Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא טופס הרכבים של מנועים מולקולריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים ולהתבונן ההרכב לתנועתיות באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ קרינה.
Abstract
מנועים ציטושלד אחראים מגוון רחב של פונקציות בתאי איקריוטית, כולל mitosis, הובלה מטענים, הסלולר תנועתיות, ועוד. רבים מהפונקציות הללו דורשות מנועים לפעול בהרכבים. למרות שפע של ידע על המנגנונים של מנועים בודדים ציטושלד, יחסית פחות ידוע על מנגנונים והתנהגויות מתהווה של הרכבים מוטוריים, דוגמאות של אשר כוללים שינויים ההרכב הרכב ומהירות עם שינוי מספר מוטורי, מיקום ותצורה. ננוטכנולוגיית דנ א מבנית, והטכניקה הספציפית של אוריגמי DNA, מאפשר בנייה מולקולרית של ארכיטקטורות מוגדרות היטב של הרכבים מוטוריים. הצורה של מבני מטענים, כמו גם סוג, מספר ומיקום של מנועים על המבנה יכול להיות נשלט. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים להפקת הרכבים אלה והתבוננות בהם באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ קרינה. למרות טכניקות אלה הוחלו במיוחד עבור מנועים ציטושלד, השיטות הן להכליל לחלבונים אחרים להרכיב מתחמים לבצע את משימותיהם. בסך הכל, שיטת ה-DNA אוריגמי ליצירת הרכבים מוגדרים היטב של חלבונים מוטוריים מספק כלי רב עוצמה לניתוח מנגנונים המובילים להתנהגות מתהווה מורצפת.
Introduction
Dynein ו קינזין הם השלד מוטוריים חלבונים האחראים פונקציות רבות בתאים איקריוטית1. על ידי המרת האנרגיה הכימית של ATP הידרוליזה לתוך עבודה יצרנית, מנועים אלה לאתר על microtubules לגרור ולהפיץ cargos שונים תאיים. הם גם מתאמים הסדרים תאיים מסיבי הקשורים mitosis, שם הם מציגים כוחות מתוזמר שתורמים מיקום והפרדה של כרומוזומים. מבנית, ביוכימית ובביופיסית assays כולל תצפיות במולקולה אחת, חשפו את המנגנונים של מנועים אלה ברמה האינדיבידואלית (שנסקרו היטב בעבודות קודמות2,3,4). עם זאת, רבים מהמשימות של מנועים דורשים מהם לעבוד בהרכבים קטנים של סוגי מנוע דומים ומעורבים. יחסית פחות מובן על המנגנונים המתאמים את הפעילות והתנועתיות האולטימטיבית של ההרכבים האלה5,6. פער ידע זה נובע, בין השאר, לקושי ביצירת הרכבים בעלי תכונות שלשליטה, כגון סוג מנוע ומספר עותק. במהלך העשור האחרון, טכניקות הבנייה המולקולרית של אוריגמי DNA כבר מועסקים כדי לפתור את הבעיה. עבור מנועי המיקרו-כדורית, מספר דוגמאות של חקירות אלה כוללות תצפיות בודדות של מולקולה של הרכבים של cytoplasmic דינאין-17,8,9, בתוך הבית דינאין בשנת11, מנועי השונים מוטורס 12,13, ותערובות של דיינונים וקיניתים7,14,15. כאן, אנו מספקים את הפרטים של טיהור ו-olig, הוספת תוויות של מנועים מ שמרים7,16,17,18,19,20, ה קיפול וטיהור של דנ א מקוטע אוריגמי עם תאימות tunable8, ואת הדמיה של מנועי שמרים דוחף את המבנים מארז7,18.
בניית הרכבים מוטוריים להתבוננות במולקולה בודדת מחוץ למבחנה דורשת שלושה מאמצים ראשוניים. הראשון הוא הביטוי, טיהור ותיוג של בנייה מוטוריים מתאים לחיבור ל-DNA אוריגמי. השני הוא ייצור וטיהור של מבנים מוגדרים DNA אוריגמי (נקרא לעתים קרובות "מארז"). והשלישי הוא הקוניוגציה של המנועים למבנה המארז ואחריו התבוננות באמצעות מיקרוסקופ כולל של השתקפות פנימית (TIRF). כאן, אנו מספקים פרוטוקולים הוקמה עבור תהליך זה עבור מנועים רקומביננטי מבוססי מיקרוטוכדורית מטוהרים מתוך שמרים סכביסים cerevisiae ס7,16,17,18, 19. DNA אוריגמי-מבוססי הרכבים מוטוריים נחקרו באמצעות שני רקומביננטי קינזין15 ו דינאין7,8, 18 בנייה המיוצר במערכת זו ביטוי שמרים16 ,17,18,19. פרוטוקול זה תקף עבור מבנים אלה, בהתחשב בכך שהם נשלטים על ידי היזם המושרה גלקטוז, ו התמזגו לתגי חלבון זהה עבור טיהור (ZZ ו-TEV פרוטאז מקשר) ו עבור הקונגו DNA oligo (SNAPtag).
זנים שמרים ספציפיים לייצר בונה מנוע ספציפי. לדוגמה, the דינאין המשמש לחקר את התפקיד של ציות מטענים היה מטוהר הזנים RPY10847,8. באופן כללי, זנים המכילים מבנים במבנים עם השינויים הגנטיים המתאימים לביטוי וטיהור ניתן לבקש ממעבדות לאחר שפרסמו את השימוש במנועים אלה. בנייה עם תכונות הרומן כגון מוטציות או תגים יכולים להתבצע באמצעות טכניקות גנטיות רקומביננטי, כגון שינוי ליתיום אצטט21 ערכות מסחריות. פרוטוקולים מפורטים ליצירת חלבונים מוטוריים שונה ב שמרים עבור מחקרים מולקולה אחת פורסמו19. בנוסף מנועי להיות התמזגו SNAPtag, האוליגוס המשמש תווית המנועים חייב להיות מחובר המצע הצמד, בנזיל (BG); פרוטוקולים שפורסמו בעבר מתארים את היווצרות וטיהור של שערים BG-oligo18. האסטרטגיה הכוללת המתוארת כאן גם היא מועסק עבור actin מבוססי מנועים (ראה עבודות קודמות לדוגמאות22,23,24), ומנועים מטוהרים ממערכות אחרות של אורגניזמים וביטויים (ראה קודם עבודות לדוגמא7,9,10,11,12,13,14.
מיקרוטובולים פלגניים (MTs) משמשים בניסויים אלה בשני הליכים שונים. הר האהדה לטיהור של מנועים פונקציונליים דורש mts שאינם מסומנים עם קבוצות פונקציונליות אחרות, בעוד ההרכב מנוע הרכב מצריך mts עם התווית ביוטין ו fluorophores. בכל מקרה, MTs מיוצבים עם מטקרול כדי למנוע דנטורציה. השלב לטיהור אהדה של MT משמש כדי להסיר כל מנועים שאינם מורעפים עם זיקה גבוהה MT, כמו מנועים אלה יכולים לשנות את ההרכב תנועתיות אם מצושל למארז. במהלך תהליך זה, פעילים מנועים להסיר את MTs ולהישאר בפתרון, בעוד מנועים הדוקה מחייב ספין למטה בתוך הגלולה MT. פעולה זו מסייעת להבטיח שכל המנועים במארז הם מאוכלוסיה פעילה.
