Summary
يصف هذا البروتوكول المنهجي نموذجًا جديدًا للصرع ما بعد الصدمة بعد إصابات الدماغ الخفيفة المتكررة. الجزء الأول تفاصيل خطوات لتحريض إصابات الدماغ الرضية باستخدام نموذج انخفاض الوزن المعدلة. ويقدم الجزء الثاني تعليمات بشأن النهج الجراحي لنظم الحصول على البيانات الكهروالدماغة أحادية ومتعددة القنوات.
Abstract
إصابة الدماغ الرضية (TBI) هي السبب الرئيسي للصرع المكتسب. يمكن أن يؤدي TBI إلى إصابة الدماغ البؤري أو المنتشر. الإصابة البؤرية هي نتيجة للقوى الميكانيكية المباشرة ، التي تخترق أحيانًا من خلال الجمجمة ، مما يخلق آفة مباشرة في أنسجة الدماغ. هذه مرئية أثناء تصوير الدماغ كمناطق مع كدمة, تمزق, ونزيف. الآفات البؤرية تحفز موت الخلايا العصبية وتشكيل ندبة الدبقية وهي موجودة في 20%-25% من جميع الأشخاص الذين يعانون من TBI. ومع ذلك ، في معظم حالات TBI ، تحدث الإصابة بسبب قوى التسارع وتسارع الأنسجة اللاحقة ، مما يؤدي إلى تلف غير بؤري ومنتشر. يستمر مرضى TBI في الإصابة بالصرع اللاحق للصدمة (PTE) بعد فترة الكمون من الأشهر أو السنوات. حاليا، فإنه من المستحيل التنبؤ المرضى الذين سوف تتطور PTE، والنوبات في المرضى PTE تشكل تحديا للسيطرة، مما يتطلب المزيد من البحوث. حتى وقت قريب، كان الحقل يقتصر على نموذجين فقط للحيوانات / القوارض مع نوبات ما بعد الصدمة التلقائية التي تم التحقق من صحتها ، وكلاهما يقدم آفات بؤرية كبيرة مع فقدان الأنسجة الهائل في القشرة وفي بعض الأحيان الهياكل تحت القشرية. وعلى النقيض من هذه النهج، تقرر أن الـ TBI المنتشر الناجم عن استخدام نموذج معدل لإسقاط الوزن يكفي للشروع في تطوير نوبات تشنجية عفوية وغير متشنجة، حتى في حالة عدم وجود آفات بؤرية أو فقدان الأنسجة. على غرار المرضى الذين يعانون من الصرع بعد الصدمة المكتسبة، يقدم هذا النموذج مع فترة الكمون بعد الإصابة قبل بداية النوبة. في هذا البروتوكول ، سيتم تزويد المجتمع بنموذج جديد للصرع ما بعد الصدمة ، وتفاصيل كيفية الحث على TBI غير الآفات المنتشر يليه مراقبة مستمرة طويلة الأجل للحيوانات الفيديوية الكهربية على مدار عدة أشهر. هذا البروتوكول سوف تفاصيل التعامل مع الحيوانات، وإجراءات انخفاض الوزن، ووضع القطب الكهربائي لاثنين من أنظمة الاستحواذ، والتحديات المتكررة التي تواجهها خلال كل من خطوات الجراحة، والرصد بعد الجراحة، والحصول على البيانات.
Introduction
كل عام يؤثر TBI ما يقدر بنحو 60 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. الأفراد المتضررون هم أكثر عرضة للإصابة بالصرع، الذي يمكن أن يظهر بعد سنوات من الإصابة الأولية. على الرغم من أن TBIs شديدة ترتبط مع ارتفاع خطر الإصابة بالصرع، حتىTBI خفيفة يزيد من فرصة الفرد لتطوير الصرع1،2،3،4. ويمكن تصنيف جميع مركبات ثلاثي بوتيل القصدير على أنها بؤرية أو منتشرأو مزيج من الاثنين معاً. إصابة الدماغ المنتشرة، الموجودة في العديد من TBIs إن لم يكن جميعها، هي نتيجة لأنسجة الدماغ ذات الكثافات المختلفة التي تقص ضد بعضها البعض بسبب تباطؤ التسارع وقوى الدوران. بحكم التعريف ، تحدث الإصابة المنتشرة فقط في عزلة في إصابة الدماغ الخفيفة / الارتجاج ية غير المخترقة ، حيث لا تظهر آفات الدماغ على التصوير المقطعي المحوسب5.
هناك حاليا مشكلتين حرجتين في إدارة المرضى الذين لديهم، أو هم في خطر، تطوير الصرع ما بعد الصدمة (PTE). الأول هو أنه بمجرد أن يظهر PTE ، فإن النوبات مقاومة للأدوية المضادة للصرع المتاحة (AEDs)6. ثانياً، لا تكون مضادات التغذية الإيبولية غير فعالة بنفس القدر في منع تكوين الصرع، ولا توجد طرق علاجية بديلة فعالة. من أجل معالجة هذا العجز وإيجاد أهداف علاجية أفضل والمرشحين للعلاج ، سيكون من الضروري استكشاف آليات خلوية وجزيئية جديدة في جذر PTE6.
واحدة من السمات البارزة للصرع ما بعد الصدمة هي الفترة الكامنة بين الحدث الصادم الأولي وبداية النوبات التلقائية غير المبررة والمتكررة. الأحداث التي تحدث داخل هذه النافذة الزمنية هي التركيز الطبيعي للباحثين، لأن هذه النافذة الزمنية قد تسمح العلاج والوقاية من PTE تماما. النماذج الحيوانية هي الأكثر شيوعا ً لهذا البحث لأنها توفر العديد من الفوائد المتميزة ، وليس أقلها هو أن الرصد المستمر للمرضى البشريين سيكون غير عملي ومكلف على مدى فترات طويلة من الزمن. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن استكشاف الآليات الخلوية والجزيئية في جذور الصرع إلا في النماذج الحيوانية.
ويفضل نماذج الحيوانات مع نوبات ما بعد الصدمة العفوية والصرع على النماذج التي يتم فيها الحث على المضبوطات بعد TBI بوسائل أقل ملاءمة من الناحية الفسيولوجية، مثل عن طريق الاضطرابات الكيميائية أو التحفيز الكهربائي بشكل حاد، مزمن، أو عن طريق التّوائي. تختبر نماذج النوبات اللاحقة للصدمة التلقائية كيفية تعديل TBI لشبكة الدماغ الصحية مما يؤدي إلى تكوين الصرع. الدراسات التي تستخدم التحفيز الإضافي بعد TBI تقييم كيفية التعرض لTBI يقلل من عتبة المضبوطات ويؤثر على التعرض للمضبوطات. مزايا النماذج الحيوانية مع المضبوطات الناجمة كيميائيا أو مع التحفيز الكهربائي هي في اختبار آليات محددة من الانكسار لAEDs وفعالية AEDs القائمة والرواية. ومع ذلك، فإن درجة أهمية هذه البيانات وترجمتها إلى البشر قد تكون غامضة7 بسبب ما يلي: 1) قد تختلف آليات الضبط عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2) قد تكون آليات الضبط ية مختلفة عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2) قد تكون آليات الضبط ية مختلفة عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2) قد تكون آليات الضبط ية مختلفة عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2) قد تكون آليات الضبط ية مختلفة عن تلك التي يسببها الـ TBI وحده؛ (2 2) ليس كل هذه النماذج تؤدي إلى نوبات عفوية7؛ 3) الآفات التي تم إنشاؤها بواسطة العامل المتشنج نفسه ، مع قنية المطلوبة لتسليمها ، أو عن طريق تحفيز وضع القطب في هياكل العمق (على سبيل المثال ، قرن آمون أو أميغدالا) يمكن أن يسبب بالفعل زيادة الحساسية للمضبوطات وحتى إمكانات حقل فرس النهر 7. وعلاوة على ذلك، بعض العوامل المتشنجة (أي حمض الكاينك) تنتج آفات مباشرة فرس النهر والتصلب، وهو أمر غير نموذجي بعد TBI منتشر.
حتى وقت قريب ، لم يكن هناك سوى نموذجين للحيوانات من الصرع ما بعد الصدمة: التأثير القشري الخاضع للرقابة (CCI ، التنسيق) أو إصابة قرع السوائل (FPI ، البؤري والمنتشر)8. كلا النموذجين يؤدي إلى آفات بؤرية كبيرة جنبا إلى جنب مع فقدان الأنسجة، والنزيف، والدبقي في القوارض8. تحاكي هذه النماذج الصرع ما بعد الصدمة الناجم عن الآفات البؤرية الكبيرة. أظهرت دراسة حديثة أن تكرار (3x) TBI منتشر يكفي لتطوير النوبات العفوية والصرع في الفئران حتى في حالة عدم وجود آفات بؤرية9، إضافة نموذج PTE القوارض الثالث مع المضبوطات المتكررة التلقائية المؤكدة. هذا النموذج الجديد يحاكي التغيرات الخلوية والجزيئية الناجمة عن TBI منتشر, أفضل تمثيل السكان مع السكان خفيفة, TBIs الارتجاج. في هذا النموذج، تسمح الفترة الكامنة التي تمتد لثلاثة أسابيع أو أكثر قبل بداية النوبة وظهور نوبات متكررة عفوية متأخرة بالتحقيق في الأسباب الجذرية لنشوء الصرع بعد الصدمة، واختبار فعالية النهج الوقائية والمرشحين العلاجيين الجدد بعد بداية النوبة، ولديها القدرة على تطوير علامات بيولوجية لنشوء الصرع بعد الصدمة لأن ما يقرب من نصف الحيوانات تتطور الصرع بعد الصدمة.
