Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

Summary

L’objectif de ce protocole est de former des ensembles de moteurs moléculaires sur les nanostructures d’origami d’ADN et d’observer la motilité d’ensemble en utilisant la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion.

Abstract

Les moteurs cytosquelettiques sont responsables d’une grande variété de fonctions dans les cellules eucaryotes, y compris la mitose, le transport de marchandises, la motilité cellulaire, et d’autres. Bon nombre de ces fonctions exigent que les moteurs fonctionnent en ensembles. Malgré une riche connaissance des mécanismes des moteurs cytosquelettiques individuels, on en sait relativement moins sur les mécanismes et les comportements émergents des ensembles moteurs, dont des exemples incluent des changements dans la processivité et la vitesse d’ensemble avec changement de numéro, d’emplacement et de configuration du moteur. La nanotechnologie de l’ADN structurel, et la technique spécifique de l’origami d’ADN, permet la construction moléculaire d’architectures bien définies d’ensembles moteurs. La forme des structures de chargement ainsi que le type, le nombre et le placement des moteurs sur la structure peuvent tous être contrôlés. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour produire ces ensembles et les observer à l’aide de la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion. Bien que ces techniques aient été spécifiquement appliquées pour les moteurs cytosquelettiques, les méthodes sont généralisables à d’autres protéines qui s’assemblent dans des complexes pour accomplir leurs tâches. Dans l’ensemble, la méthode de l’origami d’ADN pour créer des ensembles bien définis de protéines motrices fournit un outil puissant pour disséquer les mécanismes qui mènent à un comportement motile émergent.

Introduction

La dyneine et la kinésie sont des protéines motrices cytosquelettiques responsables d’une myriade de fonctions dans les cellules eucaryotes¹. En convertissant l’énergie chimique de l’hydrolyse ATP en travail productif, ces moteurs se translocalisent sur des microtubules pour transporter et distribuer diverses cargaisons intracellulaires. Ils coordonnent également dans les réarrangements intracellulaires massifs liés à la mitose, où ils montrent des forces orchestrées qui contribuent au positionnement et à la séparation des chromosomes. Les essais structurels, biochimiques et biophysiques, y compris les observations d’une seule molécule, ont révélé les mécanismes de ces moteurs au niveau individuel (bien examinés dans les travaux précédents^2,3,4). Cependant, beaucoup de tâches des moteurs exigent qu’ils travaillent dans de petits ensembles de types de moteurs similaires et mixtes. Comparativement moins est compris sur les mécanismes qui coordonnent l’activité et la motilité émergente ultime de ces ensembles^5,6. Cette lacune de connaissances est due, en partie, à la difficulté de créer des ensembles avec des caractéristiques contrôlables, telles que le type de moteur et le numéro de copie. Au cours de la dernière décennie, les techniques de construction moléculaire de l’origami d’ADN ont été employées pour résoudre ce problème. Pour les moteurs à base de microtubules, quelques exemples de ces études incluent des observations de molécules uniques d’ensembles de dyneine cytoplasmique-1^7,8,9, dynein intraflagellar¹¹, divers moteurs kinesin^12,13, et des mélanges de dyneins et kinesins^7,14,15. Ici, nous fournissons des détails de la purification et l’étiquetage oligonucléotide des moteurs de levure^{7,16,17,18,19,20}, le le pliage et la purification de l’origami d’ADN segmenté avec la conformité réglable^8,et l’imagerie des moteurs de levure propulsant les structures de châssis^7,18.

La construction d’ensembles moteurs pour l’observation in vitro d’une seule molécule nécessite trois efforts primaires. La première est l’expression, la purification et l’étiquetage des constructions motrices adaptées à l’attachement à l’origami d’ADN. La seconde est la production et la purification de structures d’origami d’ADN définies (souvent appelées « châssis »). Et le troisième est la conjugaison des moteurs à la structure du châssis suivie d’une observation à l’aide d’une microscopie interne totale par fluorescence de réflexion (TIRF). Ici, nous fournissons des protocoles établis pour ce processus pour les moteurs recombinants à base de microtubule purifiés à partir de la levure Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18, 19}. Des ensembles moteurs à base d’origami d’ADN ont été étudiés à l’aide de la kinésie recombinante¹⁵ et de la dyneine^7,8,18 constructions produites dans ce système d’expression de levure^{16 ,17,18,19}. Ce protocole est valable pour ces constructions, étant donné qu’elles sont contrôlées par le promoteur induit par le galactose, et fusionnées aux mêmes étiquettes protéiques pour la purification (lien de protéase ZZ et TEV) et pour la conjugaison d’oligo d’ADN (SNAPtag).

Des souches de levure spécifiques produisent des constructions motrices spécifiques. Par exemple, la dyneine utilisée pour étudier le rôle de la conformité au fret a été purifiée à partir de la souche RPY1084^7,8. En général, les souches contenant des constructions motrices avec les modifications génétiques appropriées pour l’expression et la purification peuvent être demandées aux laboratoires ayant publié l’utilisation de ces moteurs. Les constructions avec de nouveaux attributs tels que des mutations ou des étiquettes peuvent être faites en utilisant des techniques génétiques recombinantes, telles que la transformation de l’acétate de lithium²¹ et des kits commerciaux. Des protocoles détaillés pour la création de protéines motrices modifiées dans la levure pour des études sur une seule molécule ont été publiés¹⁹. En plus des moteurs fusionnés au SNAPtag, les oligos utilisés pour étiqueter les moteurs doivent être conjugués au substrat SNAP, benzylguanine (BG); protocoles précédemment publiés décrivent la formation et la purification des conjugués BG-oligo¹⁸. La stratégie globale décrite ici a également été utilisée pour les moteurs à base d’actine (voir les travaux précédents pour des exemples^22,23,24), et les moteurs purifiés à partir d’autres organismes et systèmes d’expression (voir les précédents travaux pour des exemples^{7,9,10,11,12,13,14}).

Les microtubules polymérisés (MT) sont utilisés dans ces expériences dans deux procédures différentes. La purification d’affinité de MT des moteurs fonctionnels exige des MT qui ne sont pas étiquetés avec d’autres groupes fonctionnels, alors que l’analyse de motilité de motilité de moteur DEF exige des MTs étiquetés avec la biotine et les fluorophores. Dans tous les cas, les TM sont stabilisés avec le taxol pour prévenir la dénaturation. L’étape de purification d’affinité MT est utilisée pour enlever tous les moteurs non-motiles avec une forte affinité MT, car ces moteurs peuvent modifier la motilité d’ensemble si conjugué à un châssis. Pendant ce processus, les moteurs actifs délient les MT et restent en solution, tandis que les moteurs serrés se déversent dans le granule MT. Cela permet de s’assurer que tous les moteurs sur le châssis sont d’une population active.

Une variété de structures d’origami d’ADN ont été employées pour étudier des ensembles cytosquelettiques de moteur. Au fur et à mesure que la compréhension mécaniste du transport d’ensemble s’est accrue, les structures d’origami d’ADN utilisées dans les expériences se sont développées en complexité. En principe, toute structure pourrait être adaptée à cette fin à condition qu’elle soit modifiée pour inclure des sites d’attachement à l’ADN à brin unique pour les moteurs et les fluorophores. Des conceptions et des attributs spécifiques de châssis peuvent être utiles pour sonder des questions particulières sur le comportement émergent des ensembles de moteurs. Par exemple, des tiges rigides ont été utilisées pour développer des connaissances de base sur la façon dont le numéro de copie affecte le transport par des équipes de dyneins et de kinésies^7,15,18, et des plates-formes 2D ont été utilisées pour étudier l’ensemble de myosine navigation des réseaux d’actine²². Des structures à la flexibilité variable ou réglable ont été utilisées pour comprendre les rôles du couplage élastique entre les moteurs et pour sonder comment la synchronisation des pas affecte la motilité^8,24. Plus récemment, des structures sphériques sont utilisées pour mieux comprendre comment les contraintes géométriques de la liaison de la voie motrice affectent la dynamique de la motilité²⁵.