מגוון של מבנים DNA אוריגמי שימשו לחקר הרכבים מוטוריים ציטושלד. כמו הבנה מכניסטית של התחבורה הרכב גדל, מבנים DNA אוריגמי מועסקים ניסויים גדלו במורכבות. בעיקרון, כל מבנה יכול להיות מותאם למטרה זו בתנאי שהוא שונה כדי לכלול בודד תקוע באתר המצורף דנ א עבור מנועים ו-fluorophores. עיצובים ותכונות מארזים ספציפיים עשויים להיות שימושיים לחטט שאלות מסוימות על התנהגות מתהווה של מנועים הרכבים. לדוגמה, מוטות קשיחים שימשו כדי לפתח ידע היסוד של איך עותק מספר משפיע על התחבורה על ידי צוותי dyneins ו קינימות7,15,18, פלטפורמות 2d שימשו כדי ללמוד רירן אנסמבל ניווט של רשתות אקטין22. מבנים בעלי גמישות משתנה או משתנים שימשו כדי להבין את התפקידים של צימוד אלסטי בין מנועים ולבדוק כיצד הסנכרון משפיע על התנועתיות8,24. לאחרונה, מבנים כדוריים משמשים כדי לקבל תובנה כיצד אילוצים גיאומטריים על כריכת מנוע המנוע להשפיע על הדינמיקה של תנועתיות25.
בפרוטוקול זה, אנו מציעים צעדים ספציפיים עבור ניסויים אנסמבל על מארז מקוטע עם קשיחות משתנה. אתרי איגוד במארז מכונים לעיתים "ידיות", בעוד רצפי DNA משלימים הקושרים ידיות אלה נקראים "antihandles". מספר המנועים במארז האלה נקבע באמצעות אילו מקטעים מכילים סיכות אחיזה מורחבות עם משלימה את הטיפול במנועים באמצעות מנועי התווית האוליגו. שימוש ברצפי אחיזה שונים במקטעים שונים מאפשר כריכה של סוגים שונים של מנועים למיקומים ספציפיים במארז. המארז המפורט כאן מורכב מ -7 מקטעים קשיחים רציפים, כל אחד מהם מורכב מ-12 סוגי דנ א כפולים שאורגנו ב -2 טבעות קונצנטריים8. החלקים נוקשה מכילים את ידיות מנוע מחוברים באמצעות אזורים שיכולים להיות גמישים אחד תקוע בודד או דנ א נוקשה כפול, בהתאם היעדרות או נוכחות, בהתאמה, של "מקשר" סיכות. הציות למבנה המארז נקבע על ידי הימצאות או העדר הסיכות הללו. ראה דוחות קודמים לפרטים נוספים ורצפי DNA ספציפיים8. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטות מרובות לטיהור מארז26. הקצב-מעבר הדרגתי צנטריפוגה שיטה27 מתואר כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמיחה, ביטוי וקציר של חלבונים מוטוריים נשלט על ידי יזם המושרה גלקטוז
- באמצעות שמרים-peptone-דקסטרוז (YPD) לוחית התרבות והמקל סטרילי מנווים, רצף הרצוי שמרים קפואים זן ו דגירה של 3-4 ימים ב 30 ° c.
- היום הראשון של התפתחות התרבות: בשעות אחר הצהריים, הוסיפו 10 מ ל של מדיית תרבות YP עם 2% מדקסטרוז לצינור הזכוכית בקוטר 1, והוא משמש כמושבה אחת מהצלחת. גדל בתוף הרים מסתובב במהירות 30 ° c בלילה.
- יום 2: באחר הצהריים, להעביר את 10 mL של התרבות לבקבוקון 250 mL המכיל 50 mL של מדיית תרבות YP עם 2% רפפיז. דגירה הלילה ב 30 ° צ' בעוד רועד ב 250 סל ד על שייקר מסלולית.
- יום 3: בשעות אחר הצהריים, העבירו את 60 mL של התרבות לבקבוקון של 3 ליטר המכיל 1 ליטר של מדיית תרבות בעלת 2% גלקטוז. דגירה הלילה ב 30 ° צ' בעוד רועד ב 250 סל ד על שייקר מסלולית.
- יום 4: החל באמצע הבוקר, נטר את הדחיסות האופטית (OD) של התרבות ב-600 ננומטר כל 2 h. כאשר התרבות היא בין OD 1.5 ו-2, המשך בשלבים הבאים כדי לקצור את התאים. איסוף מחוץ לטווח OD זה עשוי להפחית את התשואה עקב ספירות תאים נמוכות לפני OD 1.5, או השקט הסלולרי והשפלה בחלבון מעל OD 2.
- Decant את התרבות התא לתוך בקבוקי צנטריפוגה ספין ב ~ 6200 x g ב 4 ° c עבור 8 דקות. שופכים את supernatant ולהשליך.
- להשעות מחדש את הגלולה תא בבקבוק עם מזוקקים כפול2o (ddh2o).
- סובב את התאים ב-~ 6200 x g ב -4 ° צ' עבור 8 דקות. שופכים את הסופרנטאנט וזורקים.
- בהתאם לצמיגות של הגלולה תא, להוסיף עד 2 מ ל של ddH2O כדי ליצור מספיק נוזל הפתרון עבור ליטוף.
- באמצעות בקר ממונע מוטורי מצויד בפיפטה 10 מ ל, באיטיות לוותר על משקה התא לתוך חנקן נוזלי טיפה אחת בכל פעם. זה יהיה לייצר כדורי קפוא של תאים שמרים.
- אחסן את התאים הקפואים ב-80 ° צ' עד מוכן לטיהור.
2. טיהור חלבונים מוטוריים מתאי שמרים
- פירוק תאים והפקת חלבון מסיסים
- הכינו 1 מ ל של פתרון טרי של 0.1 M PMSF באתנול טהור. המתן להוספת ה-PMSF למאגרים מימית כאשר הוא אינו יציב במים; גם, להימנע מחשיפה למים עד בתוך 20 דקות (מחצית חיים משוער של PMSF במים) של שימוש.
- להכין 50 mL של מאגר הליזה 4x על הקרח עם תוספי מניות 5x של מאגר לפירוק, אבל לא להוסיף PMSF עד ממש לפני המאגר מוחל על הגלולה שמרים.
- לטחון את החנקן נוזלי-כדורי שמרים קפואים לתוך אבקה עדינה עם מטחנת הקפה סוג להב כי כבר טרום מקורר עם חנקן נוזלי.
הערה: זה החילוץ חלבון בדרך כלל מתחיל עם הגלולה תא שנקטפו 2 L של תרבות שמרים. הכמות ההתחלתית של תרבות שמרים ניתן לכוונן למעלה או למטה עם כוונונים הקשורים לכרכים של חרוזים IgG ו-DNA oligos בשלבים 2.2.2 ו 2.3.1 להלן. - מחבר 15 מ ל של מאגר הליזה 4x עם DTT ו-Mg-ATP על הקרח ולהוסיף PMSF למאגר כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מ"מ, השלמת הכנת מאגר הליזה 4x עם תוספי מזון.
- לאסוף את אבקת שמרים לתוך מקורר לפני מצוננים משקה זכוכית מ100 mL על הקרח. הוסף נפח קטן של מאגר הליזה 4x עם תוספי מזון לאבקה כדי שהריכוז הסופי של המאגר לא יעלה על 1x. בדרך כלל, להוסיף ~ 1.5 mL של המאגר עבור כל 10 mL של אבקת שמרים.
- הפשרת במהירות את האבקה לשלב הנוזלי על-ידי הצבת הגביע באמבט מים ב37 ° c עם ערבוב מתמיד באמצעות מרית.
- מניחים את הגביע של ליפוסט בחזרה על הקרח מיד לאחר התאגף, להעריך את נפח ליפוסט באמצעות צינור 50 mL, ולהוסיף יותר מאגר הליזה 4x עם תוספי מזון כך הריכוז הסופי של המאגר הוא ~ 1x. בדרך כלל, 2 L של תרבות שמרים תשואות סך של 25-35 mL של ליפוסט המכיל מאגר פירוק 1x.
