av et tynnet kra…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/UNITED States and CURE basert på et stipend CURE mottatt fra United States Army Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), gjennom Psychological Health and Traumatisk Brain Injury Research Program under Award No. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek er høyt verdsatt for korrekturlesing av manuskriptet.
0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
Drill | Foredom | HP4-917 | |
Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
Solder | Harware store | ||
Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
Stainless steel disc | Custom made | ||
Sterile cotton swabs | |||
Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |