Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Summary

Het doel van dit protocol is het vormen van ensembles van moleculaire motoren op DNA origami nanostructuren en observeren het ensemble motiliteit met behulp van totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie.

Abstract

Cytoskelet motoren zijn verantwoordelijk voor een breed scala aan functies in eukaryotische cellen, met inbegrip van mitose, vrachtvervoer, cellulaire beweeglijkheid, en anderen. Veel van deze functies vereisen dat motoren in ensembles werken. Ondanks een schat aan kennis over de mechanismen van individuele cytoskelet motoren, is relatief minder bekend over de mechanismen en emergente gedragingen van motorische ensembles, waaronder veranderingen in het ensemble processiviteit en snelheid met motornummer, locatie en configuratie wijzigen. Structurele DNA-nanotechnologie, en de specifieke techniek van DNA-origami, maakt de moleculaire bouw van goed gedefinieerde architecturen van motor ensembles mogelijk. De vorm van laad constructies en het type, het aantal en de plaatsing van de motoren op de constructie kunnen allemaal worden aangestuurd. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor het produceren van deze ensembles en het observeren ervan met behulp van totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie. Hoewel deze technieken specifiek zijn toegepast voor cytoskelet motoren, zijn de methoden generaliseerbaar voor andere eiwitten die in complexen samenkomen om hun taken te volbrengen. Over het algemeen biedt de DNA-origami methode voor het maken van goed gedefinieerde ensembles van motor eiwitten een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de mechanismen die leiden tot emergente motiel gedrag.

Introduction

Dynein en kinesin zijn cytoskelet motorische eiwitten die verantwoordelijk zijn voor talloze functies in eukaryotische cellen¹. Door het omzetten van de chemische energie van ATP hydrolyse in productief werk, deze motoren translocate op microtubuli te trekken en distribueren van verschillende intracellulaire cargo’s. Ze coördineren ook in de massale intracellulaire herschikkingen geassocieerd met mitose, waar ze georkestreerde krachten vertonen die bijdragen aan de positionering en scheiding van chromosomen. Structurele, biochemische en biofysische assays, waaronder waarnemingen van enkelvoudige moleculen, hebben de mechanismen van deze motoren op individueel niveau onthuld (goed beoordeeld in eerdere werken^2,3,4). Veel van de taken van de motoren vereisen echter dat ze werken in kleine ensembles van zowel soortgelijke als gemengde motortypen. Relatief minder wordt verstaan de mechanismen die de activiteit en de ultieme emergente beweeglijkheid van deze ensembles van^5,6coördineren. Deze kenniskloof is deels te wijten aan de moeilijkheid om ensembles te creëren met bestuurbare functies, zoals motortype en kopie nummer. In het afgelopen decennium zijn de moleculaire bouwtechnieken van DNA-origami gebruikt om dit probleem op te lossen. Voor de microtubulus gebaseerde motoren, enkele voorbeelden van deze onderzoeken omvatten enkelvoudige molecuul observaties van ensembles van cytoplasmatische dynein-1^7,8,9, intraflagellar dynein¹¹, verschillende kinesin Motors^12,13, en mengsels van zowel dyneinen en kinesins^7,14,15. Hier geven we Details over de zuivering en oligonucleotide labeling van motoren van gist^{7,16,17,18,19,20}, de vouwen en zuiveren van gesegmenteerde DNA-origami met instelbare compliance⁸, en de beeldvorming van de gist motoren die de chassis structuren^7,18aandrijken.

Het bouwen van motor ensembles voor in-vitro observatie van één molecuul vereist drie primaire inspanningen. De eerste is de uitdrukking, zuivering en etikettering van motor constructies die geschikt zijn voor het aanbrengen van DNA-origami. De tweede is de productie en zuivering van gedefinieerde DNA origami structuren (vaak aangeduid als “chassis”). En de derde is de conjugatie van de motoren aan de chassis structuur gevolgd door observatie met behulp van totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Hier bieden we gevestigde protocollen voor dit proces voor op recombinant microtubulon gebaseerde motoren gezuiverd van de gist Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18, 19}. in deze gist expressie-systeem zijn onderzoek gedaan naar op DNA gebaseerde motor ensembles met zowel recombinant kinesin¹⁵ als dynein^7,8,18 constructies.^{16 ,17,18,19}. Dit protocol is geldig voor deze constructies, gezien het feit dat ze worden gecontroleerd door de galactose geïnduceerde promotor, en samengesmolten tot dezelfde eiwit Tags voor zuivering (ZZ en TEV protease linker) en voor DNA oligo conjugatie (SNAPtag).

Specifieke giststammen produceren specifieke motor constructies. Bijvoorbeeld, de dynein gebruikt voor het bestuderen van de rol van de naleving van de lading werd gezuiverd uit stam RPY1084^7,8. Over het algemeen kunnen stammen die motor constructies bevatten met passende genetische modificaties voor expressie en zuivering, worden opgevraagd bij de laboratoria die het gebruik van deze motoren hebben gepubliceerd. Constructies met nieuwe attributen zoals mutaties of tags kunnen worden gemaakt met behulp van recombinant genetische technieken, zoals lithium acetaat transformatie²¹ en commerciële Kits. Gedetailleerde protocollen voor het maken van gemodificeerde motor eiwitten in gist voor enkelvoudige molecuul studies zijn gepubliceerd¹⁹. Naast de motoren die worden samengesmolten tot de SNAPtag, moeten de oligo’s die worden gebruikt om de motoren te labelen, worden geconjugeerd naar het SNAP substraat, benzylguanine (BG); eerder gepubliceerde protocollen beschrijven de vorming en zuivering van BG-oligo conjugaten¹⁸. De hier beschreven algemene strategie is ook gebruikt voor op actin gebaseerde motoren (zie eerdere werken voor voorbeelden^22,23,24) en motoren die zijn gezuiverd van andere organismen en expressie systemen (zie vorige werkt voor voorbeelden^{7,9,10,11,12,13,14}).

Gepolymeriseerde microtubuli (MTs) worden in deze experimenten gebruikt in twee verschillende procedures. MT affiniteits zuivering van functionele motoren vereist MTs die niet zijn geëtiketteerd met andere functionele groepen, terwijl de motor-ensemble motiliteit TIRF assay vereist MTs gelabeld met biotine en fluorohores. In alle gevallen worden MTs gestabiliseerd met taxol om denaturatie te voorkomen. De MT Affinity zuivering stap wordt gebruikt om alle niet-motiel motoren te verwijderen met een hoge MT affiniteit, als deze motoren kunnen veranderen ensemble beweeglijkheid als geconjugeerd aan een chassis. Tijdens dit proces binden actieve motoren de MTs en blijven ze in de oplossing, terwijl strakke motoren in de MT-pellet naar beneden draaien. Dit zorgt ervoor dat alle motoren op het chassis afkomstig zijn van een actieve populatie.

Een verscheidenheid aan DNA origami structuren zijn gebruikt voor het bestuderen van cytoskelet motorische ensembles. Naarmate het mechanistische begrip van het ensemble transport is toegenomen, zijn de DNA-origami structuren die in experimenten worden gebruikt, complexer geworden. In principe kan elke structuur voor dit doel worden aangepast, mits het is aangepast om enkel-streng DNA-bevestigings plaatsen voor motoren en fluor Foren te bevatten. Specifieke chassis ontwerpen en attributen kunnen nuttig zijn voor het doorgeven van specifieke vragen over het opkomende gedrag van motoren ensembles. Bijvoorbeeld, rigide hengels zijn gebruikt om basiskennis te ontwikkelen van hoe het Kopieer nummer van invloed is op het transport door teams van dyneinen en kinesins^7,15,18en 2D platforms zijn gebruikt om myosin ensemble te bestuderen navigatie van actine Networks²². Structuren met variabele of instelbare flexibiliteit zijn gebruikt om te begrijpen van de rollen van elastische koppeling tussen motoren en om te sonde hoe stappen synchronisatie beïnvloedt motiliteit^8,24. Meer recentelijk worden sferische structuren gebruikt om inzicht te krijgen in hoe geometrische beperkingen voor motortrack binding de dynamiek van motiliteit²⁵beïnvloeden.