- מפיץ באופן שווה את הליפוסט. לבקבוקי צנטריפוגה על קרח בזהירות לאזן את הבקבוקים להבדל המוני לא יותר מ 0.01 g בין כל זוג, להבטיח כי כל בקבוק הוא מעל הנפח המינימלי הנדרש כדי למנוע קריסת בקבוק. צנטריפוגה ב ~ 290,000 x g עבור 25 דקות ב 4 ° c.
- לאסוף את supernatant המכיל חלבונים מסיסים בצינור 50 mL בקרח, ולהשליך את הגלולה המכילה פסולת תא ואורגלים גדולים. הימנע מאיסוף חלקים מעוננים של סופרנטאנט, מאחר שהם יכולים לסתום את העמודה של זרימת הכבידה המשמשת בשלבים הבאים. שמור 10 μL של סופרנטנט עבור ניתוח SDS-PAGE.
- לטיהור אהדה של IgG
- במהלך הספין לעיל, הגדר טור כרומטוגרפיה של זרימת הכבידה על קרח או בחדר קר.
- העבר 200 μL של 50% IgG אהדה חרוז לתוך העמודה באמצעות P-1000 מתקן הפיפטה לחתוך עם להב תער כדי להגדיל את קוטר יציאת הכניסה שלו. אם טיהור יותר או פחות מ 2 L של הגלולה תרבות התא, להתאים את עוצמת הקול של חרוז באופן פרופורציונלי, עם נפח מינימלי של 100 μL.
- מחלקים עוד 15 מ ל של מאגר הליזה 4x עם DTT ו-Mg-ATP ולהוסיף PMSF למאגר כדי להשיג ריכוז סופי של 2mM. לדלל את מאגר 4x על הקרח כדי 1x על ידי הוספת ddH2O.
- לשטוף את החרוזים 2x עם 5 מ ל של מאגר הליזה 1x עם תוספי מזון.
- השהה מחדש את החרוזים ב-200 μL של מאגר הליזה 1x עם תוספי מזון.
- הוסף את ההשעיה חרוז לחלץ חלבון שהתקבל מ צנטריפוגה ו-מודטה את התערובת ב 4 ° צ' עבור 1 h עם סיבוב עדין.
- במהלך הדגירה, להכין 25 מ ל של מאגר לשטוף (מתכון מפורט בטבלה 1) על קרח ו 50 mL של מאגר ה-1X tev (מתכון מפורט בטבלה 1) על הקרח.
- לאחר הדגירה 1 h, לסנן את התערובת ליפוסט-חרוז על הקרח או בחדר הקר באמצעות אותה עמודה כרומטוגרפיה בשימוש בשלב 2.2.2 לעיל. שמור 10 μL של הזרימה-through עבור ניתוח SDS-PAGE.
- שטפו את החרוזים הנותרים בעלי מנוע על קרח 2x עם 5 מ ל של מאגר כביסה. שמור 10 μL של השטיפה הראשונה עבור ניתוח SDS-PAGE.
- לשטוף את החרוזים על הקרח פעם עם 5 מ ל של מאגר TEV 1x. אפשר למאגר להיות מרוקן לגמרי מהעמודה.
- מדבקת דנ א עם מחשוף מגנטי
- הסר את עמודת הכרומטוגרפיה מההתקנה וכבה את תחתית העמודה. בתוך אותה עמודה, מארג המנוע-חרוזים עם 100 μL של מאגר הכולל TEV של 1x המכיל 10-20 μM של BG מטוהרים-oligo בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10-15 דקות. אם טיהור יותר או פחות מ-2 ליטר של תרבות התא, כוונן את עוצמת הקול של מאגר ה-TEV של 1x ומטוהר ב-BG-oligos באופן פרופורציונלי. להגדיל את זמן הדגירה על פי הוראות היצרן אם יש צורך להגדיל את התשואה ואת הקצב של תיוג מנוע, אבל להיות מודע לכך הדגירה זמן רב עשוי גם להגדיל את הפרופורציה של מנועים לקוי בשל הדנטורציה חלבון ב RT.
- השהה מחדש בעדינות את החרוזים בכל דקה של הדגירה.
- לשטוף את שכותרתו מנוע-חרוזים 4x עם 4 מ ל של מאגר TEV 1x באמצעות אותו טור כרומטוגרפיה וההתקנה כמו לפני. אפשר לשטיפה הסופית לנקז לגמרי מהעמודה.
- Cap התחתון של העמודה, להשהות מחדש את המנוע-מחרוזות ב לא יותר מ-200 μL של מאגר ה-1x TEV, ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה 2 mL בתחתית עגולה.
- מארג ההשעיה עם ~ 0.3 יחידות של פרוטאז TEV לכל μL של תערובת חרוז מנוע ב 16 ° צ' עבור 1 h עם סיבובים עדינים. הצינור צריך להיות מותקן כדי למזער את שטח המשטח הכולל של הצינור שבו החרוזים באים במגע.
- צנטריפוגה את הצינור במיקרוצנטריפוגה ב 21,130 x g עבור 30 s בחדר קר לרכז את התערובת בתחתית הצינור.
- עדיין בחדר הקר, להשתמש לגזור P-1000 לקצץ בטיפ כדי להעביר את התערובת לטור ספין צנטריפוגה ב 21,130 x g עבור 30 s. לאסוף את פילטרט המכיל את tev-ביקע, מוטורס מטוהרים. פרוטאז tev יהיה בתוך פילטרט, כמו גם את המנועים.
- שמור 10 μl של הפילטרט עבור ניתוח sds-PAGE. מחלק את הפילטרט הנותרים בכרכים של 2 μl עבור ניסויים tirf או 50 μl עבור טיהור של אהדה מיקרוטוכדורית. הקפאת מבזקי הזיכרון בחנקן נוזלי ובחנות ב-80 ° c.
- השהה מחדש את החרוזים שנותרו במסנן במאגר של 1x TEV עבור ניתוח של SDS-PAGE. השתמש באותו כונן מאגר של 1x TEV כמו בשלב 2.3.4 לעיל.
3. מיקרוטוכדורית (MT) פולימוניזציה
-
הכנת תערובות טובולין עבור tirf בחני
- בחדר קר, לפזר בנפרד את הטובולין ליאופוליום של כל סוג (טובולין שור מסומן, טובולין biotinylated, וטובולין פלורסנט) במאגר מחדש (מתכון מפורט בטבלה 2) כדי לבצע ריכוז סופי של 10 מ"ג/mL. . בואו נשב על קרח במשך 10 דקות
- מערבבים את הרכיבים הבאים ומאפשרים לשבת על קרח במשך 10 דקות בחדר הקר (ריכוזי הסופי מצוינים בתוך האכסדרה): 18 μL של טובולין שור (~ 8.2 mg/mL), 2 μL של biotinylated טובולין (~ 0.9 mg/mL), ו-2 μL של טובולין פלורסנט (~ 0.9 mg/mL)
- הכינו 3 μL של התערובת הטובולין והקפא הבזק בחנקן נוזלי. אחסן את התערובות ב-80 ° c.
- בחדר קר, לפזר בנפרד את הטובולין ליאופוליום של כל סוג (טובולין שור מסומן, טובולין biotinylated, וטובולין פלורסנט) במאגר מחדש (מתכון מפורט בטבלה 2) כדי לבצע ריכוז סופי של 10 מ"ג/mL. . בואו נשב על קרח במשך 10 דקות
-
הכנת טובולין לטיהור אהדה של הר מנועים
- בחדר קר, התמוססות טובולין השור החדש במאגר החוקה כדי לבצע ריכוז סופי של 10 מ"ג/mL. . בואו נשב על קרח במשך 10 דקות
- הכינו 3 μL של התערובת הטובולין והקפא הבזק בחנקן נוזלי. אחסן את התערובות ב-80 ° c.
