Detta systematiska protokoll beskriver en ny djurmodell av posttraumatisk epilepsi efter repetitiva mild traumatisk hjärnskada. Den första delen detaljer steg för traumatisk hjärnskada induktion med hjälp av en modifierad viktminskning modell. Den andra delen ger instruktioner om den kirurgiska metoden för single- och flerkanaliga elektroencefalografiska datainsamlingssystem.
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en ledande orsak till förvärvad epilepsi. TBI kan resultera i en fokal eller diffus hjärnskada. Focal skada är ett resultat av direkta mekaniska krafter, ibland tränger genom kraniet, skapa en direkt skada i hjärnvävnaden. Dessa är synliga under hjärnavbildning som områden med kontusion, skärsår och blödning. Focal skador inducera neuronal död och gliaärr bildning och finns i 20%−25% av alla människor som ådrar sig en TBI. I de flesta fall av tbi orsakas dock skador av accelerationsretardationskrafter och efterföljande vävnadssklippning, vilket resulterar i icke-fokal, diffus aska. En subpopulation av TBI-patienter fortsätter att utveckla posttraumatisk epilepsi (PTE) efter en latensperiod på månader eller år. För närvarande är det omöjligt att förutsäga vilka patienter som kommer att utveckla PTE, och beslag hos PTE patienter är utmanande att kontrollera, vilket kräver ytterligare forskning. Fram till nyligen var fältet begränsat till endast två djur / gnagare modeller med validerade spontana posttraumatiska anfall, båda presenterar med stora fokal skador med massiv vävnad förlust i cortex och ibland subkortikala strukturer. I motsats till dessa metoder, det fastställdes att diffusa TBI inducerad med hjälp av en modifierad viktminskning modell är tillräcklig för att initiera utvecklingen av spontana konvulsiva och icke-konvulsiva anfall, även i avsaknad av focal skador eller vävnad förlust. I likhet med mänskliga patienter med förvärvad posttraumatisk epilepsi, presenterar denna modell med en latensperiod efter skada före anfall debut. I detta protokoll kommer samhället att förses med en ny modell av posttraumatisk epilepsi, med uppgifter om hur man inducerar diffusa icke-lesional TBI följt av kontinuerlig långsiktig video-elektroencefalografiska djur övervakning under loppet av flera månader. Detta protokoll kommer att detalj djurhantering, viktminskning förfarande, elektrod placering för två förvärvssystem, och de frekventa utmaningar som uppstått under vart och ett av stegen i kirurgi, postoperativ övervakning och datainsamling.
Varje år påverkar TBI uppskattningsvis 60 miljoner människor världen över. Drabbade individer löper större risk att utveckla epilepsi, vilket kan manifestera år efter den första skadan. Även allvarliga TBC är förknippade med en högre risk för epilepsi, även mild TBI ökar en individs chans att utveckla epilepsi1,2,3,4. Alla TBI kan klassificeras som focal, diffusa eller en kombination av båda. Diffus hjärnskada, som finns i många om inte alla TBI, är ett resultat av hjärnvävnader av olika densiteter som klipper mot varandra på grund av accelerationsretardation och rotationskrafter. Per definition uppstår diffus skada endast i isolering i mild / hjärnskakning icke-penetrerande hjärnskada, där inga hjärnskador är synliga på datortomografi skanningar5.
Det finns för närvarande två kritiska problem i förvaltningen av patienter som har, eller löper risk att utveckla posttraumatisk epilepsi (PTE). Den första är att när PTE har manifesterat, beslag är resistenta mot tillgängliga antiepileptiska läkemedel (AED)6. För det andra är AED lika ineffektiva när det gäller att förebygga epileptogenes, och det finns inga effektiva alternativa terapeutiska metoder. För att ta itu med detta underskott och hitta bättre terapeutiska mål och kandidater för behandling, kommer det att bli nödvändigt att utforska nya cellulära och molekylära mekanismer vid roten av PTE6.
En av de framträdande dragen i posttraumatisk epilepsi är den latenta perioden mellan den första traumatiska händelsen och uppkomsten av spontana, oprovocerade, återkommande anfall. De händelser som inträffar inom detta tidsmässiga fönster är ett naturligt fokus för forskare, eftersom detta tidsfönster kan möjliggöra behandling och förebyggande av PTE helt och hållet. Djurmodeller används oftast för denna forskning eftersom de erbjuder flera olika fördelar, inte minst är att kontinuerlig övervakning av mänskliga patienter skulle vara både opraktisk och kostsam under så potentiellt lång tid. Dessutom kan cellulära och molekylära mekanismer vid roten av epileptogenes endast utforskas i djurmodeller.