يعتمد اختيار النموذج الحيواني لدراسة الصرع ما بعد الصدمة على السؤال العلمي، ونوع إصابة الدماغ التي يتم التحقيق فيها، وما هي الأدوات التي سيتم استخدامها لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية. في نهاية المطاف ، يجب أن يظهر أي نموذج للصرع ما بعد الصدمة ظهور نوبات عفوية بعد TBI وفترة زمن وصول أولية في مجموعة فرعية من الحيوانات TBI ، لأنه ليس كل المرضى الذين يتحملون TBI يستمرون في تطوير الصرع. للقيام بذلك، يتم استخدام تخطيط كهربية الدماغ (EEG) مع اكتساب الفيديو في وقت واحد في هذا البروتوكول. إن فهم الجوانب التقنية وراء أجهزة ونهج الحصول على البيانات أمر بالغ الأهمية لتفسير البيانات بدقة. وتشمل الجوانب الهامة للأجهزة نوع نظام التسجيل، ونوع الأقطاب الكهربائية (الرصاص المسمار أو الأسلاك) والمواد التي مصنوعة منها، واكتساب الفيديو المتزامن (كجزء من نظام تخطيط كهربية الدماغ أو طرف ثالث)، وخصائص نظام الكمبيوتر. من الضروري وضع معلمات الاستحواذ المناسبة في أي نوع من النظام اعتمادًا على هدف الدراسة وأحداث تخطيط كهربية الدماغ ذات الأهمية وطريقة التحليل الإضافية واستدامة تخزين البيانات. وأخيراً، يجب النظر في طريقة تكوين القطب (المونتاج) ، لأن لكل منها مزايا وعيوب وستؤثر على تفسير البيانات.
هذا البروتوكول تفاصيل كيفية استخدام تعديل نموذج إسقاط الوزن مارمارو10،11 للحث على إصابة منتشر مما أدى إلى عفوية، غير مبرر، والمضبوطات المتكررة في الفئران، ويصف النهج الجراحية للحصول على واحد ومتعددة القنوات المستمر، والفيديو المتزامن EEG باستخدام monopolar، ثنائي القطب، أو المونتاج المختلط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول وفقًا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لفرجينيا تك ووفقًا لـ "دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" للمعاهد الوطنية للصحة .
1- بروتوكول مناولة الحيوانات
ملاحظة: يهدف هذا البروتوكول إلى التعود على الحيوانات التي يتم طلبها من بائع إلى المرفق بعد الوصول وإلى تكييفها للتعامل معها من قبل المجرب. وهذا يحسن رفاهية الحيوان من خلال الحد من التوتر والقلق ويبسط بعض الإجراءات التي تتطلب التعامل مع الحيوانات، بما في ذلك حث TBI، والرصد بعد الجراحة، وربط الحيوان بنظام الاستحواذ.
- عندما يتم تلقي العديد من الحيوانات من البائع، علامة الأذن وتعيينها عشوائيا إلى مجموعة تجريبية (TBI) أو مجموعة التحكم (جراحة صورية) في حين الجمع بينهما في أقفاص من 2-5 الحيوانات. منزل TBI الحيوانات بشكل منفصل عن الحيوانات الشام لأن الفئران الشام تتصرف أحيانا بقوة تجاه الفئران التي خضعت TBI.
- اليوم الأول (24-48 ساعة بعد وضع علامات الأذن): إعداد مخطط لتسجيل علامات الأذن الحيوانية، وتاريخ الميلاد، وتواريخ المناولة، ووزن الحيوان في أيام المناولة، ومدة المناولة، وقسم للتعليقات والملاحظات.
- كوب بلطف الحيوان باستخدام كلتا يديه. لا الاستيلاء على الحيوان من الذيل لأنه يحفز آليات الدفاع والاستجابة الإجهاد.
- فحص وتسجيل علامة الأذن من الحيوان.
- وضع الحيوان في الحاوية على مقياس الوزن وتسجيل الوزن.
- كوب بلطف الحيوان بكلتا يديه مرة أخرى والتعامل معها لمدة 1 دقيقة، مما يسمح لها بالتحرك واستكشاف داخل اليدين. أداء هذا على مقاعد البدلاء في غرفة الإجراءات والحرص على عدم إسقاط الحيوان على الأرض.
- بعد 1 دقيقة من المناولة، ضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
- كرر الخطوات 1.3−1.7 للحيوانات الأخرى في القفص.
- اليوم الثاني للمعالجة (اليوم التالي): كرر الخطوات 1.2−1.5.
- بلطف كوب الحيوان بكلتا يديه مرة أخرى والتعامل معها لمدة 2 دقيقة، مما يسمح لها بالتحرك واستكشاف داخل اليدين. أداء هذا على مقاعد البدلاء في غرفة الإجراءات والحرص على عدم إسقاط الحيوان على الأرض.
- بعد 2 دقيقة من التعامل مع, وضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
- كرر الخطوات 1.10−1.11 للحيوانات الأخرى في القفص.
- اليوم الثالث للمعالجة (اليوم التالي): كرر الخطوات 1.2−1.5.
- كوب بلطف الحيوان بكلتا يديه مرة أخرى والتعامل معها لمدة 4 دقيقة، مما يسمح لها بالتحرك واستكشاف داخل اليدين. أداء هذا على مقاعد البدلاء في غرفة الإجراءات والحرص على عدم إسقاط الحيوان على الأرض.
- بعد 4 دقيقة من المناولة، ضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
- كرر الخطوات 1.14−1.15 للحيوانات الأخرى في القفص.
- يوم المناولة 4 (يوم التحكم، أسبوع واحد من يوم المناولة 1): كرر الخطوات 1.2−1.5.
- كوب بلطف الحيوان بكلتا يديه مرة أخرى والتعامل معها لمدة 4 دقيقة، مما يسمح لها بالتحرك واستكشاف داخل اليدين. أداء هذا على مقاعد البدلاء في غرفة الإجراءات والحرص على عدم إسقاط الحيوان على الأرض.
- بعد 4 دقيقة التعامل مع, وضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
- كرر الخطوات 1.18-1.19 للحيوانات الأخرى في القفص.
ملاحظة: يوم التحكم معالجة اختبارات الاحتفاظ السلوك الهادئ بعد بروتوكول معالجة ثلاثة أيام.
2. إجراء إسقاط الوزن
- وضع الماوس في غرفة التعريفي. تعيين تدفق الأكسجين والفراغ على حد سواء إلى 1 لتر / دقيقة ومستوى غاز الإيسوفلوران إلى 3٪ - 5٪. تهوّن الفأر ة لمدة 5 دقيقة.
- إزالة الماوس من غرفة التعريفي ووضعه على وسادة رغوة. اختبار لعدم وجود استجابة لإصبع القدم أو الذيل قرصة.
- إعطاء مسكن (0.1 ملغ /كغ البوبرينورفين) تحت الجلد. إذا تم إجراء جراحة تخطيط كهربية الدماغ في نفس اليوم، قم بإدارة البوبرينورفين تحت الجلد بالاقتران مع كاربروفين غير الستيرويدي المضاد للالتهابات (5 ملغ/كغ).
- إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد قبل أو بعد الارتطام الأخير. يمكن خلط محلول لاكتات الصوديوم مع المسكنات للإدارة السريعة في حقنة واحدة.
ملاحظة: يحتوي محلول لاكتات الصوديوم على خليط من كلوريد الصوديوم وكلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم ولاكتات الصوديوم في الماء. تساعد هذه الخطوة على استبدال السوائل والكهارل، مما يساعد على الشفاء. - ضع رأس الماوس تحت أنبوب إسقاط الوزن(الشكل 1A)ووضع قرص مسطح من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطره 1.3 سم ، سمكه 1 مم ، ووزن 880 ملغ) في وسط الرأس ، بين خط العينين والأذنين.
ملاحظة: ينشر هذا القرص التأثير عبر سطح الجمجمة(الشكل 1B). - قم بإزالة الدبوس في أنبوب إسقاط الوزن لإطلاق قضيب الوزن 100 جم من ارتفاع 50 سم. للحث على إصابة صورية للفئران التحكم، وإزالة قضيب الوزن من أنبوب لمنع الإفراج العرضي من دبوس وانخفاض الوزن.
ملاحظة: يجب وضع رأس الحيوان مسطحًا ، بحيث يسقط القضيب مجانًا على سطح القرص بأكمله. - ضع الحيوان الفاقد الوعي على ظهره للتعافي على وسادة تدفئة مغطاة بمنشفة معقمة ماصة مبطنة. يمكن قياس وقت الاسترداد المنعكس الصحيح (أي الوقت الذي يستغرقه الماوس لتصحيح نفسه من ظهره) كقراءة للوقت الذي يقضيه فاقدالوعي.
- عندما يستعيد الحيوان وعيه ، ضعها في قفص نظيف تم تسخينه على وسادة التدفئة ، مع هلام الاسترداد وعدد قليل من قطع الطعام المبللة لاسترداد لمدة 45 دقيقة. ارتفاع درجة حرارة الحيوان يمكن أن يثبت عقبة كبيرة أمام الانتعاش كما السماح للفأر لتصبح باردة جدا.
- بعد 45 دقيقة، كرر الخطوات 2.1-2.8 مرتين، وحذف الخطوة 2.3 (أي إعطاء المسكنات والأدوية المضادة للالتهابات).
- السماح للحيوانات بالتعافي لمدة 1-2 ساعة إذا تم إجراء جراحة زرع قطب EEG في نفس اليوم.
3. إعداد المجال الجراحي لزرع أقطاب تخطيط كهربية الدماغ
ملاحظة: الأوتوكلاف الأدوات الجراحية والبراغي قبل الجراحة. تنظيف القفازات الجراحية عن طريق الرش وفرك مع الإيثانول 70٪ قبل وبعد لمس الحيوان، والمواد غير المعقمة، وبين التعامل مع الحيوانات. قم بتعقيم الأدوات الجراحية لمدة 2-3 دقيقة في معقم المنبّه (انظر جدول المواد)بين الحيوانات. تغيير الستائر العقيمة قبل وضع الحيوان الجديد في جهاز stereotactic. تأكد من أن المجال الجراحي يحتوي على جميع المكونات اللازمة للجراحة(الشكل 2). عدم وجود إجراء جراحي الغازية للحث على TBI في هذا النموذج له عدة مزايا: 1) زرع الأقطاب الكهربائية مرنة ويمكن القيام به في نفس اليوم TBI أو بعد فترة زمنية محددة; 2) وقت استعادة الحيوان أسرع؛ 3) الجمجمة لا تزال سليمة، مما يسمح بمزيد من مساحة السطح والمرونة لزرع الأقطاب الكهربائية.
- قم بتنويم الفأر في غاز الإيزوفران بنسبة 3% -5% في غرفة تعريفلمدة 5 دقيقة.
- نقل الماوس من غرفة التعريفي إلى جهاز stereotactic ووضعه على الستائر المعقمة على وسادة التدفئة مع غاز الايسوفوران وأنابيب فراغ متصلة مخروط الأنف.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية على مدار الجراحة. ضع مستشعر درجة الحرارة بحيث يتلامس مع جدار الصدر أو البطن للفأرة.
- إصلاح رأس الحيوان في مكان باستخدام قضبان الأذن.
- الحفاظ على التخدير عند 1.5٪ - 3.5٪ isoflurane أو في ~ 60 التنفس / دقيقة في الطائرة الجراحية (مع عدم الاستجابة لإصبع القدم أو قرصة الذيل).
- تطبيق مرهم العين على عيون الحيوان للحفاظ على مشحم طوال الجراحة.
- إعطاء خليط من المسكنات (0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين) والمخدرات المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (5 ملغ / كغ carprofen) في حقنة واحدة تحت الجلد إلا إذا تم تنفيذ TBI في وقت سابق من اليوم ، وفي هذه الحالة تلقى الحيوان بالفعل المسكنات ومضادات الالتهاب.
ملاحظة: يجب أن تدار البوبرينورفين مرة أخرى إذا كان الوقت بين أول TBI وEEG جراحة وضع يتجاوز 8 ساعة أو إذا كان الحيوان يظهر علامات الألم 8 ساعة بعد الإدارة الأولى, ولكن ينبغي أن تعطى دون إضافة carprofen. - إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد لتحل محل السوائل والكهارل في الحيوان.
ملاحظة: إذا تم إجراء عملية جراحية مباشرة بعد TBI، يجب أن يتم توقيت هذه الخطوة بشكل صحيح. يجب أن تدار محلول لاكتات الصوديوم كل 2 ساعة في حين يخضع الحيوان للإجراءات ومرة واحدة بعد الجراحة، 2 ساعة من الحقن السابق. - إزالة الشعر من فروة الرأس باستخدام كريم إزالة الشعر.
- قبل إجراء الشق ، قم بتطهير جلد فروة الرأس بمحلول مطهر جراحي من povidone-iodine والإيثانول بنسبة 70٪ في مسحات متناوبة مع منصات شاش معقمة في حركة دائرية 3x (20 s لكل محلول في كل مرة).
- باستخدام مشرط، وجعل شق rostral caudal على خط وسط فروة الرأس من فوق العينين إلى الجزء الخلفي من الرأس. يفضل هذا الأسلوب من فتح فروة الرأس على قطع فروة الرأس، كما يمكن أن تكون مختومة اللوحات الجلد أكثر أو حول غطاء تخطيط كهربية الدماغ توفير المزيد من الاستقرار.
ملاحظة: عند إعداد الجمجمة لزرع الرأس 3-EEG، مطلوب قطع فروة الرأس، كما أن حجم الرأس لن تسمح لإغلاق اللوحات الجلد على الرأس. - توسيع منطقة شق عن طريق تطبيق hemostats صغيرة على حدود الجلد فتح. إذا حدث أي نزيف بعد الشق، قم بتنظيفه بشاش قطني معقم أو مسحة.
- إزالة بلطف periosteum (أي الغشاء الرقيق على العظام القحفية) مع شفرة مشرط. إذا حدث أي نزيف خلال هذه الخطوة، اضغط على موقع النزيف مع مسحة قطنية معقمة حتى يتوقف.
- استخدم مسحات قطنية معقمة لتنظيف الجمجمة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين، ولكن تجنب لمس الأنسجة الرخوة المحيطة بالمنطقة القحفية المكشوفة. كرر هذه الخطوة حتى يتم تنظيف الجمجمة من أي أنسجة لينة ولها مظهر أبيض.
- جفف الجمجمة بشاش معقم أو مسحة قطنية.
ملاحظة: الخطوات 3.12−3.15 مهمة للتثبيت السليم للأقطاب الكهربائية وأسمنت الأسنان. يمكن لأي نسيج لين، ونزيف غير مكين، وحطام أن يسبب العدوى، والتثبيت غير المستقر لجبل الرأس، والإشارة المشوهة أو الغائبة، وفقدان الغرسة في غضون عدة أيام أو أسابيع بعد الجراحة.
4. وضع القطب الكهربائي
- زرع EEG واحد (1EEG) قناة headmount.
ملاحظة: تمثل الاختصارات في إحداثيات التجسم العلاقات المكانية وتحدد المسافة بالملليمترات من الهدف من البريجما في اتجاه معين على رأس الحيوان: الأمامي الخلفي (AP) والمتوسطة الجانبية (ML). لا ينطبق Dorsal-البطني في هذا البروتوكول لأن جميع الأقطاب الكهربائية توضع في الفضاء فوق الجافية بدلاً من بنية معينة داخل الدماغ (الشكل 3). فين + هو قطب كهربائي نشط وفين - هو القطب المرجعي لها.- استخدم مثقابعالي السرعة مع بت فولاذي (0.5 مم، مستدير، 1/4 في.) عند حوالي 5000-6000 جولة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لإنشاء ستة ثقوب بور (ثلاثة لمسامير الاستقرار وثلاثة للأقطاب الكهربائية) باستخدام إحداثيات stereotactic المقدمة12. للمسمارين الأماميين: AP = +1.5 مم، ML = ± 1.5 مم؛ للمسمار الخلفي واحد: AP = -5.2 مم، ML = -1.5 مم؛ للقطب الأرضي: AP = -5.2 مم، ML = +1.5 مم؛ لتسجيل الأقطاب: AP = -2.3 مم، ML = ± 2.7 مم، مع Vin+ إلى اليمين وفين- إلى اليسار.
- إضافة ثلاثة مسامير لتعزيز الاستقرار في مرحلة الرأس. باستخدام مفك البراغي، بدوره مسامير 1-1.5 x كل لتكون ثابتة ثابت في الجمجمة.
ملاحظة: وضع مسامير أعمق سوف تلحق الضرر في الدماغ. - أدخل حامل الرأس 1EEG في ذراع حامل مجسم ووضع الرأس بحيث تقع الأقطاب الثلاثة على طول خط الوسط القحفي. في هذا التكوين القطب الأرض وفتحة كل منها على رأس الرأس هو في الجزء الخلفي، والقطب Vin + في الوسط، والقطب فين في الجبهة. ويمكن إجراء علامة على الرأس مع علامة دائمة.
- ثني كل قطب كهربائي 90 درجة بحيث يتم ثني نهاية كل سلك إلى أسفل ويتم وضعها فوق ثقب البور المقابلة. ثم، قياس من 1 مم طول جزء من السلك الذي هو الآن عمودي على ثقب بور وتقليم الزائدة قبالة(الشكل 3). وهذا يضمن وضع فوق الجافية من الأقطاب الكهربائية. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية بالكاد تلمس سطح ماتر الدورة.
- خفض headmount وضبط جميع الأقطاب الثلاثة لتتناسب مع ثقب بور المعنية. للتسجيل فوق الجافية ، يجب وضع الأقطاب الكهربائية فوق أو بالكاد تلامس ماطر الجافية.
- إعداد الاسمنت الأسنان للتطبيق عن طريق خلط 1/2 مغرفة من مسحوق مع عدة قطرات من المذيبات. استخدام ملعقة خلط ويحرك حتى الخليط النهائي هو المعجون مثل، مبتذل ولكن مرن، وقاسية بما يكفي لتكثيف بشكل صحيح عند وضعها على الجمجمة الحيوان.
- تطبيق خليط الاسمنت الأسنان التي تغطي جميع مسامير والأقطاب الكهربائية والانتظار ~ 3-5 دقيقة لترسيخ ذلك. تأكد من عدم تغطية الرسال البلاستيكي بالأسمنت السني، لأنه سيجعل من المستحيل توصيل الحيوان بالجهاز الزائب بحبل.