-
פולימוניזציה של הטובולין לתוך MTs
- הסר 3 μl סדרת מחלקים של טובולין מ-80 מקפיא ° c ובמהירות מאוד ובקצרה להפשיר את השלב הנוזלי על ידי החזקת החלק התחתון של הצינור. מקום מיידי על הקרח והדגירה עבור לפחות 3 דקות.
- שכבה בעדינות 3 μL של מיקס 2x פלמור (מתכון מפורט בטבלה 2) על גבי הפתרון הטובולין. מערבבים על ידי בעדינות מצליף בצינור, אבל לא לערבב על ידי ליטוף, כמו כוחות הטיה עלול לשבש את התגרשות MT והתארכות.
- מודקון את התערובת באמבט מים ב 37 ° c עבור 30 דקות.
- שכבה בעדינות 6 μL של RT 1x BRB80 עם תוספי מזון (מתכון המפורטים בטבלה 2) על גבי ולערבב על ידי מצליף. אין לערבב באמצעות ליטוף.
- מודאת התערובת ב 37 ° c לפחות 10 דקות.
- להמשיך לטיהור האהדה MT, או אם ביצוע TIRF assays, דגירה MTs בחושך ב-RT לילה כדי ליצור יותר MTs.
- חנות פולימהות MTs במשך שבועות בחושך על RT.
4. מיקרוטוכדורית (MT) הזיקה לטיהור
-
הסרת טובולים בלתי-פלגניים על ידי צנטריפוגה
- מערבבים את המרכיבים הבאים כדי לעשות 60% גליצרול כרית: 1x BRB80 (ללא תוספי מזון; מתכון מפורט 2), 20 Μm מטקנול (מומס dmso), 1 מ"מ dtt, ו 60% גליצרול.
- העבר 60 μL של כרית גליצרול לצינור ultracentrifuge. שכבה בעדינות 12 μL של ה-MTs הבלתי מסומן בעבר על גבי הכרית. כדי למנוע הטיה של MTs, להעביר אותם באמצעות קצה הצנרת חתך.
- צנטריפוגה את התערובת ב ~ 97,300 x g ב 22 ° צ' עבור 15 דקות. לאחר הספין, הטוטליות העודפות נשארות בשכבה הנוזלית העליונה, בעוד ה-MTs מהווים את הגלולה בתחתית. סמן את הקצה החיצוני של הצינור לפני ספין כדי לעזור לאתר את הגלולה, כמו הגלולה לא יכול להיות גלוי עם עין בלתי.
- הסר בזהירות את השכבה הנוזלית (~ 12 μL) מעל כרית הגליצרול ושמור 10 μL עבור ניתוח של SDS-PAGE.
- לשטוף בעדינות את הממשק בין שכבת הנוזל כרית עם 20 μL של 1x BRB80 עם תוספי מזון. להסיר ולמחוק את 20 μL שטיפה.
- הסר בזהירות את כרית גליצרול (~ 60 μL) ושמור 10 μL עבור ניתוח של עמוד SDS. להיזהר לא להפריע את הגלולה MT.
- לשטוף בעדינות את הגלולה עם 60 μL של 1x BRB80 עם תוספי מזון (מתכון המפורטים בטבלה 2). להיזהר לא להפריע את הגלולה MT. התעלם מפתרון השטיפה.
- להשעות מחדש את הגלולה MT ב 24 μL של מאגר לפירוק בתוספת (מתכון מפורט בטבלה 3) באמצעות טיפ פיפטה חתוך.
-
טיהור של מנועים פונקציונליים על ידי כרומטוגרפיה של זיקה מבוססת MT
- הסר 2 50 μL מנועים של מנועי מטוהרים מ שמרים מ-80C מקפיא ובמהירות להפשיר את השלב הנוזלי. . מקום מיידי על קרח
- הוסיפו את המרכיבים הבאים לצינור ultracentrifuge חדש בסדר המצוין והוא מתווה את התערובת ב-RT עבור 10 דקות: (1) 100 μl של המנועים מטוהרים משמרים, (2) 29 μl של מיקס 5x ATP/טקסול (מתכון המפורט בטבלה 3), אז (3) 12 μl של מערבל מ . עם טיפ של פיפטה חתוך
- צנטריפוגה את התערובת ב ~ 97,300 x g ו 22 ° צ' עבור 15 דקות. לאחר הספין, המנועים הפונקציונליים נשארים בסופרנטנט, ו-MTs יוצרים גלולה, יחד עם המנועים הלא-פונקציונליים הקשורים אליהם.
- לאסוף את סופרנטאנט, להקפיא פלאש ב 2 μL ali, ולאחסן ב-80 ° c.
- שמור 10 μL של סופרנטנט עבור ניתוח SDS-PAGE. השהה מחדש את הגלולה ב-141 μL של 1x BRB80 לניתוח SDS-עמוד. השתמש בתקני חלבון, כגון actin, כדי ליצור עיקול סטנדרטי לכמת את הריכוז של מנועים מטוהרים כפי שמפורט קודם לכן17.
- השתמש במידע ריכוז זה כאשר אתה מעלה מנועים למארז בשלב 6.1.3.
5. ייצור מארז מקוטע של DNA אוריגמי
-
היווצרות מארז
- הזמנת המרכיב העיקרי של oligונומטר ברשימה שפורסמו בעבר טבלאות8 ב 96 לוחות היטב רטוב ב 250 μm במאגר tris, או יבש ולאחר מכן להשעות אותם 250 μm עם מאגר טריס.
- צור מאגר של סיכות ליבה על-ידי ערבוב 5 μL של כל סיכת ליבה (ראה טבלה S1 בדרילר-קולאנג'לו 20168).
- צור מאגר של סיכות מקשר על-ידי ערבוב 5 μL של כל אחד מהסיכות של מקשר (ראה טבלת הידוק המקשר בדרילר-קולאנג'לו 20168).
- צור מאגר של סיכות האיגוד fluorophore על ידי ערבוב 5 μL של כל מסיכת הידית fluorophore (ראה שולחן האחיזה fluorophore השולחן בדרילר-Colangelo 20168).
- מערבבים 50 μL תגובות מתקפלות עם הרכיבים הבאים: מאגר קיפול 1x; 100 ננומטר 8064 לגרדום; 600 בריכת הידוק ליבה nM; 600 בריכה בעלת הידוק פלואורואופפור של nM; 9 μM fluorophore סטרנד (ראה fluorophore שולחן אנטי לטפל ב Driller-Colangelo 20168); עבור כל אתר מחייב מנוע, או 4.2 μM קווצות ידית מורחבת או 600 גדילי nM ללא ידיות כרצונך (ראה מנוע ידית/הידוק השולחן סיכות ב Driller-Colangelo 20168); 600 nM כרצונכם8; נוספים 6 מ"מ MgCl2; ומים.
- מקפלים בתוך הציקלורית תרמית באמצעות התוכנית הבאה: חימום מהיר 80 ° c, קירור בהפרשים בודדים בדרגה אחת ל 65 ° c מעל 75 דקות, לאחר מכן קירור נוסף בהפרשים בודדים בדרגה אחת עד 30 ° c מעל 17.5 h.
- שיטת מתקפלים איכות על 2% agarose ג'ל במאגר 0.5 x TBE (ראה טבלה 4 עבור מתכון) שיושלם עם 11 מ"מ MgCl2 ו-DNA ג'ל כתם (ראה שולחן חומרים). ג'ל לרוץ ב 0.5 x TBE מאגר בתוספת עם 11 מ"מ MgCl2 ב 70 V עבור 60-90 דקות. הפעל ג'לים באמבט מים קרח או בחדר קר כדי למנוע חימום מופרז ולאחר הדנטורציה של מבני מארז.
- התמונה ג'ל באמצעות תנאים מתאים הכתם ג'ל DNA המשמש בשלב 5.1.7.
