Summary
Этот протокол обеспечивает быстрый и надежный метод количественного измерения фагоцитоза Aspergillus fumigatus conidia человеческими первичными фагоцитами с использованием цитометрии потока и дискриминировать фагоцитоз конидии от простого прилипения к лейкоцитам.
Abstract
Инвазивная легочная инфекция плесенью Aspergillus fumigatus представляет большую угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом. Вдыхаемые грибковые конидии (споры) очищаются от альвеолов легких человека путем фагоцита врожденными моноцитами и/или нейтрофилов. Этот протокол предлагает быстрое и надежное измерение фагоцитоза цитометрией потока с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC) с маркировкой кониии для совместной инкубации с человеческими лейкоцитами и последующего противопоразрезания с анти-FITC антитела, чтобы позволить дискриминации интернализированной и клеточной приверженности conidia. Основными преимуществами этого протокола являются его быстрота, возможность совмещения анализа с цитометрическим анализом других клеточных маркеров, представляющих интерес, одновременный анализ моноцитов и нейтрофилов из одного образца и его применимость к другим клеточным настенным грибам или бактериям. Определение процентных долей фагоцитов лейкоцитов предоставляет микробиологам средства для оценки вирулентности патогена или для сравнения патогенных диких типов и мутантов, а также иммунологов для исследования возможностей лейкоцитов человека по борьбе с патогенными микроорганизмами.
Introduction
Инвазивный аспергиллез легких представляет большую угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом, так как варианты лечения ограничены и успешны только при ранней диагностике, что приводит к высокой смертности1. Инфекционные агенты conidia (споры) формы Aspergillus fumigatus, которые повсеместно в большинстве мест обитания2. Conidia вдыхаются, проходят через дыхательные пути и может, наконец, войти в легких альвеолы. У иммунокомпетентных людей, эти конидии очищаются врожденными иммунными клетками, такими как моноциты или макрофаги и нейтрофильные гранулоциты, которые занимают (фагоциты) и переваривают патогены3. Фагоцитоз имеет важное значение для микробиологов и иммунологов также, когда заинтересованы в принимающей патогенвзаимодействия взаимодействия. Конфронтационные анализы, такие как совместное инкубацию лейкоцитов и конидии, часто включают маркировку спор флуоресценгом или его производным флуоресцеем изотиоциана (FITC). Используя микроскоп, это просто определить интернализированные флуоресцентные конидии и определить прилагается / приверженец conidia, хотя этот подход является громоздким и реально ограничивается несколько сотен клеток4. Однако, в потоке цитометрии, которая легко позволяет анализ сотен тысяч клеток в течение нескольких минут, дифференциальное окрашивание фагоцитозных и приверженцев conidia имеет жизненно важное значение. Таким образом, многие протоколы полагаются на Trypan Blue, чтобы утолить FITC-флуоресценцию от адепта conidia5,6,7,8. Другой подход является использование флуоресценции резонанса передачи энергии бромида этидия и FITC излучать красный вместо зеленого флуоресценции от приверженца conidia9,10,11. Если конкретные антитела доступны, как и в случае с некоторыми бактериями, клеточные частицы могут быть непосредственно окрашенных12,13.
Здесь мы представляем протокол для быстрой и количественной оценки фагоцитоза FITC-маркировки A. fumigatus conidia человеческими лейкоцитами наряду с прикреплением спор к клеткам и отсутствием взаимодействия, используя аллофикоцианин (APC)-связанные антитела FITC. Метод также позволяет одновременно цитометрический анализ потока дальнейших маркеров клеток, которые могут быть использованы для отдельного анализа фагоцитоза моноцитами и нейтрофиловизмом из того же образца.
