एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य डीएनए origami नैनोस्ट्रक्चर पर आणविक मोटर्स के पहनावा फार्म और कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर पहनावा गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए है।
Abstract
Cytoskeletal मोटर्स यूकैरियोटिक कोशिकाओं में कार्यों की एक विस्तृत विविधता के लिए जिम्मेदार हैं, mitosis सहित, कार्गो परिवहन, सेलुलर गतिशीलता, और दूसरों. इन कार्यों के कई कलाकारों में संचालित करने के लिए मोटर्स की आवश्यकता होती है. व्यक्तिगत cytoskeletal मोटर्स के तंत्र के बारे में ज्ञान का खजाना होने के बावजूद, अपेक्षाकृत कम तंत्र और मोटर पहनावा के आकस्मिक व्यवहार के बारे में जाना जाता है, उदाहरण जिनमें से कलाकारों की प्रक्रिया और वेग के साथ परिवर्तन शामिल हैं मोटर नंबर, स्थान, और कॉन्फ़िगरेशन परिवर्तित करना. संरचनात्मक डीएनए नैनोप्रौद्योगिकी, और डीएनए origami की विशिष्ट तकनीक, मोटर पहनावा की अच्छी तरह से परिभाषित आर्किटेक्चर के आणविक निर्माण में सक्षम बनाता है. कार्गो संरचनाओं के आकार के साथ ही प्रकार, संख्या और संरचना पर मोटर्स की नियुक्ति सभी नियंत्रित किया जा सकता है. यहाँ, हम इन पहनावा के उत्पादन और उन्हें कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर देख के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. हालांकि इन तकनीकों को विशेष रूप से cytoskeletal मोटर्स के लिए लागू किया गया है, तरीकों अन्य प्रोटीन है कि परिसरों में इकट्ठा करने के लिए अपने कार्यों को पूरा करने के लिए generalizable हैं. कुल मिलाकर, मोटर प्रोटीन की अच्छी तरह से परिभाषित पहनावा बनाने के लिए डीएनए origami विधि तंत्र है कि आकस्मिक गतिशील व्यवहार करने के लिए नेतृत्व विच्छेदन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.
Introduction
डाइनिन और किनेसिन साइटोस्केलेटल मोटर प्रोटीन हैं जो यूकैरियोटिक कोशिकाओं1में असंख्य कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं। एटीपी हाइड्रोलिसिस की रासायनिक ऊर्जा को उत्पादक कार्य में परिवर्तित करके, ये मोटरें माइक्रोट्यूब्यूल पर विभिन्न इंट्रासेल्यूलर कार्गो को ढोने और वितरित करने के लिए परिवर्तित करती हैं। वे मिटोसिस से जुड़े बड़े पैमाने पर इंट्रासेल्यूलर पुनर्व्यवस्थाओं में भी समन्वय करते हैं, जहां वे आर्केस्ट्रा बलों का प्रदर्शन करते हैं जो गुणसूत्रों की स्थिति और पृथक्करण में योगदान देते हैं। संरचनात्मक, जैव रासायनिक, और जैवभौतिक परख, एकल अणु टिप्पणियों सहित, व्यक्तिगत स्तर पर इन मोटर्स के तंत्र से पता चला है (अच्छी तरह से पिछले काम में समीक्षाकी 2,3,4). हालांकि, मोटर्स के कार्यों के कई उन्हें दोनों समान और मिश्रित मोटर प्रकार के छोटे emblies में काम करने की आवश्यकता है. तुलनात्मक रूप से कम तंत्र के बारे में समझा जाता है जो इन समूहों की गतिविधि और अंतिम आकस्मिक गतिशीलता5,6का समन्वय करते हैं . इस ज्ञान के अंतर के कारण है, भाग में, इस तरह के मोटर प्रकार और प्रतिलिपि संख्या के रूप में नियंत्रणीय सुविधाओं के साथ पहनावा बनाने में कठिनाई के लिए. पिछले एक दशक में, डीएनए origami के आणविक निर्माण तकनीक इस समस्या को हल करने के लिए नियोजित किया गया है. माइक्रोट्युबल आधारित मोटर्स के लिए, इन जांचों के कुछ उदाहरणों में कोशिकाद्रव्यी डाइनिन-17,8,9, इंट्राफ्लैगलेलर डाइनिन11के समूहों के एकल अणु अवलोकन शामिल हैं , विभिन्न किनेसिनमोटरें 12,13, और डाइनिन और किनेसिन7,14,15के मिश्रण . यहाँ, हमखमीर7, 16 ,17,18,19,20, से मोटर्स की शुद्धि और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड लेबलिंग का विवरण प्रदान करते हैं , अलग – अलग डी एन ए ओरिगमी की तह और शुद्धि , जो कि टूनाबल अनुपालन8के साथ , और चेसिस संरचनाओंकोप्रेरित करने वाली खमीर मोटर्स की इमेजिंग 7,18.