In dit protocol bieden we specifieke stappen voor ensemble experimenten op gesegmenteerd chassis met variabele stijfheid. Binding sites op het chassis worden soms aangeduid als “handvatten”, terwijl complementaire DNA-sequenties die deze handvatten binden worden aangeduid als “anti-handles”. Het aantal motoren op deze chassis wordt bepaald door welke segmenten uitgebreide handgreep nieten met complementariteit met de antihandle oligo op de oligo-gelabelde motoren bevatten. Het gebruik van verschillende greep sequenties op verschillende segmenten maakt het mogelijk om verschillende soorten motoren te binden aan specifieke locaties op het chassis. Het chassis dat hier gedetailleerd is, bestaat uit 7 sequentiële stijve segmenten, elk bestaande uit 12 dubbel-streng DNA-helices gerangschikt in 2 concentrische ringen⁸. De stijve segmenten bevatten de motor grepen en zijn verbonden door regio’s die ofwel flexibel enkelvoudig of stijf DNA kunnen zijn, afhankelijk van de afwezigheid of aanwezigheid, respectievelijk, van “linker” nieten. De conformiteit van de chassis structuur wordt dus bepaald door de aanwezigheid of afwezigheid van deze “linker” nieten. Zie eerdere rapporten voor meer details en specifieke DNA-sequenties⁸. Daarnaast kunnen meerdere methodes gebruikt worden om chassis²⁶te zuiveren. De rate-zonale glycerol gradiënt centrifugeren methode²⁷ wordt hier beschreven.

Protocol

1. groei, expressie en oogst van motor eiwitten die worden gecontroleerd door een door galactose geïnduceerde promotor Gebruik een gist-peptone-dextrose (YPD) cultuur plaat en een steriele inoculerende stok, streak gewenste bevroren gist stam en incuberen voor 3-4 dagen bij 30 ° c. Dag 1 van cultuur groei: in de namiddag, voeg 10 mL YP cultuur media toe met 2% dextrose aan een glazen kweek buis van 1 “diameter en beënt het met een enkele kolonie van de plaat. Groei in een snel draaiende roltrommel …

Representative Results

Succesvolle zuivering van motoren en chassis structuren werden getest door gel elektroforese. SDS-PAGE analyse bevestigde de succesvolle extractie van dynein uit gist (Figuur 2), omdat het laatste filtraat dat in stap 2.3.7 werd verzameld een duidelijke, scherpe band toonde op de positie van ~ 350 kDa. Zoals verwacht, was deze dynein band afwezig van de flowthrough en was die ongewenste eiwitten verwijderd, en de parels waaruit dynein was gespleten. De observ…

Discussion

De moleculaire bouwtechnieken van DNA-origami bieden een unieke manier om motor ensembles te construeren met gedefinieerde architecturen, motor nummers en types, waardoor studies kunnen worden gedaan over hoe emergente gedrag voortkomt uit specifieke motor configuraties³¹. Als structurele en cellulaire studies blijven verhelmaken van voorbeelden van cytoskelet motoren werken in teams, technieken voor het isoleren en onderzoeken van de biofysische en biochemische mechanismen van motoren in ensemble…

Materials

2 mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure	Cytoskeleton.com	T333P-A
Biotin-BSA	Sigma	A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm	Beckman Coulter	356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm	Beckman Coulter	355603
Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL	GE Healthcare	17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty	Bio-Rad	7326204EDU
P8064 Scaffold	Tilibit	2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550
ProTev Protease	Promega	V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser	amazon.com	N/A
Sephacryl S-500 HR	GE Healthcare	17061310
Streptavidin	Thermo Fisher	434302
SYBR Safe DNA stain	Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton.com	T240-B
Tubulin, HiLyte 647	Cytoskeleton.com	TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes	Beckman Coulter	344090