- الافراج عن hemostats عقد اللوحات الجلد وإغلاق شق عن طريق ربط اللوحات الجلد حول الرماج البلاستيكية. تطبيق عدة قطرات من الأنسجة لاصقة (انظر جدول المواد)لختم اللوحات الجلد.
- تطبيق مطهر الكلورهيكسيدين إلى المنطقة المحيطة بالزرع لتجنب العدوى. إذا كان الحيوان تحت التخدير لمدة أطول من 2 ساعة بعد الحقن السابق من محلول لاكتات الصوديوم ، الذي يعطى أثناء تحريض TBI ، فأعد حقنة أخرى تحت الجلد. للحفاظ على الترطيب السليم للمستشفى، كرر الحقن كل 2 ساعة التي ينفقها الحيوان تحت التخدير.
- بعد الجراحة، وإعطاء الحقن النهائي من محلول لاكتات الصوديوم 2 ساعة بعد الحقن السابقة. إذا كانت الجراحة أقل من 2 ساعة طويلة, إدارة جرعة الانتعاش النهائي من محلول لاكتات الصوديوم 2 ساعة من الحقنة الأولى.
- إزالة الحيوان من جهاز stereotactic وقياس وزن الحيوان بعد جراحة تخطيط كهربية الدماغ كمرجع للرصد في المستقبل. بسبب الزرع ، سيكون وزن الحيوان أكبر مما كان عليه قبل الجراحة.
- وضع الحيوان في قفص نظيف على وسادة تدفئة دافئة للتعافي.
- زرع اثنين من EEG وواحد EMG (2EEG/1EMG) قنوات الرأس.
- استخدام bregma كمعلم لوضع headmount. تطبيق كمية صغيرة من الأنسجة لاصقة (انظر جدول المواد)إلى الجانب السفلي من الرأس 2EEG/1EMG، وتجنب ثقوب المسمار الأربعة ووضع 2EEG/1EMG headmount على سطح الجمجمة.
ملاحظة: لا توجد إحداثيات محددة لوضع هذا الرأس. يبلغ طول الرأس 8 مم وعرضه 5 مم، والذي يغطي معظم سطح الجمجمة. وضع headmount مع حافة أمامية له 3.0 مم الأمامي إلى bregma هو الأمثل ويوفر نوعية إشارة جيدة. وضع يدوي سريع ضروري قبل قطرة من العلاجات اللاصقة الأنسجة. السماح ما يقرب من 5 دقيقة للأنسجة الغراء لعلاج تماما. - استخدام إبرة 23 G معقمة لخلق ثقوب التجريبية للمسامير من خلال الفتحات الأربعة في headmount. لتحقيق ذلك، دفع بلطف الإبرة وتدوير ببطء حتى طرف الإبرة تخترق الجمجمة دون الإضرار الدماغ. إزالة أي نزيف من الثقوب التجريبية باستخدام مسحة القطن المعقمة.
- إدراج 0.10 في مسامير في الثقوب التجريبية وتدويرها حتى يتم إصلاح كل في الجمجمة. هذا يمكن أن يصل إلى نصف طول المسمار، ولكن ليس طول كامل، لأن هذا من شأنه أن يضر ماتر دورا والقشرة. إذا تم وضع headmount بحيث يكون هناك فجوة بين سطح الجمجمة والطرف الخلفي من headmount استخدام اثنين 0.12 في مسامير في الجزء الخلفي.
- جعل فتحة صغيرة على جانبي الايبوكسي المكون من اثنين (الفضة الايبوكسي) الحقيبة التوأم حزمة. تأخذ ملعقة على الوجهين واستخدام كل جانب لغرف كمية صغيرة ومتساوية من كل مكون من الحقيبة ومزجها معا. استخدام كمية صغيرة فقط كافية لعملية جراحية واحدة، لأن الخليط يقوي في غضون 20 دقيقة. ختم الجانبين من الحقيبة لمنع التجفيف.
ملاحظة: الفضة-الايبوكسي يسمح للاتصال الكهربائية السليم بين المسمار والرأس ويعزز استقرار مسامير. - تطبيق كمية صغيرة من هذا الخليط بين ثقب المسمار والمسمار، ثم تشديد كل المسمار حتى تقع رأسه على قاعدة الزرع. تأكد من عدم وجود الفضة الايبوكسي هو إجراء اتصال بين مسامير اثنين لأن كل المسمار بمثابة قطب كهربائي الفردية، وضمان إشارة دقيقة، فإنه لا ينبغي إجراء اتصال مع المسمار الآخر.
- إذا كان خليط الفضة والايبوكسي في غير محله، وهناك عدد قليل من نافذة الوقت الثاني لمغرفة بعناية من الزائدة لفصل الاتصال. ينحني بعناية كل من EMG يؤدي من الحافة الخلفية لحامل الرأس لمتابعة كفاف رأس الحيوان ورقبته، ومن ثم إدراجها في العضلات nuchal.
- إعداد الاسمنت الأسنان للتطبيق عن طريق خلط 1/2 مغرفة من مسحوق مع عدة قطرات من المذيبات. استخدام ملعقة خلط ويحرك حتى الخليط النهائي هو المعجون مثل، مبتذل ولكن مرن، وقاسية بما يكفي لتكثيف بشكل صحيح عند وضعها على الجمجمة الحيوان.
- تطبيق خليط الاسمنت الأسنان التي تغطي headmount كامل مع تجنب تغطية الثقوب دبوس ستة، لأن هذا سيجعل من المستحيل لربط ما قبل مكبر للصوت. انتظر ~ 3-5 دقيقة لترسيخ الاسمنت. تأكد من أن الجلد غير مختومة إلى الرأس مع الاسمنت الأسنان.
- الافراج عن hemostats عقد اللوحات الجلد وإغلاق شق عن طريق ربط اللوحات الجلد حول الرماج البلاستيكية. تطبيق عدة قطرات من الأنسجة لاصقة لختم اللوحات الجلد.
ملاحظة: إذا تم إجراء شق الجلد لفترة أطول للسماح لتقويم يؤدي سلك EMG، يمكن ختم الجلد مع الأنسجة لاصقة أو خياطة. ختم الجلد مع الأنسجة لاصقة عادة ما تكون كافية. ومع ذلك ، إذا لوحظ أثناء فتح مراقبة ما بعد الجراحة للشق ، يوصى بالغرز بدلاً من ذلك. - تطبيق مطهر الكلورهيكسيدين إلى المنطقة المحيطة بالزرع لتجنب العدوى. إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد لتحل محل السوائل والكهارل إذا كان الحيوان تحت التخدير لمدة أطول من 2 ساعة بعد الحقن السابق.
- إزالة الحيوان من جهاز stereotactic وقياس وزن الحيوان بعد جراحة تخطيط كهربية الدماغ كمرجع للرصد في المستقبل. بسبب الزرع ، سيكون وزن الحيوان أكبر مما كان عليه قبل الجراحة.
- وضع الحيوان في قفص نظيف على وسادة التدفئة الدافئة، مع هلام الانتعاش وعدد قليل من قطع تشاو مبللة للانتعاش.
- استخدام bregma كمعلم لوضع headmount. تطبيق كمية صغيرة من الأنسجة لاصقة (انظر جدول المواد)إلى الجانب السفلي من الرأس 2EEG/1EMG، وتجنب ثقوب المسمار الأربعة ووضع 2EEG/1EMG headmount على سطح الجمجمة.
- زرع ثلاث قنوات EEG (3EEG) headmount.
- استخدم الحفر عالي السرعة مع بت فولاذي (0.5 مم، مستدير، 1/4) عند 5000-6000 دورة في الدقيقة تقريبًا لإنشاء ستة ثقوب بور (ثلاثة لمسامير الثبات وثلاثة للأقطاب الكهربائية) باستخدام إحداثيات المجسمة المقدمة12. بالنسبة للمرجع الأرضي والمشترك لـ EEG1 و EEG2: AP = 5.2 مم، ML = ± 1.5 مم؛ لEEG1 وEEG2: AP = -3.0 مم، ML = ± 3.0 مم؛ لEEG3 المستقلة: AP =-1.4 مم، ML = ± 1.5 مم.
- ضع الأقطاب المسمارية الستة في ثقوب البور.
ملاحظة: وضع مسامير أعمق سيخلق ضررا كبيرا للدماغ. توفر أقطاب المسمار استقرارًا أفضل لحامل الرأس. - إعداد الاسمنت الأسنان للتطبيق عن طريق خلط 1/2 مغرفة من مسحوق مع عدة قطرات من المذيبات. استخدام ملعقة خلط ويحرك حتى الخليط النهائي هو المعجون مثل، مبتذل ولكن مرن، وقاسية بما يكفي لتكثيف بشكل صحيح عند وضعها على الجمجمة الحيوان.
- تطبيق خليط الاسمنت الأسنان التي تغطي كامل السطح المكشوف من الجمجمة وكل القطب المسمار. تأكد من أن الجلد غير مختومة إلى الرأس مع الاسمنت الأسنان. انتظر ~ 1-2 دقيقة للأسمنت لترسيخ أقل ما يقال. ليست هناك حاجة للانتظار حتى التصلب الكامل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- بدوره على لحام الحديد لتسخينه. ضع حامل الرأس 3EEG في ذراع حامل مجسم.