-
טיהור מארזים
- בשעות אחר הצהריים המאוחרות יום לפני הטיהור, ליצור מעברי גליצרול על ידי שכבות בעדינות 80 μL כל אחד 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, ו 15% גליצרול ב 1x מאגר קיפול אוריגמי בצינור צנטריפוגה (ראה שולחן 4 למתכון). הגבולות בין השכבות צריכים להיות מעט גלויים לעין.
- מעברי צבע ב-4 ° c בלילה.
- למחרת בבוקר, להוסיף 45% גליצרול ב 1 x אוריגמי מאגר קיפול לפתרון המארז המקופל לריכוז סופי של 10% גליצרול. מערבבים בעדינות ושכבה בחלק העליון של מעבר הצבע בשפופרת הצנטריפוגה.
- סובב את מעבר הצבע עם המארז ב-243,000 x g עבור 130 דקות ב-4 ° c.
- לאסוף 50 μL שברים מהצינור בראש לכיוון התחתון.
- להטיל 2% agarose ג'ל ב 0.5 x TBE מאגר בתוספת עם 11 מ"מ MgCl2 ו-DNA ג'ל כתם.
- טען 5 μL של כל שבר על ג'ל ולהפעיל ג'ל במאגר 0.5 x TBE בתוספת עם 11 מ"מ MgCl2 עבור 90-120 דקות ב 70 V. להפעיל ג'לים באמבט מים קרח או בחדר קר כדי למנוע חימום מופרז ולאחר הדנטורציה של מבני מארז.
- התמונה ג'ל באמצעות תנאים מתאים הכתם ג'ל DNA המשמש בשלב 5.2.6.
- בחר שברים לניסויים עתידיים המוצגים מבנים monomeric מקופלים היטב ללא הידוק משולבים.
- ריכוזי כימות של שברים נבחרים באמצעות שיטות ספקטרוסקופיות מתאימות, כגון קליטת UV ב 260 ננומטר. השתמש במידע ריכוז זה כאשר אתה מעלה מנועים למארז בשלב 6.1.3.
6. הפיכת חדרי שיטת שקופיות
- הפוך את תא המיקום של השקופיות על-ידי הדבקה של שתי רצועות של קלטת כפולה לשקופית זכוכית והצבת שמיכות למעלה. החדר הוא החלל הצר הדחוס בין המגלשה למגלמת הזכוכית, מוקף בשני רצועות הנייר. איור 1 ממחיש את חדר השיטת הדעת.
- בעת הכנת השקופית עם פתרונות, השתמש בפיפטה כדי להזרים כל נוזל לתוך החדר מצד אחד, ולהשתמש ברצועה של נייר סינון כדי לאסוף את זרימת הנוזלים בצד השני.
7. מוטורי-אנסמבל תנועתיות שיטת TIRF
- בניינים של מנועים למארז דנ א
- על הקרח, להכין טריים 1 mL כל אחד DTT-בתוספת BRB80, מאגר לפירוק שיושלם, ו קזאין-טקרול בתוספת מאגר לפירוק (מתכונים המפורטים בטבלה 5). העבר 200 μL של כל מאגר לשפופרת RT.
- עדיין על הקרח, להשתמש במאגר הקור לפירוק של קזאין-טקרול שיושלם כדי להכין את האנרגיה 4x ו-4x תערובות הזבל (מתכונים המפורטים בטבלה 5).
- דגירה 10 μL של ~ 300 nM מנועים מטוהרים עם 5 μL של ~ 10 ננומטר מארז DNA על קרח עבור 15-30 דקות. ריכוזי אלה של מנועים הוכחו להרוות את המארז ' מנוע מחייב אתרים לזמן הדגירה הזה.
הערה: תפוסה מוטורית אינה 100%, כנראה עקב הידוק הסיכות החסרות במארז במבנים בעלי מארז בודד8,28. - במהלך הדגירה, לדלל את biotin-ו fluorophore מתויג MTs 100x עם מאגר לפירוק הכולל מעגל RT, ולהכין שרף ג'ל סינון מתאים כרומטוגרפיה הדרה בגודל עמודה על ידי ביצוע ההליך המתואר להלן.
- הסרת מנועים עודפים מתוך מארז מעלה מעלה לפי גודל כרומטוגרפיה עמודה הדרה
- ב שפופרת חרוט 50 mL, לשטוף 5 מ ל של שרף ג'ל סינון 2x עם 45 mL של ddH2O. עבור כל כביסה, לערבב את שרף עם מים בצינור חרוט, ולסובב את התערובת ב 460 x g עבור 1 דקות. להיפטר supernatant ולשמור את שרף.
- לשטוף את שרף 2x עם 45 mL של מאגר הליזה 1x (מתכון מפורט בטבלה 5) באמצעות אותה שיטה שתוארה לעיל.
- להשעות מחדש את שרף שטוף במאגר הליזה 1x ביחס 1:1, כך שרף הופך ~ 50% במאגר. שרף שטף ניתן לאחסן ב 4 ° c לפחות 1 חודש.
- העבר 800 μL של שרף הבולם לטור ספין. לנקז את מאגר עודף על ידי כוח הכבידה עבור 5 דקות. הסר את כל המאגר הנותר עם ספין 2 ב 1,000 x g. הנפח שרף הסופי צריך להיות סביב 350-400 μL.
- לדלל את המנוע-מארז לערבב עם מאגר לפירוק קזאין-טקרול בתוספת לנפח הסופי של 50 μL. העברת תערובת מדולל לטור ספין ארוז עם שרף.
- צנטריפוגה את עמודת הספין ב 1,000 x g עבור 6 s (הפעם הוא כולל את ההאצה ואת זמן ההאטה). לאסוף את המנוע הטהור מארז השערים על ידי שמירת פילטרט ולמחוק את העמודה אשר שומרת על מנועים עודפים.
- הכנת שקופיות להדמיה
- תזרים 13 μL של 1 מ"ג/mL סרום ביולוגי (biotin-BSA) לתוך תא שקופית. דגירה עבור 2 דקות כדי לאפשר קשירה של BSA לזכוכית.
- לשטוף את חדר 2x עם 20 μL של RT DTT-בתוספת BRB80 על ידי הזרמת במאגר בצד אחד של החדר ומכה את הנוזל עודף הרחק בצד השני באמצעות רצועה של נייר סינון.
- זרימת 20 μL של 0.5 mg/mL streptavidin. דגירה עבור 2 דקות כדי לאפשר קשירה של streptavidin לביוטין על BSA.
- שטוף את חדר 2x עם 20 μL של מאגר הפירוק של ה-RT בתוספת.
- בעדינות לזרום 20 μL של MTs מדולל עם טיפ חיתוך הצנרת. דגירה עבור 2 דקות כדי לאפשר כריכה בין ביוטין על MTs ו streptavidin.
- שטוף 2x עם 20 μL של מאגר הליזה לקזאין-מטקסול. דגירה של 2 דקות כדי לאפשר לקזאין לחלחל את כל החדר.
- לדלל את המנוע הטהור-מארז מעלה מעלה 5x כדי 10x לתנאים בעלי מולקולה בודדת (~ 10-100 pM) עם מאגר לפירוק הקרה של קזאין-מטקרול בתוספת. מערבבים יחד את המרכיבים הבאים כדי לייצר מנוע הסופי תערובת המארז: 10 μL של המנוע, דילול מארז, 5 μL של מיקס אנרגיה 4x, ו 5 μL של ערבוב של 4x.
- הזרמת 20 μL של המארז הסופי-מארז התערובת לחדר השיקופיות של הבחינה ולהמשיך למיקרוסקופ TIRF.
- הדמיה ורכישת נתונים
- צלם את השקופית מיד עם מיקרוסקופ TIRF. בדרך כלל, כל שקופית נותרת שמיש עבור בין 30 ו 60 דקות.