Dans ce protocole, nous proposons des étapes spécifiques pour des expériences d’ensemble sur châssis segmenté avec rigidité variable. Les sites de liaison sur le châssis sont parfois appelés « poignées », tandis que les séquences d’ADN complémentaires qui lient ces poignées sont appelées « antihandles ». Le nombre de moteurs sur ces châssis est déterminé par les segments qui contiennent des agrafes de poignée étendues avec complémentarité à l’oligo antihandle sur les moteurs liquéfonnés oligo. L’utilisation de différentes séquences de poignée sur différents segments permet de lier différents types de moteurs à des endroits spécifiques sur le châssis. Le châssis détaillé ici est composé de 7 segments rigides séquentiels, chacun composé de 12 hélices d’ADN à double brin disposées en 2 anneaux concentriques⁸. Les segments rigides contiennent les poignées motrices et sont reliés à travers des régions qui peuvent être soit flexibles à l’ADN à brin unique, soit de l’ADN rigide à double brin, selon l’absence ou la présence, respectivement, d’agrafes de « liaison ». La conformité de la structure du châssis est donc déterminée par la présence ou l’absence de ces agrafes “linker”. Voir les rapports précédents pour plus de détails et des séquences d’ADN spécifiques⁸. En outre, plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour purifier châssis²⁶. La méthode de centrifugation de gradient de gradient de glycérol de taux-zonal²⁷ est décrite ici.

Protocol

1. Croissance, expression et récolte des protéines motrices contrôlées par un promoteur induit par le galactose À l’aide d’une plaque de culture à levures-peptone-dextrose (YPD) et d’un bâton inoculation stérile, la strie désirée de la souche de levure congelée et incuber pendant 3-4 jours à 30 oC. Jour 1 de la croissance de la culture: Dans l’après-midi, ajouter 10 ml de médias de culture YP avec 2% dextrose à un tube de culture de verre de 1″ de diamètre et l’inoculer avec une seule …

Representative Results

Les purifications réussies des moteurs et des structures de châssis ont été astoyfées par l’électrophorèse de gel. L’analyse SDS-PAGE a confirmé le succès de l’extraction de la dyneine à partir de levure (Figure 2), car le filtrate final recueilli à l’étape 2.3.7 montrait une bande claire et nette à la position de 350 kDa. Comme prévu, cette bande de dynein eétait absente du débit et du lavage qui enlevaient les protéines indésirables, et le…

Discussion

Les techniques de construction moléculaire de l’origami d’ADN fournissent une manière unique de construire des ensembles de moteur avec des architectures définies, des nombres de moteur, et des types, permettant des études de la façon dont le comportement émergent provient des configurations spécifiques de moteur^31. Alors que les études structurelles et cellulaires continuent d’élucider des exemples de moteurs cytosquelettiques travaillant en équipe, les techniques d’isoler et d’étudier…

Materials

2 mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure	Cytoskeleton.com	T333P-A
Biotin-BSA	Sigma	A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm	Beckman Coulter	356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm	Beckman Coulter	355603
Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL	GE Healthcare	17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty	Bio-Rad	7326204EDU
P8064 Scaffold	Tilibit	2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550
ProTev Protease	Promega	V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser	amazon.com	N/A
Sephacryl S-500 HR	GE Healthcare	17061310
Streptavidin	Thermo Fisher	434302
SYBR Safe DNA stain	Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton.com	T240-B
Tubulin, HiLyte 647	Cytoskeleton.com	TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes	Beckman Coulter	344090