ملاحظة: ضع حامل الرأس بحيث تتطابق مواضع الرصاص السلكية الستة مع موضع خيوط الأسلاك لكل قطب كهربائي. - خفض headmount بحيث يقع الجزء البطني على رأس الاسمنت الأسنان.
- تحريف السلك من كل الرصاص من كل من أقطاب المسمار مع الرصاص الأسلاك المقابلة من headmount.
ملاحظة: سيؤدي التواء الأسلاك الخاطئة إلى جعل تفسير البيانات معقدًا أو مستحيلًا. - تقليم بعناية السلك الزائد قبالة باستخدام مقص. لحام كل زوج الملتوية من الأسلاك لالتوصيل إشارة السليم.
ملاحظة: يجب أن كل زوج من الأسلاك إجراء اتصال مع زوج آخر، وإلا سيتم اختراق جودة الإشارة وتفسير البيانات. - ثني كل زوج ملحوم من الأسلاك يؤدي حول headmount، وتجنب الاتصال بين كل زوج.
ملاحظة: إذا لم يتم قطع الأسلاك يؤدي قصيرة بما فيه الكفاية يمكن أن يكون من الصعب ثني لهم حول headmount دون لمس سلك آخر. في هذه الحالة، ثني زوج واحد أولاً، وتغطية ذلك مع خليط الاسمنت الأسنان، والانتظار ~ 1-2 دقيقة لترسيخ، ثم المضي قدما مع الزوج التالي في نفس الطريقة. - الانتهاء من تغطية جميع الأسلاك مع الاسمنت الأسنان ترك فقط الجزء الأسود من headmount يتعرض.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم تطبيق أي مسحوق أسمنت الأسنان أو خليط إلى الجزء العلوي من الجزء المكشوف من headmount كما أي حطام أو الأسمنت في الثقوب سوف تمنع الاتصال وسوف يؤدي إما إلى غياب إشارة أو الضوضاء. - الافراج عن hemostats عقد اللوحات الجلد. تطبيق مطهر الكلورهيكسيدين إلى المنطقة المحيطة بالزرع لتجنب العدوى.
- إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد لاستبدال السوائل والكهارل إذا كان الحيوان تحت التخدير لمدة أطول من 2 ساعة بعد الحقن السابق.
- إزالة الحيوان من جهاز stereotactic وقياس وزن الحيوان بعد جراحة تخطيط كهربية الدماغ كمرجع للرصد في المستقبل. بسبب الزرع ، سيكون وزن الحيوان أكبر مما كان عليه قبل الجراحة.
- وضع الحيوان في قفص نظيف على وسادة التدفئة الدافئة، مع هلام الانتعاش وعدد قليل من قطع تشاو مبللة للانتعاش.
ملاحظة: يساعد بيروكسيد الهيدروجين في إزالة أي أنسجة لينة متبقية من الجمجمة.
5. ربط الحيوانات بنظام الاستحواذ
- كأس الحيوان بكلتا يديه لإزالته من قفص الاستحواذ ونقله إلى منطقة نظيفة مع سطح مستو، مثل محطة نقل الحيوانات (ATS).
- الاستيلاء بلطف الماوس من الجلد من ظهرها. لا تمسك الحيوان من الذيل ، لأن هذا يسبب الضيق.
- تحديد الفتحة في headmount EEG المقابلة للقطب الأرضي وتطابق دبوس كل من الحبل للاتصال السليم.
ملاحظة: سيؤدي الاتصال العكسي للحبل من المنازج إلى حامل الرأس الحيواني إلى قراءة مختلفة عن الأقطاب الكهربائية والأشكال الموجية المشوهة المحتملة. - أعد الحيوان إلى قفص الاستحواذ وقم بتوصيل الطرف الآخر من الحبل (نظام EEG 1) أو مكبر الصوت المسبق (نظام EEG 2) بالتنقل.
ملاحظة: عند توصيل مكبر الصوت قبل (نظام تخطيط كهربية الدماغ 2) إلى الحبل من التنقل، تطابق العلامات البيضاء على طرفي كلا الحبال. الاتصال العكسي سيؤدي إلى ضرر دائم للمكبر ويتطلب إصلاحات من قبل الشركة المصنعة ، والتي هي مكلفة. - تدوير بلطف الحبل الذي يربط الحيوان إلى التنقل لضمان آلية يعمل بشكل صحيح والحيوان يمكن أن تتحرك بحرية.
6. إعدادات الحصول على بيانات EEG
- تعيين معلمات الاستحواذ على نظام EEG 1.
- تعيين معدل أخذ العينات إلى 500 هرتز؛ كسب 5000؛ وضع القاعدة 35 هرتز؛ LPN قبالة. تعيين مرشح تمرير عالية إلى 0.5 هرتز.
ملاحظة: 100 هرتز (تمرير منخفض) مضمنة ولا تتطلب إدخال يدوي.
- تعيين معدل أخذ العينات إلى 500 هرتز؛ كسب 5000؛ وضع القاعدة 35 هرتز؛ LPN قبالة. تعيين مرشح تمرير عالية إلى 0.5 هرتز.
- تعيين معلمات الاستحواذ على نظام EEG 2.
- تعيين معدل أخذ العينات إلى 600 هرتز؛ preamp كسب 100؛ كسب 1 (EEG1, 2). تعيين مرشح تمرير منخفض إلى 100 هرتز.
ملاحظة: 1 هرتز (تمرير ة عالية) مضمنة ولا تتطلب إدخال يدوي.
- تعيين معدل أخذ العينات إلى 600 هرتز؛ preamp كسب 100؛ كسب 1 (EEG1, 2). تعيين مرشح تمرير منخفض إلى 100 هرتز.
7. إعدادات الحصول على بيانات الفيديو
- تعيين معلمات الاستحواذ لنظام EEG 1.
ملاحظة: هناك حاجة إلى نظام اقتناء الفيديو طرف ثالث للحصول على بيانات الفيديو في وقت واحد.- حدد معدل الإطار بين 15 (الحد الأدنى الموصى به) و30 (الحد الأقصى المتاح) لجودة الفيديو المناسبة. تعيين الدقة إلى 640 × 640 بكسل. تعيين نوع الضغط إلى H.264H.
- تعيين معلمات الاستحواذ لنظام EEG 2.
ملاحظة: يوفر نظام EEG هذا نظام فيديو وبرنامجًا يتزامن انفًا بيانات الفيديو وEEG معًا في ملف واحد لمدة تصل إلى أربعة أنواع من الحيوانات (انظر جدول المواد).- حدد معدل الإطار بين 15 (الحد الأدنى الموصى به) و30 (الحد الأقصى المتاح) لجودة الفيديو المناسبة. تعيين الدقة إلى 640 × 480 بكسل. تعيين نوع الضغط إلى تنسيق ملف WebM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف البروتوكول المبين هنا طريقة تحريض الإصابة المنتشرة في العزل (على سبيل المثال ، في حالة عدم وجود آفة بؤرية) باستخدام نموذج الماوس من TBI المنتشر المتكرر(الشكل 1). يصور الشكل 1A جهاز إسقاط الوزن ومكوناته(الشكل 1A, a1−a5)المستخدم لتحريض TBI في هذا النموذج والخطوات الحاسمة أثناء الإجراء(الشكل 1B, b1−b5).
وتشمل خصائص هذا النموذج عدم وجود آفة بؤرية في الدماغ نتيجة لTBI، وفقدان الوعي، وارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة، وظهور بداية المضبوطات في وقت متأخر (> 1 أسبوع من TBI)، وعفوية، غير مبرر، والمضبوطات المتكررة في مجموعة فرعية من TBI الفئران بعد فترة الكمون من ثلاثة أسابيع على الأقل بعد TBI.
يوضح هذا البروتوكول الإجراءات التفصيلية لإنشاء حقل جراحي نظيف(الشكل 2)، ويوفر نهجًا خطوة بخطوة لزرع صفائف أقطاب كهربائية مختلفة(الشكل 3)، ويتضمن دليلًا مفصلًا حول استخدام نظامين مختلفين لاقتناء EEG (انظر جدول المواد)للكشف عن المضبوطات(الشكل 4 والشكل 5)في هذا النموذج. تشير القدرة الطيفية للمضبوطات النموذجية إلى أعلى كثافة في نطاق التردد من 10 إلى 40 هرتز مع ذروة عند 15 هرتز(الشكل 4). وغالبية المضبوطات في الفئران متشنجة، بمتوسط مدة 12-15 ق. فقط جزء صغير من المضبوطات غير متشنج. يتم إجراء مقارنة شاملة لمزايا وعيوب استخدام أي من النظامين في قسم المناقشة. وعلاوة على ذلك، يوضح هذا البروتوكول الجداول الزمنية لبداية الضبط ية في الحيوانات بعد انخفاض الوزن المتكرر TBI، مما يدل على تجمع المضبوطات في بعض الحيوانات(الشكل 6)الذي يؤكد على أهمية الحصول على تسجيلات مستمرة بدلاً من المتقطعة، لأن هذا سيضمن تقسيمًا دقيقًا للحيوانات التي تتطور إلى نوبات تلقائية بعد TBI من تلك التي لا تحدث. الأهم من ذلك ، يناقش هذا البروتوكول أيضًا مزايا وعيوب نماذج القوارض من PTE وقدرتها على تمثيل مجموعة محددة من البشر بعد TBI.