- השג תמונת סטילס בערוץ MT וסרט בערוץ המארז. עבור מנועים בפרוטוקול זה, 10 דקות סרטים עם קצב מסגרת של 0.5 fps וזמן חשיפה של 200 ms מתאימים.
- מתוך הסרט המארז, צור kymograph אחד עבור כל MT ב-ImageJ או בתוכנת עיבוד תמונה דומה29. בואו לנתח את המהירויות ולהריץ את ההרכבים המוטוריים על ידי מדידת המדרונות והמרחקים האופקיים של הריצות על kymograph30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מנועי ג'ל הינם מוצלחים מאוד של מנועים ומבני מארז. Sds-ניתוח עמוד אישר את החילוץ המוצלח של דינאין שמרים (איור 2), כמו פילטרט הסופי שנאסף בשלב 2.3.7 הראה להקה ברורה, חדה במיקום של ~ 350 kda. כצפוי, להקה זו היה נעדר מן הפרח דרך ולשטוף כי הסירו חלבונים לא רצויים, ואת החרוזים שמהם דינאין היתה ביקתה. התצפית מצביעה על כך שטיהור האהדה הigg ומחשוף הפרוטאז TEV היו יעילים מאוד. בנוסף, פרוטאז tev היה גם הקיים פילטרט הסופי ויצרו להקה ברורה ב ~ 50 kda.
המוצלח של האהדה MT של דינאין ו קינזין חלבונים היתה גם אושרה עם sds-ניתוח עמוד (איור 3). בעוד דינאין הופיע כמו להקה אחת ברורה ב ~ 350 kda, קינסין הופיע כמו קצת מורח להקות מרובות ב ~ 120 kda, אולי בשל נוכחותם של צורות זרחנות ו deזרחנות של חלבון14 ותשואות משתנה אוליגו-תוויות. השוואה בין דינאין ו קינזין להקות לפני ואחרי זה טיהור אהדה של הר חשף ירידה בריכוז המנוע, כפי שצוין על ידי ירידה בעוצמת הלהקה, אשר סביר להניח בשל הסרת מנועים שאינם פונקציונליים. למרות ההפחתה, ריכוזי המנועים שנשמרו היו מספיקים עבור האפקטיביות של TIRF assays. בנוסף פרוטאז TEV, כמות ניכרת של טובולין (~ 51 kDa) היה נוכח supernatant הסופי, קרוב לוודאי בשל הפירוק הדרגתי של MTs במהלך הניסוי, או הסרה לא שלמה של עודף טובולין באמצעות צנטריפוגה. עם זאת, תנועתיות עקבית של הרכבים מארז הרכב המוצג tirf בחני מציע כי טובולין ו-tev פרוטאז לא להפריע פונקציות המנוע (ראה איור 6).
קיפול של דנ א אוריגמי מבנים היתה היאגדה על ידי אגנה ג'ל אלקטרופורזה. איור 4 מתאר את התוצאות של ג'ל המנתח את הקיפול של מארז גמיש מקוטע עם 2 אתרי קשירה מוטוריים. התזוזה בניידות בין ה, ליין (שביל 1) והתגובה המתקפלים (ליין 2) מצביעה על קיפול אוריגמי. בנוסף, התגובה המתקפלים במשעול 2 מצביעה על נוכחות של מבנים מארזים. מולטימטיזציה מתרחשת בדרך כלל, ודורש טיהור לאחר מכן של מבנים monomeric היטב. גם הסיכות העודפות הבלתי משולבות היו גלויות, ומציגות רמה גבוהה של ניידות דרך הג.
תגובות אוריגמי מקופל היו מטוהרים כדי להסיר את הסיכות העודפים לא משולבים מולעוני של מבנה המארז. איור 5 מראה את התוצאות של טיהור מעבר גליצרול של מארז גמיש עם 7 אתרי כריכה מוטוריים. השברים המוקדמים מתאימים לצפיפות הגליצרול הנמוכה בחלק העליון של הצינור. . הם מכילים את הסיכות העודפות השברים המאוחרים מקבילים לצפיפויות הגליצרול הגבוהות בתחתית הצינורית ומכילות מולעוני ואגרגטים של מבנים מקופלים. בג זה, שבר 7 מציין שבר מתאים המכיל מארז monomeric מקופל היטב. שימו לב כי המבנה המקופל היטב מבודד משני הסיכות העודפות ומהטיימרים. בעוד ג'ל זה הוא נציג, שבר 7 לעתים קרובות מכיל מארז שמיש, כל ניסוי טיהור תשואות תוצאות שונות מעט שברים צריך תמיד להיות מיועד כדי לקבוע איזה שבר הוא הטוב ביותר עבור תנועתיות assays.
תנועתיות של הרכבים מארז הרכב ניתן לזיהוי בקלות ומדידה על kymographs שנוצרו מסרטי TIRF. למשל, kymographs (איור 6) של מארז גמיש מצוערים לשבעה דינאין חלבונים ("7d" הרכבים) להראות מאוד מעבד מסלולים במהירויות עקביות יחסית, הוכחת כי ההרכבים היו פעילים ומורצפת ב מערכת מחדש, ולאחר שטיהור אהדה של MT הסיר בהצלחה את רוב העמותות הבלתי-תפקודיות, העלולות להאט או לעכב את ההרכבים. הניסוי tirf אותו בוצע בהצלחה על סוגי מארז אחרים עם תאימות שונים מספרים מוטוריים כדי לחשוף את ההשפעות של גורמים אלה בצוות דינאין8,9.
איור 1: סכימטי של תא השקופית. המסווה יושב על שני רצועות. של קלטת דו צדדית הפתרונות מפיצים בצד אחד, ומופקים בנייר מסנן על השני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: sds-ניתוח העמוד של טיהור של דינאין משמרים. תאים שמרים היו לcentrifuged לאסוף את הליפוסט (ליין 1) המכיל חלבונים מסיסים כולל. הזיקה בין igg על חרוזים עמודה תג ZZ על המבנה רקומביננטי דינאין ניצל עבור טיהור זה. הזרימה (ליין 2) נאספה מתערובת הליפוסט והחרוזים לאחר שעברה דרך טור כרומטוגרפיה. החרוזים הקשורים לדינבלין נשטפו עם מאגרים, והשטיפה הראשונה עם מאגר הכביסה (ליין 3) נאספה. Dynein היתה אז מצומדת ל-DNA oligo. לאחר מחשוף פרוטאז tev, צנטריפוגה בטור ספין הפריד את פילטרט המכיל דינאין (ליין 4) ואת החרוזים שיורית (ליין 5). כל הדגימות שנאספו מהטיהור הועברו עם מאגר לדוגמה של הנציג 1x ו-1x סוכן הפחתת, ו נטען על 4-12% Bis-Tris ג'ל. ג'ל הופעל ב מאגר מגבים 1 x ב 200 V עבור ~ 1 h, ו מוכתם עם מוכתם SYPRO אדום ג'ל כתם לדימות תחת אור UV. בעיקר, הלהקה ברורה, חדה ב ~ 350 kda במשעול 4 מציין את הנוכחות של דינאין מרוכז מטוהרים ב filtrate הסופי, בעוד הלהקה בבית ~ 50 kda באותו נתיב מציין את נוכחות שותף של פרוטאז tev. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: sds-ניתוח עמודים של טיהור האהדה MT של דינאין פונקציונלי ו קינסין חלבונים. קינסין ו דינאין מטוהרים שמרים (מסלולים 1 ו 3) היו מעורבים עם הפלאנטים MTs ו-ATP, ובוצע להפריד את המנועים תפקודית ב-supernatants (נתיבים 2 ו 4) מן המנועים הלא פונקציונלי כי שיתוף עם MTs. דגימות מנוע לפני ואחרי טיהור היו מ, עם 1x מאגר לדוגמה ה, 1 x הפחתת הסוכן, ו נטען על 4-12% Bis-Tris ג'ל. ג'ל הופעל ב מאגר מגבים 1 x ב 200 V עבור ~ 1 h, ו מוכתם עם מוכתם SYPRO אדום ג'ל כתם לדימות תחת אור UV. האינטנסיביות של להקות המנוע (~ 120 kDa עבור kinesin, ו ~ 350 kDa עבור dynein) הופיע לירידה לאחר האהדה הזיקה MT, המציין ירידה בריכוזים מוטוריים. ריכוזים ניכרת של טובולין ו-TEV פרוטאז היו נוכח דגימות לאחר טיהור מוטוריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הניתוח של Agarose ג'ל של מבנה ה-DNA אוריגמי מקופל. מבנים DNA אוריגמי מקופל מוערך על ידי ג'ל אלקטרופורזה. ליין 1 הוא שהפיגום הטהור שפרש בזמן שליין 2 הוא תוצר של תגובת הקיפול. ג'ל הופעל ב 70 V באמבט מים הקרח עבור 90 דקות ב 0.5 x TBE מאגר בתוספת עם 11 מ"מ MgCl2. שינוי בניידות מצביע על קיפול אוריגמי. מהדקים ומארזים לא משולבים נראו גם במשעול 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הניתוח של Agarose ג'ל לטיהור מעבר גליצרול של מארז אוריגמי. האיכות של טיהור הדרגתי הגליצרול יכול להיקבע על ידי אלקטרופורזה ג'ל של שברים מן המעבר צנטריפוגה. שברים מספר נמוך הם מן החלק העליון של הצינור ולהתאים צפיפות נמוכה של גליצרול. שברים ממוספרים גבוה הם מהחלק התחתון של הצינור ולהתאים צפיפויות גבוהות של גליצרול. הסיכות העודפות, המארז monomeric והמארז המולטימאריק גלויים לעין. שבר 7 מכיל מארז המתאים למיקרוסקופיה TIRF כפי שהם monomeric ו הסיכות העודפים נעדרים. ג'ל הופעל ב 70 V באמבט מים הקרח עבור 120 דקות ב 0.5 x TBE מאגר בתוספת עם 11 מ"מ MgCl2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: Kymographs מראה את התנועתיות של dynein-מארז הרכבים על MTs יחיד. חלבונים dynein שחולצו משמרים ומטוהרים עם MTs היו מצוערות למבנים גמישים מארז. לכל מארז היו שבעה אתרים מחייבים עבור דינאין ויצרו הרכב "7d". התנועה של ההרכבים האלה ב MTs נרשמה בסרט 10 דקות (200 ms חשיפה, 0.5 fps) במהלך שיטת TIRF. Kymographs מ 2 MTs נוצרו מתוך הסרט הזה ב ImageJ על ידי מעקב לאורך MT אחד. הפסים האדומים האנכיים והאופקיים בפינה השמאלית העליונה של כל תמונה מציינים 2 דקות ו-20 μm, בהתאמה. כל קו מואר מתעד את התנועה של הרכב אחד, עם ההופכי של השיפוע המציין את המהירות ואת התזוזה האופקית המציינת את אורך הריצה. עם tirf בחני ו kymography, תנועתיות של מנוע מארז הרכבים הופך בקלות לזיהוי ומדידה ישירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם המאגר | רכב | שלב (s) שימוש | תגובה |
| מאגר הליזה 5x | 150 מ"מ הופס (pH 7.4) | - | המסנן מעקר את המאגר. זה יכול להיות מאוחסן ב RT במיכל אטום כראוי במשך שנה. |
| 250 מילימטר KAcetate | |||
| 10 ממ אצטט | |||
| 5 מ"מ EGTA (pH 7.5) | |||
| 50% גליצרול | |||
| מאגר לליזה 4x עם תוספי מזון | מאגר הליזה 4 x | 2.1-2.2 | הפוך מאגר 4x זה ממאגר הליזה 5x שלעיל. הכן מאגר ללא PMSF תחילה, והוסף את התרכובת (מומסים באתנול טהור) לנורית קטנה של המאגר בדיוק לפני כל שלב המצריך זאת. |
| 4 מ"מ DTT | |||
| 0.4 מ ג-ATP | |||
| 2 מ"מ PMSF | |||
| שטוף מאגר | מאגר לליזה 1x עם תוספי מזון | 2.2 | כדי להפוך את המאגר, להוסיף KCl, טריטון X-100, ו ddH2O למאגר הפירוק של 4x עם dtt ו-MG-ATP, אך לא להוסיף PMSF לימין לפני השימוש. |
| 250 ממ י | |||
| 0.1% טריטון X-100 | |||
| מאגר של TEV 5x | 50 mM טריס-HCl (pH 8.0) | - | המסנן מעקר את המאגר. זה יכול להיות מאוחסן ב RT במיכל אטום כראוי במשך שנה. |
| 150 ממ י | |||
| 10% גליצרול | |||
| מאגר בגודל 1 x TEV | מאגר בגודל 1 x TEV | 2.2-2.3 | כדי להפוך את המאגר, להוסיף DTT, Mg-ATP, טריטון X-100 ו-ddH2O למאגר ה-tev של מלאי 5x, אך לא להוסיף PMSF לימין לפני השימוש. |
| 1 ממ ט | |||
| 0.1 מ ג-ATP | |||
| 0.1% טריטון X-100 | |||
| 0.5 מ"מ-PMSF | |||
טבלה 1: מאגרים לטיהור אהדה IgG של חלבונים מוטוריים מתאי שמרים (פרוטוקול סעיף 2).
| שם המאגר | רכב | שלב (s) שימוש | תגובה |
| 5x BRB80 | 400 מ ל צינורות | - | המסנן מעקר את המאגר. זה יכול להיות מאוחסן ב RT במיכל אטום כראוי במשך שנה. |
| 10 מ"מ MgCl2 | |||
| 5 מילימטר EGTA | |||
| להתאים את ה-pH ל 6.8 עם קו | |||
| 1x BRB80 עם תוספי מזון | 1x BRB80 | 3.3 & 4.1-4.2 | חייב להיות טרי עשוי מניות 5x BRB80 עבור כל ניסוי. |
| 20 מיקרומטר μM (מומס ב DMSO) | |||
| 1 ממ ט | |||
| 2x פלפור מיקס | 2x BRB80 (ללא תוספי מזון) | 3.3 | פלאש להקפיא את התערובת ב ali, קטנים ולאחסן ב-80 oC. |
| 2 מילימטר DTT | |||
| 2 מ ג-GTP | |||
| 20% DMSO | |||
| מאגר החוקה החוזרת | 1x BRB80 (ללא תוספי מזון) | 3.1 | חייב להיות טרי עבור כל ניסוי. |
| 1 ממ ט | |||
| 1 מ ג-GTP | |||
שולחן 2: מאגרי הפילמור של microtubules (פרוטוקול סעיף 3).
| שם המאגר | רכב | שלב (s) שימוש | תגובה |
| מאגר לליזה בתוספת טקסול | מאגר הליזה 1 x | 4.1 | חייב להיות טרי עבור כל טיהור. |
| 20 מיקרומטר μM (מומס ב DMSO) | |||
| 1 ממ ט | |||
| מיקס לטקיול 5x ATP | מאגר הליזה 1 x | 4.2 | חייב להיות טרי עבור כל טיהור. |
| 25 ממ ג-ATP | |||
| 50 μM טקסול (מומס ב-DMSO) | |||
| 5 מילימטר DTT | |||
שולחן 3: מאגרים לטיהור מיקרוכדורית של חלבונים מוטוריים פונקציונליים (פרוטוקול סעיף 4).