Протокол может быть применен для характеристики грибковых штаммов (например, несколько видов Аспергилл и других форм из рода Mucorales представлены здесь) и их мутантов14 и иммунологических исследований на фагоциты, такие как лейкоциты от иммунокомпромиссных лиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол включает в себя использование человеческих шуб, полученных из Института трансфузионной медицины, больницы Университета Джены и свежей венозной крови, взятой у пациентов, как после письменного информированного согласия доноров в соответствии с утверждением комитета по этике 4357-03/15.
1. Приготовление Аспергилла фумигата Конидии
- Выращивайте A. fumigatus на 1,5% солодовых агар-агар-петри блюда в течение 5 дней при 37 градусах Цельсия без CO2.
ВНИМАНИЕ: A. fumigatus является микроорганизмом уровня биобезопасности 2 и должен быть обработан в соответствующем объекте с помощью шкафа биобезопасности и носить лабораторное пальто, перчатки и маску для фильтра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна быть полностью покрыта зелено-серым слоем конидии. Белые культуры не терзают. Состав солодового агара: 4% (w/v) солодового экстракта, дрожжевого экстракта 0,4% (w/v), агара 1,5% (w/v), Aqua dest. - Урожай конидии
- Поместите бумажное полотенце мокрый с дезинфицирующим средством в кабинет биобезопасности и положить пластину на вершине, чтобы предотвратить перераспределение летучих conidia.
- Добавьте 10 мл фосфатного буферного солей (PBS) и 0,01% моющего средства поверх гриба, используйте шпатель Drigalski для распространения жидкости по тарелке и стирать темный цвет конидии. Будьте осторожны, чтобы не удалить белый мицелий.
- Положите подвеску conidia к трубке 50 mL используя strainer клетки 30 мкм для того чтобы извлечь любой остаточный мицелий.
- Повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 и соберите в той же трубке 50 мл.
- Спин в течение 5 мин при температуре в комнате 2600 х г.
- Удалите супернатант и resuspend в 20 мл стерильных Aqua dest.
- Определить концентрацию конидии с камерой подсчета Тома.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлено здесь и conidia подвески хранится до 1 месяца при 4 градуса х с крышкой привинчены плотно.
- Маркировка FITC
- Приготовьте раствор 0,1 мМ порошка FITC в стерильном 0,1 М NaCO 3(растворенный в PBS).
ВНИМАНИЕ: ПОрошок FITC является опасным и должны быть обработаны с перчатками, очки и фильтр маски. Сбор отходов в соответствии с местными правилами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опусканите искусственный свет во время этого и следующих шагов, связанных с conidia. - Отдохните 1 х 108 (или меньше) конидиа в 5 мл раствора FITC в трубке 15 мл. Инкубировать в течение 20 мин при 37 градусах По Цельсию в ротаторе.
- Для отрицательного контроля, resuspend conidia в 0.1 M NaCO3 (без FITC) в трубке 15 мл. Инкубировать в течение 20 мин при 37 градусах По Цельсию в ротаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: При расчете количества конидии, чтобы быть окрашены, принимать во внимание потерю до 70% во время окрашивания, отек и все необходимые шаги стирки. Если нет ротатора, подвеска должна быть потрясена три раза во время инкубации. - Для мытья добавьте 10 мл моющего средства PBS 0,01% в подвеску и закрутите в течение 5 мин при температуре в комнате 2600 х г.
- Удалить супернатант и повторить стирку дважды с 10 мл PBS й 0,01% моющего средства.
- Приготовьте раствор 0,1 мМ порошка FITC в стерильном 0,1 М NaCO 3(растворенный в PBS).
- Отек конидии (может быть опущен, если не желательно)
- Resuspend FITC помечены conidia в 5 мл Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) среднего 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) и инкубировать в ротаторе на 37 градусов по Цельсию в течение нужного времени (например, 2 ч, 4 ч).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет ротатора, подвеска должна быть встряхнута по крайней мере каждые 20 минут во время инкубации. - Добавьте 10 мл моющего средства PBS и 0,01% к подвеске и вращайтесь в течение 5 мин при температуре в комнатной комнате 2600 х г.