الشكل 1: نموذج الماوس من TBI المنتشرة المتكررة. (أ)وزن إسقاط الجهاز. (a1) أنبوب إسقاط الوزن. (a2) قضيب وزن 100 غرام. (a3) دبوس عقد قضيب. (a4) سلسلة لرفع قضيب حتى إذا تغيير الارتفاع أو إزالة قضيب من أنبوب قطرة الوزن. (أ5). رغوة وسادة لوضع الحيوان تحت أنبوب قطرة الوزن. (ب)إجراء إسقاط الوزن. (ب1) يتم وضع القرص الفولاذ المقاوم للصدأ في وسط الرأس بين خط العينين والأذنين. (b2 و b3) بعد تأكيد مرئي أن رأس الحيوان في وضع مسطح ويتم نقل وسادة الرغوة ، ووضع رأس الحيوان تحت أنبوب قطرة الوزن. (b4) الافراج عن دبوس عقد قضيب الوزن، لتصل إلى مركز القرص الفولاذ المقاوم للصدأ. (ب5) يتم وضع الماوس على منشفة معقمة مباشرة بعد تقييم التأثير وفقدان الوعي من خلال قياس الوقت الذي يستغرقه الحيوان للتعافي والحق في حد ذاته. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإعداد الميداني الجراحي ومخطط وضع أقطاب EEG. يتم إعداد الأدوات الأوتوكلاف والمواد اللازمة للجراحة وزرع القطب الكهربائي قبل تأليه الحيوان لضمان توافر جميع الأجزاء المطلوبة. هذه منطقة معقمة ولا بد من عدم تلويث هذه المنطقة بمواد غير معقمة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المعالم المجسمة والتمثيل التخطيطي لوضع القطب الكهربائي باستخدام نظام EEG 1 و 2. اللوحة العليا يصور أساليب زرع ثلاثة headmounts مختلفة وصفها في هذا البروتوكول. (أ)قناة EEG واحدة، المونتاج ثنائي القطب. (ب)قناتين EEG مع إشارة مشتركة، المونتاج ثنائي القطب وقناة EMG واحدة. (C)ثلاث قنوات تخطيط كهربية الدماغ، باستخدام احتكار (القناة 1-2) وثنائي القطب (القناة 3) المونتاج. اللوحة السفلية يصور headmounts والبراغي المزروعة كما هو الحال في اللوحة العليا. الأنواع الثلاثة من مسامير المستخدمة في هذا البروتوكول لغرضين: كما مسامير الاستقرار (نظام EEG 1) أو كل من الاستقرار والقطب (نظام تخطيط كهربية الدماغ 2). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الضبط التلقائي المكتسب باستخدام نظام تخطيط كهربية الدماغ 1. اللوحة العليا يصور نوبة عفوية في الماوس بعد 23 يوما من انخفاض الوزن المتكرر TBI باستخدام البيانات المكتسبة باستخدام 1EEG headmount. (أ)نشاط ما قبل التوقت (ما قبل الضبط). (ب)نشاط (ضبط) تكنولوجيا المعلومات والاتصالات. (ج)اكتئاب ما بعد التّوالى (ما بعد الضبط). اللوحة السفلية: يتم حساب كثافة طيف الطاقة باستخدام برنامج نصي وبرامج مخصصة (انظر جدول المواد). تعني القوة = متوسط قوة طيف الطاقة داخلالعصر (الوحدات: V 2/Hz). متوسط التردد = التردد الذي يتم فيه الوصول إلى 50٪ من إجمالي الطاقة داخل العصر (الوحدات: Hz). متوسط التردد = التردد الذي يتم فيه الوصول إلى متوسط القوة داخل العصر (الوحدات: Hz). الحافة الطيفية = التردد الذي يتم الوصول إليه تحته نسبة مئوية محددة من المستخدم من إجمالي الطاقة داخل العصر (الوحدات: Hz). تردد الذروة = التردد الذي يحدث فيه أقصى قدر من الطاقة خلال العصر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: المضبوطات التلقائية المكتسبة باستخدام نظام تخطيط كهربية الدماغ 2. (أ)عفوية غير متشنجة (الكهربية) الاستيلاء في الماوس بعد 65 يوما من انخفاض الوزن المتكرر TBI. البيانات المكتسبة باستخدام 2EEG/1EMG headmount. (ب)النوبة التشنجية التلقائية في الماوس بعد 97 يوما من انخفاض الوزن TBI. البيانات المكتسبة باستخدام حامل الرأس 3EEG. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الجدول الزمني لحدوث المضبوطات في الفئران بعد انخفاض الوزن المتكرر TBI. وقد لوحظت النوبة الأولى بعد ثلاثة أسابيع من الإصابة. بعض الحيوانات تطوير مجموعات من المضبوطات في نفس اليوم تليها عدة أسابيع دون المضبوطات. تم تسجيل الحيوانات حتى أربعة أشهر بعد TBI. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وعلى النقيض من نماذج CCI وFPI التي تحفز إما البؤري أو الجمع بين الإصابة البؤرية والمنتشرة ، فإن نموذج TBI المنتشر المتكرر الموصوف في هذا البروتوكول يسمح بتحريض الإصابة المنتشرة في غياب إصابة الدماغ البؤرية ولا يتطلب فتحات فروة الرأس أو الجمجمة والالتهاب المرتبط بها. فائدة إضافية من عدم وجود جحف في هذا النموذج هو أنه يسمح ليس فقط لزرع الأقطاب الكهربائية لتسجيل EEG المستمر المزمن، ولكن أيضا إنشاء نافذة الجمجمة القحفية رقيقة لالمزمن في vivo 2-فوتون تصوير الحيوانات قبل، مباشرة بعد، ومرارا وتكرارا لأيام وأسابيع، وحتى أشهر بعد TBI كما هو موضح في شاندرا وروبيل 201913.
وبغض النظر عن النموذج الحيواني الذي يتم اختياره، فإن نهج الحصول على البيانات المعتمد هو عنصر حاسم في أي دراسة ناجحة وشاملة. في نماذج القوارض من الصرع ما بعد الصدمة تواتر النوبات منخفضة14، تتراوح بين 0.3-0.4 المضبوطات في اليوم9،15، والفترة الكامنة قبل النوبة الأولى يمكن أن تستمر في أي مكان من أيام أو أسابيع إلى أشهر حتى بعد إجراء TBI الأولي. وأخيراً، وعلى النقيض من النماذج غير المؤلمة، التي لديها معدل أعلى عموماً من النوبات على مدى فترة زمنية أقصر، في المتوسط فقط 9٪ -50٪ من الحيوانات مع TBI سيكون لها نوبات عفوية على مدى فترة تصل إلى ستة أشهر8،16. وهذا يشير إلى أن الدراسات المجدية تتطلب تسجيلًا مستمرًا على المدى الطويل لـ Video-EEG.
الهدف الشامل من كل نموذج من الحيوانات من TBI هو استنساخ بأكبر قدر ممكن من أشكال مختلفة من TBI وجدت في المرضى البشريين، من أجل تحقيق أفضل الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء PTE. ستساعد التقنيات في هذا البروتوكول على تسهيل اكتشاف الأهداف العلاجية، واختبار فعالية وقابلية المرشحين الوقائيين والعلاجيين الجدد، وتطوير مؤشرات بيولوجية أو مؤشرات موثوقة للصرع بعد TBI.