| שם המאגר | רכב | שלב (s) שימוש | תגובה |
| 20x אוריגמי מאגר קיפול | 100 mM טריס pH 8.0 | - | ניתן לאחסן ב-RT במיכל אטום כראוי עבור עד שנה. |
| 20 מילימטר EDTA | |||
| 200 מ"מ ממ2 | |||
| 1x אוריגמי מאגר קיפול | 5 mM טריס pH 8.0 | 5.1-5.2 | להפוך את המאגר טרי על ידי דילול מלאי 20x עם ddH2O לפני כל ניסוי. |
| 1 מילימטר EDTA | |||
| 10 מ"מ MgCl2 | |||
| 0.5 x TBE | 45 ממ ' 8.0 | 5.1-5.2 | ניתן לאחסן ב-RT במיכל אטום כראוי עבור עד שנה. |
| 45 מ"מ חומצה בוראית | |||
| 1 מילימטר EDTA | |||
טבלה 4: מאגרים לייצור מארז מקוטע של אוריגמי (פרוטוקול סעיף 5).
| שם המאגר | רכב | שלב (s) שימוש | תגובה |
| DTT-בתוספת BRB80 | 1x BRB80 | 7.3 | חייב להיות טרי לפני כל ניסוי TIRF. |
| 1 ממ ט | |||
| מאגר לליזה בתוספת טקסול | מאגר הליזה 1 x | 7.1 & 7.3 | חייב להיות טרי לפני כל ניסוי TIRF. |
| 20 מיקרומטר μM (מומס ב DMSO) | |||
| 1 ממ ט | |||
| מאגר לוליזיס של קזאין-טקרול | מאגר הליזה 1 x | 7.1-7.3 | חייב להיות טרי לפני כל ניסוי TIRF. |
| 20 מיקרומטר μM (מומס ב DMSO) | |||
| 1 ממ ט | |||
| ~ 2.5 מ"ג/ml קזאין (הומס ב טריס-HCl ב-pH 8.0) | |||
| מאגר הליזה 1 x | 30 מ"מ HEPES (pH 7.4) | 7.2 | הפוך מאגר זה טרי על ידי דילול מלאי 5x (מתכון מפורט בטבלה 1) עם ddH2O. |
| 50 מילימטר KAcetate | |||
| 2 ממ אצטט | |||
| 1 מ"מ EGTA (pH 7.5) | |||
| 10% גליצרול | |||
| 4x מיקס אנרגיה | 22.5 μL 1 x קזאין-טקרול-מאגר לליזה מנופה | 7.3 | חייב להיות טרי מתוצרת לפני כל ניסוי TIRF; אמצעי אחסון שצוינו הם עבור אמצעי אחסון סופי של 25 μL. |
| 1 μL 0.1 M מ"ג-ATP | |||
| 1 μL 40% גלוקוז | |||
| 0.5 μL β-מרקפיטואתנול | |||
| 4x מערבבים זבל | 24 μL 1x מאגר לוליזיס של קזאין | 7.3 | חייב להיות טרי מתוצרת לפני כל ניסוי TIRF; אמצעי אחסון שצוינו הם עבור אמצעי אחסון סופי של 25 μL. |
| 1 μL 1x מערכת מזבל חמצן | |||
טבלה 5: מאגרים ותערובות לתנועתיות הרכב-מנוע (פרוטוקול סעיף 7). פרטים על מערכת החמצן במערכת השתמשו כדי להפוך את שילוב הנבלות ניתן למצוא במקום אחר17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקות הבנייה המולקולרית של אוריגמי DNA לספק דרך ייחודית כדי לבנות הרכבים מוטוריים עם ארכיטקטורות מוגדרות, מספרים מוטוריים, וסוגים, המאפשר מחקרים של איך מתהווה התנהגות נובעת תצורות מוטוריות ספציפיות31. ככל שמחקרים מבניים וסלולריים ממשיכים להבהיר דוגמאות של מנועי ציטושלד העובדים בצוותים, טכניקות לבידוד ולחקירת מנגנוני הביופיסיים והביוכימיים של מנועים בהרכבים הגדלים בכלי השירות. לדוגמה, ה-קריו-EM הראה כי הדיניטין יכול לאגד 2 מנועי dynactin בודדים, וכי זיווגים כאלה יש תנועתיות שונה מאשר מנועים בודדים10. בנוסף, בנייה מבוססת DNA שימש כדי לקבוע אם היונקים dynein, כאשר מופעל על ידי דיינטין ו bicD2, יכול להתאים את הכוח של קינסין-1 ב משיכת מלחמה של תרחיש14. במחקר מעורב אחר-מנוע, אוריגמי DNA שימש לזיווג את ההשפעות של מנועי קוטביות מנוגדים ואת החלבונים קשירה הרגולציה שלהם על ידי מרחב להפריד אותם על מבנה אוריגמי15. ככל שגורמים מבניים ורגולטורים יותר של תנועתיות נמצאים, DNA-אוריגמי טכניקות מבוססות צריך להוכיח שימושי בקביעת התורמים הביוכימיים והביופיסיים הספציפיים לתנועתיות של הרכבים מוטוריים. שיטות הבנייה המולקולריות הזמינות על-ידי origami אוריגמי הן שימושיות במיוחד בגלל התוצאות הפנומנולוגית של הרכבים קשה לנבא. הדבר נובע בחלקו לגורמים הרבים התורמים לתנועתיות המנועים הבודדים בתוך האנסמבל5,6,31.
דוגמאות של המבנים הקודמים שלנו כוללים מוטות מונוליטיים ומוטות מקוטע עם קשיחות משתנה. מאמצים נוכחיים לחקור מבנים כדוריים כמו גם25. אחרים המועסקים מורפולוגיות כגון מבנים מישורי ומוטות22,24. כמו כן, באמצעות ידיות מוטוריות עם רצפי DNA אורתוגונאליות, סוגים שונים של מנועים יכול להיות מאוגד לאותו מבנה מארז7,14,15,18. גישה זו מאפשרת מחקרים של הפעולות הנגדיות של הדינונים והקיניגיות, המינוס והפלוס-קצה מכוונים, ומינוס-ובנוסף בוים מיועשים. הוא גם מאפשר את המבוא של מוטציה בין הרכבים פראיים, המאפשרים את התורמים הביוכימיים הספציפיים לתנועתיות הדרך לפענח7. בגלל היכולת לאגד fluorophores מרובים לכל מבנה בודד, הדמיה TIRF וניתוח הבאים על ידי kymography או מעקב חלקיקים אפשרי. דיווחים קודמים מציגים ניתוח של נתוני קימוגרפיה והערכה סטטיסטית של מבני מארז עם תאימות משתנה של8. בעוד מנועים ציטושלד הוכיחו להיות יישום מרגש מוקדם של שימוש ב-DNA אוריגמי כמו לוח לחם מולקולרי32, חלבונים אחרים מערכות חלבונים ייהנו גם משיטות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים ל-K. Chau, ג. מורגן ו-א. דרילר-קולאנג'לו לתרום לטכניקות של המארז המקוטע של ה-DNA אוריגמי. כמו כן, אנו מודים לחברים לשעבר במעבדות "Reck-פיטרסון" ו-"שי" לדיונים מועילים ותרומות להתפתחות המקורית של טכניקות אלה. אנו מודים ל-J. Wopereis ומרכז סמית קולג ' למיקרוסקופיה והדמיה ומרכז מכללת סמית ' לביולוגיה מולקולרית. אנו מכירים בהכרת הNSF MRI לרכישת מיקרוסקופ TIRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
| Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
| Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
| Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
| P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProTev Protease | Promega | V6101 | |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
| Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
| SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
| Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
- Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
- Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
- McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
- Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
- Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
- Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
- Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
- Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
- Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
- Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
- Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
- Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
- Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
- Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
- Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
- Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, Humana Press. New York, NY. (2014).
- Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
- Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
- Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
- Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
- Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
- Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , 2nd Edition, Stanford Publishing. (2019).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