इन विट्रो एकल अणु अवलोकन के लिए मोटर पहनावा का निर्माण तीन प्राथमिक प्रयासों की आवश्यकता है. पहला अभिव्यक्ति, शुद्धि और डीएनए origami के लिए संलग्न करने के लिए उपयुक्त मोटर constructs की लेबलिंग है. दूसरा उत्पादन और परिभाषित डीएनए origami संरचनाओं की शुद्धि है (अक्सर कहा जाता है “चेसिस”). और तीसरे चेसिस संरचना के लिए मोटर्स के संयोजन कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट (TIRF) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अवलोकन के बाद है. यहाँ, हम पुनः संयोजक microtubule-आधारित मोटर्स खमीर Saccharomyces सेरेविसीसे शुद्ध के लिए इस प्रक्रिया के लिए स्थापित प्रोटोकॉल प्रदानकरतेहैं 7,16,17,18, 19. डीएनए origami आधारित मोटर पहनावा दोनों रिकॉमबिनेंट kinesin15 और डाइनिसिन7,8,18 इस खमीर अभिव्यक्ति प्रणाली 16 में उत्पादित निर्माण का उपयोग कर जांच की गई है ,17,18,19. इस प्रोटोकॉल इन constructs के लिए मान्य है, यह देखते हुए कि वे galactose प्रेरित प्रमोटर द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं, और शुद्धि के लिए एक ही प्रोटीन टैग करने के लिए जुड़े (जेड और TEV protease linker) और डीएनए ओलिगो संयोजन (SNAPtag) के लिए.
विशिष्ट खमीर उपभेदों विशिष्ट मोटर निर्माण का उत्पादन. उदाहरण के लिए, कार्गो अनुपालन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्रयुक्त डाइनिन को विकृति RPY10847,8से शुद्ध किया गया था। सामान्य में, अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए उपयुक्त आनुवंशिक संशोधनों के साथ मोटर constructs युक्त उपभेदों उन मोटर्स के उपयोग प्रकाशित होने प्रयोगशालाओं से अनुरोध किया जा सकता है. ऐसे उत्परिवर्तनों या टैग के रूप में उपन्यास विशेषताओं के साथ निर्माण पुनः संयोजक आनुवंशिक तकनीक का उपयोग किया जा सकता है, जैसे लिथियम एसीटेट परिवर्तन21 और वाणिज्यिक किट. एकल अणु अध्ययन के लिए खमीर में संशोधित मोटर प्रोटीन बनाने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गएहैं 19. मोटर्स SNAPtag करने के लिए जुड़े जा रहा है के अलावा, मोटर्स लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया oligos SNAP सब्सट्रेट करने के लिए संयुग्मी होना चाहिए, benzylguanine (बीजी); पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल बीजी-ओलिगो संयुग्मी18के गठन और शुद्धि का वर्णन करते हैं। यहाँ वर्णित समग्र रणनीति भी actin आधारित मोटर्स के लिए नियोजित किया गया है (उदाहरण के लिए पिछले काम करता है देखें22,23,24), और मोटर्स अन्य जीवों और अभिव्यक्ति प्रणालियों से शुद्ध (पिछले देखें उदाहरण के लिए कामकरता है 7,9,10,11,12,13,14.
दो अलग-अलग प्रक्रियाओं में इन प्रयोगों में पॉलिमरीकृत माइक्रोट्युबल्स (एमटी) का उपयोग किया जाता है। कार्यात्मक मोटर्स के मीट्रिक टन आत्मीयता शुद्धि MTs कि अन्य कार्यात्मक समूहों के साथ लेबल नहीं कर रहे हैं की आवश्यकता है, जबकि मोटर-एंबल गतिशीलता TIRF परख biotin और fluorophores के साथ लेबल एमटी की आवश्यकता है. सभी मामलों में, MTs विकृतीकरण को रोकने के लिए taxol के साथ स्थिर कर रहे हैं. मीट्रिक टन आत्मीयता शुद्धि कदम एक उच्च मीट्रिक टन आत्मीयता के साथ किसी भी गैर गतिशील मोटर्स को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में इन मोटर्स पहनावा गतिशीलता बदल सकते हैं अगर एक चेसिस के लिए संयुग्मी. इस प्रक्रिया के दौरान, सक्रिय मोटर्स एमटी को अनबिन करें और समाधान में बने रहें, जबकि तंग-बाध्यकारी मोटर्स एमटी गोली में स्पिन करते हैं। यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि चेसिस पर सभी मोटर्स एक सक्रिय आबादी से हैं।