التحديات المحتملة أثناء إجراء إسقاط الوزن
نظرًا لعدم إصلاح الرأس في إطار مجسم ، يجب توخي مزيد من الحذر لضمان وضع مسطح للرأس واللوحة المعدنية. إذا كان قضيب مرجح يضرب لوحة معدنية أو الرأس في زاوية أو إذا كان الوزن ينزلق قبالة إلى جانب رأس الماوس، والميكانيكا الحيوية الإصابة سوف تختلف، وربما يؤدي إلى إصابة أكثر اعتدالا أو لا. في الماضي، كانت اللوحة المعدنية ملتصقة بالجمجمة لتقليل التقلبات. ومع ذلك ، فإن إزالة اللوحة المعدنية والغراء من جمجمة الماوس بعد انخفاض الوزن ، حتى لو أجريت بعناية ، تسببت في تلف الأورام ، مما أدى إلى تلف الأوعية الدموية والأضرار اللاحقة لأنسجة الدماغ حتى في الحيوانات الصورية. علاوة على ذلك ، يتطلب الشق الشفاء ، مما قد ينطوي على استجابة مناعية محيطية ، مما قد يؤدي إلى حدوث تغير. لهذه الأسباب تم اختياره لحذف لصق لوحة معدنية على الجمجمة. قد تموت الحيوانات مع تكرار (أي 3x في هذا البروتوكول) إصابة. الفئران مع وزن الجسم أقل من 25 ز قد لا تتسامح مع الآثار المتكررة. في حين أن الإصابات الفردية لا تؤدي إلى الوفيات ، فإن ما يصل إلى 7٪ من الحيوانات C57BL/6 تموت بعد الارتطامات المتكررة9. ويمكن ملاحظة العجز الحركي في بعض الحيوانات. هذه الصعوبات تظهر كخلل في الساق الخلفية أو تشوهات مشية. هذا هو عادة عامل التكهن لضعف الانتعاش، ويوصى أن يتم التضحية بالحيوان. علامات الألم أو الضيق تشمل فقدان الوزن، وسوء الاستمالة، والجفاف، وزيادة القلق، وانخفاض أو غياب النشاط الاستكشافي (هيدروجيل / الانتعاش، وتشاو و / أو النشاش لا تزال بمنأى). يمكن إعطاء مسكن الإنقاذ (0.1 ملغ/كغ من البوبرينورفين) تحت الجلد كل 8 ح لمدة ثلاثة أيام من TBI لتخفيف الألم ومنع الحيوان من الوصول إلى نقطة النهاية الإنسانية. يمكن إعطاء محلول لاكتات الصوديوم تحت الجلد (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) مرتين في اليوم للترطيب. عادة ما تتعافى الحيوانات في غضون ثلاثة أيام بعد TBI. استخدام درجة حالة الجسم في خمس مراحل (BCS) لمراقبة الحيوانات بعد إجراء التجارب ويوصى. وتشمل المراحل (1) الهزال (هياكل الهيكل العظمي بارزة للغاية، والفقرات مجزأة للغاية)؛ و (2) الهزال (الهياكل العظمية) (الهياكل الهيكلية بارزة للغاية، والفقرات المجزأة للغاية)؛ و (2) الهياكل العظمية (الهياكل الهيكلية بارزة للغاية، والفقرات المجزأة للغاية)؛ و (2) الهياكل العظمية (الهياكل العظمية) (2) غير مشروط (تجزئة العمود الفقري واضح ، عظام الحوض الرضحة واضحة بسهولة) ؛ (3) مكيفة جيدا (الفقرات والحوض الظهري ليست بارزة واضح مع ضغط طفيف)؛ (4) الإفراط في تكييف (العمود الفقري هو عمود مستمر، فقرات واضحة فقط مع ضغط ثابت)؛ (5) السمنة (الماوس على نحو سلس وضخم، والعظام هيكل يختفي تحت اللحم والدهون تحت الجلد). يتم الوصول إلى نقطة النهاية الإنسانية عندما يكون BCS هو 1-2، 20٪ أو أكثر من فقدان الوزن في فأر بالغ مقارنة بوزنه قبل TBI، لا يتم تخفيف أعراض الألم أو الضيق عن طريق المسكنات، وعلامات تشويه الذات، وأعراض الجفاف، وانخفاض حرارة الجسم، ووجود عجز عصبي (مشية غير طبيعية أو انحلال المحرك). وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عدة نتائج محتملة لادارة المواد. بوبرينورفين حقن تحت الجلد يصل إلى الذروة الأولى من تأثيرمسكن لها في 10 دقيقة بعد الحقن17. يحدث التأثير الأول بعد ثوان من إعطاء البوبرينورفين ، مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن يتأثر القياس الأول لوقت تصحيح المعيشة. ومع ذلك، لا يمكن استبعاد هذا تماماً كمتغير. ومن ثم، يُنصح المجربين بممارسة حكمهم الخاص. إذا كان إجراء انخفاض الوزن يتبعه جراحة مجسمة ويتم إعطاء carprofen من المهم ملاحظة أن carprofen هو عامل مضاد للالتهابات التي قد تؤثر على حدوث النوبات ، وبالتالي ينصح المجربين للنظر في استخدامه بعناية.
التحديات المحتملة أثناء الجراحة
سيتم خفض خطر التلوث أو العدوى باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪، ولكنه لن يؤدي إلى ظروف معقمة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام قفازات جراحية معقمة. ومع ذلك ، فإن الجهاز المجسمة ليس في حد ذاته معقمًا ، لذلك سيؤدي أي تلاعب يدوي إلى فقدان الحالة المعقمة للقفازات. وبالتالي ، مطلوب رش مع الإيثانول 70 ٪ بعد الاتصال مع أي مادة غير معقمة أثناء الجراحة. الحفر من خلال الجمجمة في الدماغ يخلق ضررا على أنسجة الدماغ ويمكن أن يسبب نزيف غزير. خلق ثقوب بور يأخذ الرعاية القصوى. يتم تحديد الحفار اليدوي في الذراع المجسمة والتخفيض التدريجي له، ويفضل على الحفر في حين عقد الحفر يدويا. قد تغرق الأقطاب الكهربائية ومسامير التثبيت أعمق مما كان مخططًا له ، مما يؤدي إلى إصابة ماطر الجافية (موضع تحت الجافية) أو القشرة (الموضع القشري). وهذا قد يسبب نزيف غزير وآفة بؤرية. يجب على المجرب تجنب ارتفاع درجة حرارة الحيوان أثناء الجراحة. إذا لم يتم إصلاح جهاز استشعار درجة الحرارة بشكل صحيح فإنه لن يحافظ على درجة الحرارة المطلوبة 37 درجة مئوية، مما تسبب في ارتفاع درجة الحرارة، والحروق، وأحيانا وفاة الحيوان نتيجة لذلك. عيون الحيوان الحصول على الجافة، غضب، أو التالفة أثناء الجراحة إذا لم يتم تشحيمها بمجرد وضع الحيوان في جهاز مجسم.
الرصد بعد العملية الجراحية
يبدأ الرصد بعد الجراحة مباشرة بعد انتهاء العملية أو الجراحة. راقب الحيوان حتى يستيقظ من التخدير وابحث عن وجود أو عدم وجود أي مضاعفات متعلقة بالجراحة، بما في ذلك النزيف أو الانقلاق. إذا لوحظ نزيف من إغلاق شق غير مكتملة، وقم بقمّة الحيوان، وتنظيف موقع النزيف مع الكلورهيكسيدين، وإجراء إغلاق الجرح كما هو موضح أعلاه وإعادة الحيوان إلى قفص الانتعاش. ما يقرب من 1-2 ساعة بعد الجراحة، يجب أن يكون الحيوان مستيقظا تماما من التخدير، وتتحرك بحرية في القفص مع عدم وجود علامات على انزلاق أو ألم. سيبدأ الحيوان في الاستمالة بنفسه ، وهذا هو السبب في أن ختم الشق ضروري لمنع الحيوان من فتحه أثناء الاستمالة. بمجرد استعادة الحيوان ، قم بنقله إلى القفص / الغرفة التي سيتم استخدامها للحصول على بيانات EEG. وهذا سيسمح للالحيوان للحصول على التعود على البيئة الجديدة. هذا مهم بشكل خاص للتسجيل على المدى الطويل (أشهر). يجب أن يكون قفص الحيوان هلام الانتعاش (انظر جدول المواد)،والطعام الرطب، والنش، وزجاجة مياه. وهذا سيسمح بالتعافي السليم وسيتيح للحيوانات الحصول على المواد الغذائية والماء. مواصلة مراقبة الحيوان يوميا. يجب أن يشمل التقييم (أ) الفحص البصري لسلوك الحيوان لعلامات الألم أو الضيق ، بما في ذلك فقدان الوزن ، وضعف الاستمالة ، وزيادة القلق ، والنشاط الاستكشافي المنخفض أو الغائب (هيدروجيل / الانتعاش ، وتشاو و / أو النشاش لا يمسها) والشفاء السليم لمنطقة الشق حول زرع تخطيط كهربية الدماغ ؛ (ب) تقييم الـ BCS لعلامات الجفاف وسوء التغذية؛ (ج) وزن الحيوان. إدارة محلول لاكتات الصوديوم (3 ميكرولتر لكل غرام من وزن الحيوان) تحت الجلد إذا أظهر الحيوان علامات الجفاف (انظر جدول المواد). إعطاء البوبرينورفين (0.1 ملغ /كغ) تحت الجلد إذا كان الحيوان يظهر علامات الألم أو الضيق. إذا استمرت علامات الألم يمكن إعطاء البوبرينورفين كل 8 ح. يجب زيادة الرصد إلى مرتين في اليوم إذا كان الحيوان يظهر علامات الألم و / أو الضيق. السماح للمستشفى بالتعافي لمدة ثلاثة أيام على الأقل بعد جراحة تخطيط كهربية الدماغ قبل الاتصال بنظام الاستحواذ عبر حبل. معايير نقطة النهاية الإنسانية هي نفسها كما في التحديات المحتملة أثناء إجراء إسقاط الوزن أعلاه.
مزايا وعيوب أنظمة الاستحواذ وأجهزة التحميل
الميزة الرئيسية لنظام EEG 1 مع حامل قناة EEG واحد هو التكلفة المنخفضة نسبيا من الأجهزة والمكونات والخدمة. كما يسمح التكوين البسيط والمباشر للمستخدمين بتخصيص النظام وفقًا لتفضيلاتهم. كل مكبر للصوت التفاضلية يوفر قناة تخطيط كهربية الدماغ واحد، على الرغم من أن العديد من مكبرات الصوت التفاضلية يمكن أن تكون متصلا مع بعضها البعض، مما يزيد من عدد القنوات لكل الحيوانات. في هذا النظام، تم استخدام تكوين قناة واحدة لكل الحيوان للحصول على تسجيلات تخطيط كهربية الدماغ المزمنة طويلة الأجل لـ 20 الحيوانات في وقت واحد. يتم تعميم نوبات ما بعد الصدمة عادة ، ومع المونتاج ثنائي القطب للأقطاب الكهربائية ، من السهل اكتشاف هذا النوع من النشاط الصرعي. غير أن عيب هذا النهج هو أنه من المستحيل الكشف بشكل موثوق عن التموّس أو التّعاون الجانبي أو انتشار النشاط النفي، لأن ذلك يتطلب عدة قنوات. وثمة تحد محتمل آخر يمكن أن يتمثل في تلوث الضوضاء في قناة واحدة مع مرور الوقت، مما يجعلها غير قادرة على الحصول على بيانات مفيدة من الحيوان. ويمكن التغلب على ذلك عن طريق الجمع بين اثنين أو أكثر من مكبرات الصوت التفاضلية، مما يضاعف عدد القنوات لكل الحيوان. وأخيراً، يصعب التمييز بين البيانات التي يتم الحصول عليها من قناة واحدة من القطع الأثرية المحتملة، وأفضل نشاط الارتشاف مدعوم بتسجيلات فيديو لسلوك الحيوان. لهذا السبب، جمعت جميع التسجيلات بين المراقبة المستمرة المتزامنة للفيديو مع الاستحواذ على EEG. ومن القيود المفروضة على هذا النظام وبرنامجه أنه لا يشمل نظام اقتناء الفيديو، وبالتالي يتطلب نظام جهة خارجية مخصص للحصول على فيديو متزامن.