- Удалите супернатант и дважды промойте 10 мл моющего средства PBS и 0,01%.
- Фильтр через 30 мкм ячейки ситечко, чтобы удалить большие скопления conidia.
- Resuspend FITC помечены conidia в 5 мл Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) среднего 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) и инкубировать в ротаторе на 37 градусов по Цельсию в течение нужного времени (например, 2 ч, 4 ч).
- Фиксация конидии (может быть опущена при желании)
- Отрежьте FITC помеченной и опухшей конидией в 1 мл формальдегида и инкубировать по 1 ч при комнатной температуре.
- Добавьте 10 мл моющего средства PBS и 0,01% к подвеске и вращайтесь в течение 5 мин при температуре в комнатной комнате 2600 х г.
- Удалите супернатант и дважды промойте 10 мл моющего средства PBS и 0,01%.
ПРИМЕЧАНИЕ : Протокол может быть приостановлено здесь и conidia хранится в PBS в темноте (трубка завернутый в алюминиевую фольгу)на срок до 1 недели при 4 Градуса по Цельсию.
2. Подготовка леуктоцитов человека
- Положите 5 мл шуб в трубку 50 мл. Кроме того, используйте свежую периферийную венозную кровь человека, втянутую в этиледениаминететраацетическую кислоту (ЭДТА) моноветы (10 мл на 50 мл трубки).
ВНИМАНИЕ: Человеческая кровь может передавать вирусы, такие как вирус иммунодефицита человека и вирус гепатита В. Ручка только после вакцинации против гепатита B. Ручка в кабинете биобезопасности носить лабораторные пальто и перчатки. - Заполните трубку с erythrocyte Lysis (EL) Буфер, инвертировать три раза и инкубировать в течение 5-8 минут горизонтально, пока молочный вид смеси становится ясно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, кровь может занять больше времени, чтобы лиза. Иди по внешнему виду. Это не редкость, что две трубки одной и той же крови принимают разное время, чтобы лиза. Состав EL буфера: 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA - Спин в течение 10 мин при температуре 300 х при комнатной температуре. Отбросьте супернатант.
- Приостановите гранулы в 1 мл EL Buffer путем пипетки. Затем добавьте еще 24 мл буфера EL и инвертировать несколько раз.
- Спин в течение 5 мин при температуре 300 х при комнатной температуре.
- Откажитесь от супернатанта и отрепротивайте клетки в 1 мл RPMI и 10% FCS.
- Определите концентрацию клеток с помощью счетной камеры Нойбауэра.
3. Фагоцитоз Ассай
- Инкубировать 2 х 106 лейкоцитов и 4 х 106 FITC-маркированных конидии (множественность инфекции No 2) в 1,5 мл RPMI 10% FCS в 12-хорошо пластины культуры клеток. В качестве контроля, включают только клетки (без конидии) и клетки и немаркированные conidia.
- Поместите в увлажненный ИНкубатор CO2 при 37 градусах По Цельсия и инкубировать в течение нужного периода времени (например, 0,5 ч, 2 ч или 4 ч).
- После инкубации собираем клетки с клеточной скребок и кладите в трубку 15 мл.
- Спин в течение 5 мин при температуре 300 х при комнатной температуре.
- Соберите супернатант для анализа цитокинов или отбросить, если не хотел. Отреприжить каждый образец в 100 л PBS и 2 мМ EDTA.
4. Запятнание антител
- Для каждого образца, подготовить 100 л антител смесь, в том числе APC анти-FITC антитела, в соответствии с таблицей 1.
- Положите образец 100 л в одну скважину 96-хорошо V-нижней пластины. Добавьте 150 л от PBS и 2 мМ EDTA для стирки.
- Для компенсации цвета поместите 1 х 106 ячеек для каждого цвета в дальнейших колодцах 96-хорошей нижней пластины V. Включите колодец ячеек, который остается незапятнанным. Добавьте 150 л от PBS и 2 мМ EDTA для стирки.