डीएनए origami संरचनाओं की एक किस्म साइटोस्केलेटल मोटर पहनावा का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. के रूप में पहनावा परिवहन की मशीनी समझ में वृद्धि हुई है, डीएनए origami संरचनाओं प्रयोगों में कार्यरत जटिलता में वृद्धि हुई है. सिद्धांत रूप में, किसी भी संरचना इस उद्देश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है बशर्ते कि यह मोटर्स और फ्लोरोफोर्स के लिए एकल-प्रवाहित डीएनए लगाव साइटों को शामिल करने के लिए संशोधित किया गया है। विशिष्ट चेसिस डिजाइन और गुण मोटर्स पहनावा के आकस्मिक व्यवहार के बारे में विशेष सवालों की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है. उदाहरण के लिए, कठोर छड़ का उपयोग इस बात का मूलभूत ज्ञान विकसित करने के लिए किया गया है कि डाइनिन और काइनेसिनकीटीमों द्वारा परिवहन को किस प्रकार प्रभावित करता है,15,18, और 2D प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग मायोसिन पहनावा का अध्ययन करने के लिए किया गया है actin नेटवर्क के नेविगेशन22| चर या टूबल लचीलेपन वाली संरचनाओं का उपयोग मोटर्स के बीच लोचदार युग्मन कीभूमिकाओं को समझने और यह जांचने के लिए किया गया है कि कैसे कदम तुल्यकालन गतिशीलता को प्रभावित करता है8 ,24. हाल ही में, गोलाकार संरचनाओं का उपयोग इस बात की जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जा रहा है कि मोटर ट्रैक बाइंडिंग के ज्यामितीय बाधाओं से गतिशीलता की गतिशीलता25को कैसे प्रभावित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम चर कठोरता के साथ खंडित चेसिस पर कलाकारों की टुकड़ी प्रयोगों के लिए विशिष्ट कदम प्रदान करते हैं। चेसिस पर बाइंडिंग साइटों को कभी-कभी “हैंडल” के रूप में संदर्भित किया जाता है, जबकि पूरक डीएनए अनुक्रम जो इन हैंडल को बांधते हैं, उन्हें “एंटीहैंडल्स” कहा जाता है। इन चेसिस पर मोटर्स की संख्या निर्धारित किया जाता है जिसके द्वारा खंडों oligo लेबल मोटर्स पर antihandle ओलिगो के लिए पूरकता के साथ विस्तारित संभाल स्टेपल होते हैं. विभिन्न क्षेत्रों पर अलग अलग संभाल दृश्यों का उपयोग कर चेसिस पर विशिष्ट स्थानों के लिए मोटर्स के विभिन्न प्रकार के बंधन के लिए अनुमति देता है. यहाँ विस्तृत चेसिस 7 अनुक्रमिक कठोर खंडों से बना है, प्रत्येक 12 डबल-स्लेंड डीएनए helices 2 गाढ़ा छल्ले8में व्यवस्था की शामिल है। कठोर क्षेत्रों मोटर संभालती होते हैं और या तो लचीला एकल फैला डीएनए या कठोर डबल-स्ट्रेंड डीएनए हो सकता है कि क्षेत्रों के माध्यम से जुड़े हुए हैं, अनुपस्थिति या उपस्थिति के आधार पर, क्रमशः, “लिंकर” स्टेपल. चेसिस संरचना का अनुपालन इस प्रकार उपस्थिति या इन “लिंकर” स्टेपल की अनुपस्थिति द्वारा निर्धारित किया जाता है। अधिक जानकारी और विशिष्ट डीएनए दृश्यों8के लिए पिछली रिपोर्ट देखें. इसके अलावा, कई तरीकों चेसिस26को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दर-जोनल ग्लिसरोल ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन विधि27 का वर्णन यहाँ किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए origami के आणविक निर्माण तकनीक परिभाषित आर्किटेक्चर, मोटर संख्या, और प्रकार के साथ मोटर पहनावा का निर्माण करने के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करते हैं, कैसे आकस्मिक व्यवहार विशिष्ट मोटर विन्यास3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम खंडित डीएनए origami चेसिस की तकनीक में योगदान के लिए के चौधरी, जे मॉर्गन, और ए ड्रिलर-कोलेगो धन्यवाद. हम भी इन तकनीकों के मूल विकास के लिए सहायक विचार विमर्श और योगदान के लिए Reck-Peterson और Shih प्रयोगशालाओं के पूर्व सदस्यों को धन्यवाद. हम जे Wopereis और माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग और एल Bierwert और आणविक जीव विज्ञान के लिए स्मिथ कॉलेज केंद्र के लिए स्मिथ कॉलेज केंद्र धन्यवाद. हम आभारी एक TIRF माइक्रोस्कोप के अधिग्रहण के लिए NSF एमआरआई कार्यक्रम स्वीकार करते हैं.
Materials
| 2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
| Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
| Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
| Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
| P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProTev Protease | Promega | V6101 | |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
| Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
| SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
| Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
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