Summary

Måling af fagocytose af Aspergillus fumigatus Conidia af humane leukocytter ved hjælp af strømnings cytometri

Published: December 07, 2019
doi:

Summary

Denne protokol giver en hurtig og pålidelig metode til kvantitativt at måle fagocytose af Aspergillus fumigatus conidia af humane primære fagocytter ved hjælp af flow cytometri og at diskriminere fagocytose af conidia fra simpel vedhæftning til leukocytter.

Abstract

Invasiv lungebetændelse af formen Aspergillus fumigatus udgør en stor trussel mod immunkompromitterede patienter. Inhalerede svampe nåle (sporer) udskilles fra den menneskelige lunge alveolerne ved at være fagocytoseret af medfødte monocytter og/eller neutrofiler. Denne protokol giver en hurtig og pålidelig måling af fagocytose ved flow cytometri ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-mærket conidia for Co-inkubation med humane leukocytter og efterfølgende kontra farvning med et anti-FITC antistof til at tillade diskrimination af internaliseret og celle-overbærende conidia. Store fordele ved denne protokol er dens rapidness, muligheden for at kombinere analysen med cytometrisk analyse af andre celle markører af interesse, den samtidige analyse af monocytter og neutrofiler fra en enkelt prøve og dens anvendelighed til andre celle vægbærende svampe eller bakterier. Bestemmelse af procentdele af fagocytoserende leukocytter giver et middel til mikrobiologer til vurdering af virulens af et patogen eller til sammenligning af patogener og mutanter samt til immunologer til undersøgelse af human leukocyt kapaciteter til bekæmpelse af patogener.

Introduction

Invasiv pulmonal aspergillose er en stor trussel mod immunkompromitterede patienter, da behandlingsmulighederne er begrænsede og kun lykkes ved tidlig diagnose, hvilket fører til høje dødelighedsrater1. Infektiøse agenser er conidia (sporer) af formen Aspergillus fumigatus , der er allestedsnærværende til de fleste levesteder2. Conidia inhaleres, passere gennem luftvejene og kan endelig komme ind i lunge alveolerne. Hos immunkompetente mennesker, disse conidia er ryddet af medfødte immunceller såsom monocytter eller makrofager og neutrofile granulocytter, som tager op (fagocytose) og fordøje patogener3. Fagocytose er vigtigt for mikrobiologer og immunologer ligeledes når interesserede i vært-patogen interaktioner. Konfrontationsassays, såsom Co-inkubation af leukocytter og conidia, omfatter ofte mærkning af sporer ved fluorescein eller dets afledte fluorescein isothiocyanat (FITC). Ved hjælp af et mikroskop er det ligetil at identificere internaliseret fluorescerende conidia og til at bestemme fastsiddende/klædelig conidia, selv om denne fremgangsmåde er tung og realistisk begrænset til et par hundrede celler4. Men i flow cytometri, som let giver mulighed for analyse af hundredtusinder af celler inden for minutter, er differentiel farvning af fagocytoseret og vedliggende conidia afgørende. Derfor er mange protokoller afhængige af trypan Blue til at slukke FITC-fluorescens fra vedsiddende conidia5,6,7,8. En anden fremgangsmåde er at udnytte fluorescens resonans energioverførsel af ethidium bromid og FITC til at udsende rødt i stedet for grøn fluorescens fra vedsiddende conidia9,10,11. Hvis specifikke antistoffer er tilgængelige, som det er tilfældet for nogle bakterier, celle bundne partikler kan være direkte plettet12,13.

Her præsenterer vi en protokol til hurtigt og kvantitativt vurdere fagocytose af FITC-mærket a. fumigatus conidia af humane leukocytter sammen med fastgørelse af sporer til celler og manglende interaktion ved at ansætte en allophycocyanin (APC)-koblede anti-FITC-antistof. Metoden giver også mulighed for samtidig flow cytometrisk analyse af yderligere celle markører, der kan anvendes til separat analyse af fagocytose af monocytter og neutrofiler fra samme prøve.

Protokollen kan anvendes til karakterisering af svampe stammer (f. eks. flere arter af Aspergillus og andre forme fra slægten mucorales præsenteret her) og deres mutanter14 og immunologisk forskning på phagocytter, såsom leukocytter fra immunkompromitterede individer.

Protocol

Denne protokol omfatter brugen af humane Buffy frakker opnået fra Institut for transfusion Medicine, Jena Universitets Hospital og frisk veneblod fra patienter, både efter skriftlig informeret samtykke fra donorer i overensstemmelse med etiske komité godkendelse 4357-03/15. 1. klargøring af Aspergillus fumigatus conidia Grow A. fumigatus på 1,5% malt agar Petri skåle i 5 dage ved 37 °C uden Co2.Forsigtig: a. fumigatus …

Representative Results

Ved måling af fagocytose af A. fumigatus conidia af humane fagocytiske celler, forskelsbehandling mellem ægte internalisering og blotte fastgørelse af conidia til cellerne er en hindring, især når det kommer til high-gennemløb metoder såsom flow cytometry. For at overvinde denne forhindring, præsenterer vi en hurtig og pålidelig protokol baseret på farvning af conidia med fluorescerende farvestof FITC før Co-inkubation af celler og conidia, efterfulgt af en kontra farvning med et APC-mærket anti-FITC…

Discussion

Denne protokol præsenterer en hurtig flow cytometrisk metode til at måle interaktion af a. fumigatus conidia med et stort antal primære humane leukocytter, der ikke er muligt i almindelige mikroskopiske protokoller. Imaging celler med et mikroskop og manuelt tælle internaliseret conidia er besværligt og kan realistisk set gøres for et par hundrede celler kun. Flowcytometri overvinder dette problem ved at måle tusindvis af celler inden for minutter. En forhindring, der er fælles for begge fremgangsmåder,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker fru Pia stier for fremragende teknisk assistance. M. von Lilienfeld-Toal understøttes af Center for sepsis Control and Care (det tyske Forbundsministerium for uddannelse og sundhed, BMBF, FKZ 01E01002) og InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang støttes af Jena skolen for mikrobiel kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Materials

Adhesive foil Brand 701367
anti-CD14 V500 BD Biosciences 561391 clone M5E2
anti-CD45 BUV395 BD Biosciences 563792 clone HI30
anti-CD66b PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 562254 clone G10F5
anti-FITC APC ThermoFisher Scientific 17-7691-82 clone NAWESLEE
Cell culture plate, 12-well Greiner Bio-one 665180
Cell scraper Bioswisstech 800020
Cell strainer, 30 µm Miltenyi Biotech 130-098-458 SmartStrainer
Cytometer BD Biosciences LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)
Detergent Sigma Aldrich P1379 Tween 20, 0.01% in PBS
Drigalski spatula Carl Roth PC59.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED3SS-500g 2 mM in PBS
Erythrocyte lysis buffer 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom AG S 0115 10% in RPMI 1640
Fluorescein isothiocyanate (FITC) Sigma Aldrich F3651-100MG 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution
Formaldehyd Carl Roth PO87.3 Histofix
Malt agar (1.5%) malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes
Na2CO3 Carl Roth 8563.1 0.1 M in PBS
Petri dish Greiner Bio-one 633180
Phosphat Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 189012-014 without Calcium, without Magnesium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 61870010 RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement
Rotator Miltenyi Biotech 130-090-753 MACSmix Tube Rotator
Round-bottom tube, 7.5 mL Corning REF 352008
Software for data acquisition and analysis BD Biosciences FACSDiva 8.0
V-bottom plate, 96 well Brand 781601 untreated surface

References

  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  2. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  3. Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
  4. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  5. Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
  6. Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
  7. Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
  8. Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
  9. Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
  10. Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
  11. Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
  12. Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
  13. de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
  14. Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
  15. Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hartung, S., Rauh, C., Böttcher, S., Hoang, M. T. N., Jahreis, S., Rummler, S., Hochhaus, A., von Lilienfeld-Toal, M. Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (154), e60397, doi:10.3791/60397 (2019).

View Video