- Накрыть тарелкой клейкой фольгой.
- Спин в течение 5 мин при температуре 300 х при комнатной температуре. Снимите фольгу.
- Откажитесь от супернатанта, быстро и насильно инвертируя тарелку только один раз над раковиной или одноразовым бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не повторяйте и не стучите пластины на бумаге, пока не высохнет, как это приведет к массовой потере клеток из пластины. - Resuspend клетки в 100 мл антитела смесь, и хорошо перемешать путем pipetting.
- Для компенсации цвета, resuspend соответствующие клетки в 100 Л PBS 2 мМ EDTA и добавить одно антитело к каждой скважине на том же количестве, используемом в смеси антител.
- Накрыть клейкой фольгой и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.
- Снимите фольгу. Добавьте 150 л ОТ PBS и 2 мМ EDTA к каждой скважине для мытья. Накрыть клейкой фольгой.
- Спин в течение 5 мин при температуре 300 х при комнатной температуре. Снимите фольгу. Откажитесь от супернатанта, быстро и насильно инвертируя тарелку над раковиной или одноразовым бумажным полотенцем.
- Повторно езду в 200 л PBS и 2 мМ EDTA и передачи клеток из каждой скважины в отдельную круглую нижнюю трубку. Убедитесь, что в подвеске нет кластеров ячеек. Удалите кластеры в противном случае.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое скопление, которое является достаточно большим для глаз, чтобы увидеть достаточно велик, чтобы потенциально засорить цитометр.
5. Цитометрия потока
- Запустите поток цитометра и дайте ему прогреться. Запустите программное обеспечение для приобретения.
- Создайте новый эксперимент и установите и пометьте образцы.
- Настройка параметров (FSC 250, SSC 250) и детекторов для фторофоров FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-Cy5.5.
- Настройка компенсации
- Открытая настройка компенсации.
- Укажите отдельные цвета.
- Используя контрольные элементы, оставшиеся неокрашенными или с индивидуальными окрашиваниями, установите напряжение детектора PMT, чтобы включить все события в масштабе.
- Запись по крайней мере 10000 событий каждого элемента управления.
- Используйте настройку компенсации для расчета распространения флюорофоров и применить к настройкам цитометра эксперимента.
- Запись выборочных данных
- Отображение FSC и SSC в приобретении программного обеспечения и установить ворота вокруг лейкоцитов.
- Основываясь на воротах лейкоцитов, отображаются точечный участок SSC/CD45 и ворота для клеток CD45, чтобы отделиться от конидии.
- Отображение клеток CD45 в точечном участке CD14/CD66b и моноцитов ворот (CD14) и нейтрофилов (CD66b) отдельно.
- Отображение нейтрофилов в точечном сюжете анти-FITC/FITC.
- Используя образец с немаркированной конидией, набор квадрантов для анти-FITC и FITC сигналов, что позволяет максимум 1% клеток в соответствующих квадрантов.
- Повторите шаги 5.5.4 и 5.5.5 для моноцитных ворот.
- Запишите все образцы, по крайней мере 20000 событий в воротах лейкоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При измерении фагоцитоза A. fumigatus conidia человеческими фагоцитными клетками, дискриминация между подлинной интернализацией и простой привязанностью конидии к клеткам является препятствием, особенно когда речь идет о методах высокой пропускной связи, таких как цитометрия потока. Для того, чтобы преодолеть это препятствие, мы представляем быстрый и надежный протокол, основанный на окрашивании конидии флуоресцентным красителем FITC до совместного инкубации клеток и конидии, а затем контрпогное с aPC-маркированных анти-FITC антитела после инкубации (Рисунок 1A). Как показано на рисунке 1B,FITC помечены конидиа являются фагоциты человека моноцитов и нейтрофилов, которые обеспечивают зеленый сигнал к клеткам. Эти конидии недоступны для анти-FITC антитела и, следовательно, не может связать антитела и клетки появляются APC отрицательным (FITC, APC-). Невзаимодействующие клетки не приобретают зеленого сигнала от кониии с маркировкой FITC и остаются FITC-, APC-. Несколько ячеек появляются FITC-, APC. Так как анти-FITC APC антитела не должны быть в состоянии связывать клетки без FITC помечены conidia, эти события считаются окрашивания артефактов. FITC-маркированные conidia, которые прикреплены к клеткам, но не интернализированы, делают клетки также положительными для FITC, но также обеспечивают мишень для анти-FITC антитела, что делает эти клетки двойным положительным для FITC и APC (FITC, APC). При анализе микроскопически, эта популяция содержала до 20% клеток с прикрепленной конидией только в наших экспериментах.