Djurmodeller med spontana posttraumatiska anfall och epilepsi föredras framför modeller där anfall induceras efter TBI med mindre fysiologiskt relevanta medel, såsom genom chemoconvulans eller elektrisk stimulering akut, kroniskt eller genom tändsticka. Spontana posttraumatiska beslag modeller testa hur TBI ändrar friska hjärnan nätverk som leder till epileptogenes. Studier med ytterligare stimulering efter TBI bedöma hur exponering för TBI minskar krampanfall tröskel och påverkar mottaglighet för anfall. Fördelarna med djurmodeller med anfall som orsakas kemiskt eller med elektrisk stimulering är att testa de specifika mekanismerna för brytning till AEDs och effekten av befintliga och nya AEDs. Men graden av relevans och översättning av dessa uppgifter för människor kan vara tvetydig7 på grund av följande: 1) beslagmekanismer kan skilja sig från dem som orsakas av TBI ensam; 2) inte alla dessa modeller leder till spontana anfall7; 3) skador som skapats av konvulsant ansmedlet själv, med kanylen som krävs för dess leverans, eller genom att stimulera elektrodplacering i djupstrukturer (t.ex. hippocampus eller amygdala) kan redan orsaka ökad krampanfall och även hippocampus epileptiform fältpotentialer7. Dessutom producerar vissa konvulsiva medel (dvs. kainsyra) direkta hippocampus lesioner och skleros, vilket inte är typiskt efter diffust TBI.
Fram till nyligen fanns endast två djurmodeller av posttraumatisk epilepsi: kontrollerad när som påverkas (CCI, focal) eller vätskeslagverkskada (FPI, fokal och diffus)8. Båda modellerna resulterar i stora fokalskador vid sidan av vävnadsförlust, blödning och gliosis hos gnagare8. Dessa modeller efterliknar posttraumatisk epilepsi framkallas av stora focal organskador. En färsk studie visade att upprepade (3x) diffusa TBI är tillräcklig för utveckling av spontana anfall och epilepsi hos möss även i avsaknad av fokal skador9, lägga till en tredje gnagare PTE modell med bekräftade spontana återkommande anfall. Denna nya modell härmar cellulära och molekylära förändringar som orsakas av diffusa TBI, bättre representerar den mänskliga befolkningen med milda, hjärnskakning TBI. I denna modell, den latenta perioden på tre veckor eller mer före beslag debut och uppkomsten av sena, spontana, återkommande beslag gör det möjligt att undersöka de grundläggande orsakerna till posttraumatisk epileptogenes, testa effekten av förebyggande metoder och nya terapeutiska kandidater efter beslag debut, och har potential för utveckling av biomarkörer av posttraumatisk epileptogenes eftersom ungefär hälften av djuren utvecklar posttraumatisk epilepsi.
Valet av djurmodell för studier av posttraumatisk epilepsi beror på den vetenskapliga frågan, vilken typ av hjärnskada som undersökts och vilka verktyg som kommer att användas för att bestämma de underliggande cellulära och molekylära mekanismerna. I slutändan måste alla modeller av posttraumatisk epilepsi visa både uppkomsten av spontana anfall efter TBI och en inledande latensperiod i en delmängd av TBI djur, eftersom inte alla patienter som ådrar sig en TBI fortsätta att utveckla epilepsi. För att göra detta används elektroencefalografi (EEG) med samtidig videoanskaffning i detta protokoll. Att förstå de tekniska aspekterna bakom dataanskaffningsmaskinvara och metoder är avgörande för korrekt datatolkning. De kritiska maskinvaruaspekterna omfattar typen av inspelningssystem, typ av elektroder (skruv- eller trådkabel) och material som de är tillverkade av synkroniserade videoförvärv (som en del av EEG-systemet eller tredje parten) och egenskaperna hos datorsystemet. Det är absolut nödvändigt att fastställa lämpliga anskaffningsparametrar i alla typer av system beroende på studiemål, EEG-händelser av intresse, ytterligare analysmetod och hållbarhet för datalagring. Slutligen måste metoden för elektrodkonfiguration (montage) beaktas, eftersom var och en har fördelar och nackdelar och kommer att påverka datatolkningen.
Detta protokoll beskriver hur man använder den modifierade Marmarou viktdroppmodell10,11 för att inducera diffus skada som resulterar i spontana, oprovocerade, återkommande anfall hos möss, beskriver kirurgiska metoder för att förvärva en enda- och flerkanalskontinuerlig, och synkroniserad video EEG med monopol, bipolär, eller blandade montage.
I motsats till CCI- och FPI-modeller som inducerar antingen fokal eller kombination av fokal och diffus skada, möjliggör modellen av repetitivdiffust TBI som beskrivs i detta protokoll för induktion av diffus skada i avsaknad av brännvidd svaroskada och kräver inte hårbotten eller kranialöppningar och tillhörande inflammation. En extra fördel med frånvaron av traniectomy i denna modell är att det gör det möjligt att inte bara implantera elektroderna för kronisk kontinuerlig EEG-inspelning, men också skapan…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/UNITED STATES och CURE baserat på ett bidragCURE som mottagits från United States Army Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), genom Psychological Health and Traumatic Brain Injury Research Program under Award No. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek är mycket uppskattad för korrektur läsa manuskriptet.
0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
Drill | Foredom | HP4-917 | |
Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
Solder | Harware store | ||
Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
Stainless steel disc | Custom made | ||
Sterile cotton swabs | |||
Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |