Måling af fagocytose af Aspergillus fumigatus Conidia af humane leukocytter ved hjælp af strømnings cytometri
Summary
Denne protokol giver en hurtig og pålidelig metode til kvantitativt at måle fagocytose af Aspergillus fumigatus conidia af humane primære fagocytter ved hjælp af flow cytometri og at diskriminere fagocytose af conidia fra simpel vedhæftning til leukocytter.
Abstract
Invasiv lungebetændelse af formen Aspergillus fumigatus udgør en stor trussel mod immunkompromitterede patienter. Inhalerede svampe nåle (sporer) udskilles fra den menneskelige lunge alveolerne ved at være fagocytoseret af medfødte monocytter og/eller neutrofiler. Denne protokol giver en hurtig og pålidelig måling af fagocytose ved flow cytometri ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-mærket conidia for Co-inkubation med humane leukocytter og efterfølgende kontra farvning med et anti-FITC antistof til at tillade diskrimination af internaliseret og celle-overbærende conidia. Store fordele ved denne protokol er dens rapidness, muligheden for at kombinere analysen med cytometrisk analyse af andre celle markører af interesse, den samtidige analyse af monocytter og neutrofiler fra en enkelt prøve og dens anvendelighed til andre celle vægbærende svampe eller bakterier. Bestemmelse af procentdele af fagocytoserende leukocytter giver et middel til mikrobiologer til vurdering af virulens af et patogen eller til sammenligning af patogener og mutanter samt til immunologer til undersøgelse af human leukocyt kapaciteter til bekæmpelse af patogener.
Introduction
Invasiv pulmonal aspergillose er en stor trussel mod immunkompromitterede patienter, da behandlingsmulighederne er begrænsede og kun lykkes ved tidlig diagnose, hvilket fører til høje dødelighedsrater1. Infektiøse agenser er conidia (sporer) af formen Aspergillus fumigatus , der er allestedsnærværende til de fleste levesteder2. Conidia inhaleres, passere gennem luftvejene og kan endelig komme ind i lunge alveolerne. Hos immunkompetente mennesker, disse conidia er ryddet af medfødte immunceller såsom monocytter eller makrofager og neutrofile granulocytter, som tager op (fagocytose) og fordøje patogener3. Fagocytose er vigtigt for mikrobiologer og immunologer ligeledes når interesserede i vært-patogen interaktioner. Konfrontationsassays, såsom Co-inkubation af leukocytter og conidia, omfatter ofte mærkning af sporer ved fluorescein eller dets afledte fluorescein isothiocyanat (FITC). Ved hjælp af et mikroskop er det ligetil at identificere internaliseret fluorescerende conidia og til at bestemme fastsiddende/klædelig conidia, selv om denne fremgangsmåde er tung og realistisk begrænset til et par hundrede celler4. Men i flow cytometri, som let giver mulighed for analyse af hundredtusinder af celler inden for minutter, er differentiel farvning af fagocytoseret og vedliggende conidia afgørende. Derfor er mange protokoller afhængige af trypan Blue til at slukke FITC-fluorescens fra vedsiddende conidia5,6,7,8. En anden fremgangsmåde er at udnytte fluorescens resonans energioverførsel af ethidium bromid og FITC til at udsende rødt i stedet for grøn fluorescens fra vedsiddende conidia9,10,11. Hvis specifikke antistoffer er tilgængelige, som det er tilfældet for nogle bakterier, celle bundne partikler kan være direkte plettet12,13.
Her præsenterer vi en protokol til hurtigt og kvantitativt vurdere fagocytose af FITC-mærket a. fumigatus conidia af humane leukocytter sammen med fastgørelse af sporer til celler og manglende interaktion ved at ansætte en allophycocyanin (APC)-koblede anti-FITC-antistof. Metoden giver også mulighed for samtidig flow cytometrisk analyse af yderligere celle markører, der kan anvendes til separat analyse af fagocytose af monocytter og neutrofiler fra samme prøve.
Protokollen kan anvendes til karakterisering af svampe stammer (f. eks. flere arter af Aspergillus og andre forme fra slægten mucorales præsenteret her) og deres mutanter14 og immunologisk forskning på phagocytter, såsom leukocytter fra immunkompromitterede individer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol præsenterer en hurtig flow cytometrisk metode til at måle interaktion af a. fumigatus conidia med et stort antal primære humane leukocytter, der ikke er muligt i almindelige mikroskopiske protokoller. Imaging celler med et mikroskop og manuelt tælle internaliseret conidia er besværligt og kan realistisk set gøres for et par hundrede celler kun. Flowcytometri overvinder dette problem ved at måle tusindvis af celler inden for minutter. En forhindring, der er fælles for begge fremgangsmåder,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker fru Pia stier for fremragende teknisk assistance. M. von Lilienfeld-Toal understøttes af Center for sepsis Control and Care (det tyske Forbundsministerium for uddannelse og sundhed, BMBF, FKZ 01E01002) og InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang støttes af Jena skolen for mikrobiel kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