الميزة الرئيسية لنظام EEG 2 مع headmounts متعددة القنوات هي الجودة العالية للإشارة بسبب التصفية المسبقة للإشارة المكتسبة من قبل المضخم المسبق (انظر جدول المواد)قبل أن يتم تمريرها من خلال التنقل إلى مكبر الصوت. تسمح مكبرات الصوت في هذا النظام بالحصول على البيانات في ثلاث قنوات في التكوينات التالية: 2 قنوات EEG +1 EMG أو ثلاث قنوات EEG (انظر جدول المواد). وهذا يسمح للكشف ليس فقط من النشاط المعمم ولكن أيضا، يحتمل، والنشاط الصرع البؤري. ميزة رئيسية أخرى هي أن هذا النظام تم تصميمه خصيصًا للأبحاث الحيوانية ، وبالتالي يوفر نظام تسجيل فيديو وبرامج قادرة على مزامنة EEG وقنوات الفيديو لما يصل إلى أربعة الحيوانات في ملف واحد ، مما يجعل التحليل أسهل وأكثر ملاءمة من نظام EEG 1. هذا النظام سهل الاستخدام للحصول على البيانات للاستيلاء على وتحليل النوم دون أي تعديلات على النظام بخلاف نوع headmount المستخدمة. يسمح حامل الرأس 2EEG/1EMG بزرع الأقطاب الكهربائية في مواقع ثابتة فقط ، نظرًا لحجم وتكوين لوحة الدوائر. الأقطاب المسمار مع يؤدي الأسلاك في headmounts 3EEG تسمح المرونة في زرع في الموقع المطلوب مع إمكانية القيام إما الاحتكار أو اكتساب ثنائي القطب اعتمادا على المكان الذي يتم وضع القطب المرجعي. ومع ذلك ، فإن زرع حامل الرأس 3EEG يتطلب لحام ، مما يضيف المزيد من الخطوات إلى الجراحة ويتطلب المزيد من الحذر والدقة. تم تصميم الحبال ومكبرات الصوت التي تم توصيلها خصيصًا للقوارض الصغيرة مثل الفئران والجرذان غير الناضجة ، وهي كابلات رقيقة ومنخفضة الوزن تسبب ضغطًا ضئيلًا على رأس الحيوان. عيب النظام هو التكلفة العالية نسبيا للأجهزة والبرامج وترخيص الفيديو والمكونات (أي مكبرات الصوت والرأس).
الأهمية والخطوات الحاسمة في الحصول على بيانات EEG
يحتوي المنازة على آلية دوارة ، مما يسمح للحبل بالدوران اعتمادًا على اتجاه حركة الحيوان. إذا فشلت هذه الآلية ، سيتم تقييد حركة الحيوان ، مما قد يؤدي إلى إزالة غطاء تخطيط كهربية الدماغ. يمكن محاولة إجراء جراحة متكررة لوضع أقطاب كهربائية جديدة. ومع ذلك، يمكن أن يكون هذا تحديا أو مستحيلا إذا إزالة غطاء تخطيط كهربية الدماغ السابق تسبب تلف الجمجمة والدماغ. يجب أن يكون معدل أخذ العينات لاقتناء بيانات تخطيط كهربية الدماغ على الأقل 2-2.5 × أعلى تردد للفائدة. ويؤدي ارتفاع معدلات أخذ العينات إلى ارتفاع دقة البيانات بسعر الزيادة في حجم الملف، الذي قد يصبح من الصعب تخزينه ومعالجته عند الحصول على تسجيلات مستمرة لكائنات متعددة. وبالتالي ، فمن الضروري لتحسين معدل أخذ العينات إلى مستوى يسمح بالحصول على البيانات اللازمة دون فقدان الجودة مع تقليل أحجام الملفات.
الأهمية والخطوات الحاسمة في الحصول على بيانات الفيديو
في القوارض ، كما هو الحال في البشر ، يمكن أن يظهر PTE مع تباين واسع في الأعراض المرتبطة والروابط الكهروجرافيكية ، مما يجعل من الضروري الحصول على فيديو متزامن أثناء اكتساب EEG من أجل تفسير وتصنيف أحداث تخطيط كهربية الدماغ الملاحظة بشكل صحيح. تفسير بيانات تخطيط كهربية الدماغ في غياب الفيديو المتزامن هو صعب بشكل خاص عند استخدام قناة EEG واحدة. في هذه الحالة ، قد يكون من الصعب تحديد ما إذا كان شكل موجي تخطيط كهربية الدماغ هو قطعة أثرية ، ما لم تدعم أدلة أخرى (فيديو) التصنيف كمصادرة. يمكن أن تظهر التحف المتحركة مشابهة للنمط الكهربائي للمصادرة. وبالتالي ، الفيديو مع أو بدون تأكيد EMG هو شرط. أثناء إجراء تسجيل الفيديو أثناء كل من الدورات الفاتحة والداكنة، قد لا تكون جودة الفيديو مرضية وواضحة دائمًا خلال الساعات المظلمة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم تحويل الحيوان بعيدا عن الكاميرا خلال الحدث EEG مثل ICTAL ، قد يكون من الصعب تقييم سلوكه. في تلك الحالات، يمكن الحصول على إشارة التصوير الكهربائي (EMG) بالإضافة إلى تخطيط كهربية الدماغ والفيديو حل التحدي من خلال توفير معلومات حول نشاط العضلات أثناء النوبات السلوكية المعتدلة (مع مكونات المحرك منخفضة) أو لتأكيد عدم وجود حركة الحيوان أثناء غياب مثل ارتفاع وبطء موجة التفريغ على تخطيط كهربية الدماغ. التحديات المحتملة مع قناة EMG مماثلة للتحديات مع قنوات EEG، مثل تلوث الضوضاء، ووضع غير صحيح من الأقطاب الكهربائية، أو الأقطاب الكهربائية تصبح فضفاضة (أو فقدان الاتصال السطحي) على مدى فترة طويلة من التسجيل. استخدام الفيديو جنبا إلى جنب مع تحليل تخطيط كهربية الدماغ له غرضان: التأكيد على أن حدث تخطيط كهربية الدماغ ليس قطعة أثرية ناجمة عن حركة الحيوان (السلوك الاستكشافي ، والشرب ، والمضغ ، والخدش ، والتمدد ، والاستمالة ، أو التنفس السريع / الشاق) والتمييز بين النوبات المتشنجة وغير المتشنجة. يوصى باستخدام مقياس راسين المعدل لتوصيف النوبات المتشنجة أو غير المتشنجة. وتشمل المراحل (0) ضبط الكهربية النقية دون أي مظهر حركي يمكن التعرف عليه؛ (2) ضبط الكهربية النقية دون أي مظهر حركي يمكن التعرف عليه؛ (2) ضبط الكتروغرافيا النقية دون أي مظهر حرك (1) automatisms Orofacial والإيماء الرأس؛ (2) رعشة البوَيَق ِاليَنَة؛ (3) الكلونوس الطرف الأمامي الثنائي؛ (4) الكلونات الأمامية وتربية؛ (5) كونوس الاطراف الأمامية مع تربية وسقوط. يجب أن تظهر كل قناة فيديو بوضوح السطح بأكمله مع الحيوان في القفص ، وهو ملصق مع رقم تعريف الحيوان ، وطرف زجاجة المياه ، والطعام ، والنظام الغذائي / هلام الانتعاش. لضمان الحصول على الفيديو خلال الساعات المظلمة، استخدم مصدر ليلة الأشعة تحت الحمراء. (تحتوي بعض الكاميرات على أجهزة مدمجة أو قد تتطلب أجزاء إضافية. انظر جدول المواد). ضبط الإطار في الثانية معدل ودقة الصورة. أعلى معدل الإطار والقرار تأتي على حساب حجم ملف أكبر. المساوئ الرئيسية للحصول على الفيديو خلال التجارب المستمرة المزمنة لفترات طويلة تشمل الحاجة إلى تخزين كميات كبيرة جدا من البيانات والصعوبات التقنية التي ينطوي عليها تجهيز الملفات الكبيرة. كما يجب النظر في كفاءة المجرب لتفسير البيانات السلوكية بشكل فعال جنبا إلى جنب مع تخطيط كهربية الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/الولايات المتحدة وCURE على أساس منحة CURE وردت من قيادة البحوث الطبية والعتاد في جيش الولايات المتحدة، وزارة الدفاع (وزارة الدفاع)، من خلال برنامج أبحاث الصحة النفسية وإصابات الدماغ الرضية تحت الجائزة رقم. W81XWH-15-2-0069. إيفان زويدهوك يحظى بتقدير كبير لتدقيق المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
- Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
- Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
- Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
- Piccenna, L., Shears, G., O'Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
- Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science. (2007).
- Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
- Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
- Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
- Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).