Использование антител, описанных в этом протоколе и после gating стратегии в Рисунке 1D, общее gating человеческих лейкоцитов по FSC и SSC характеристики следуют разделение лейкоцитов и свободной conidia пан-лейкоцитмаркер CD45. Особенно при использовании опухшие conidia и / или долго ежей инкубации раз, conidia может достигать почти размер клеток во время потока цитометрии и, следовательно, предвзятость анализа. Поскольку первичные моноциты человека и нейтрофилы по-разному относятся конидии, этот протокол позволяет отдельно анализировать эти клеточные популяции на основе окрашивания с устоявшимися маркерами клеточной линии CD14 для моноцитов и CD66b для нейтрофилов. Gating для фагоцитозной и адептов популяций клеток осуществляется на основе контрольных образцов с немаркированной конидией, которые не несут ни FITC, ни анти-FITC APC сигнала. Когда APC и FITC построены друг против друга, квадранты устанавливаются таким образом, что максимум 1% клетки допускаются в ворота интереса.
Процент первичных фагоцитов человека интернализации конидии может быть весьма изменчивым среди доноров крови, но также зависит от экспериментальных факторов, таких как время инкубации и отек состояние conidia. Интернализация спори может быть обнаружена после 0,5 ч совместной инкубации уже и увеличивается со временем(рисунок 2A). Предварительно опухшие конидии занимают легче, чем отдых (не опухшие) споры даже в короткие время инкубации(рисунок 2B). Если конидия фиксируется с формальдегидом, фагоцитоз уменьшается по сравнению с родной конидии(рисунок 2C).
| Реагента | l на образец |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b PerCP-Cy5.5 | 1.5 |
| анти-FITC APC | 0.5 |
| PBS 2 мМ EDTA | 97 |
| Общая | 100 |
Таблица 1: Смесь антител для цитометрии потока. Количество каждого реагента дается в виде микролитров на образец (1 х 106 клеток), которые будут проанализированы.
Рисунок 1: Настройка и анализ анализа цитометрического фагоцитоза потока. (A)Схема протокола, включая конидию и подготовку клеток и противодействие. (B) Phagocytosis анализируется путем построения потока цитометрических данных FITC помечены conidia против анти-FITC APC контрпоступления. В результате популяции указывают на процентнее не взаимодействующих лейкоцитов (FITC-, APC-), лейкоцитов с адептами конидии (FITC, APC) и фагоцитов leukocytes (FITC, APC-), а также окрашивания артефактов (FITC-, APC). (C) Двойные положительные популяции клеток из 3 различных экспериментов с 3 различными донорами (два из них выполняются в дубликаты, один выполняется один) были микроскопически подсчитаны для интернализированы и прилагается только конидия. (D) Представитель gating стратегия потока цитометрических данных для обнаружения лейкоцитов (CD45), выявления моноцитов (CD14) и нейтрофилов (CD66b) и определить взаимодействующих популяций (FITC, анти-FITC). Эта цифра была изменена от Hartung et al., Цитометрия A, 95: 3, стр. 332-338 (2019)14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Фагоцитоз конидии человеческими первичными фагоцитами зависит от нескольких условий. ( A) Процент клеток интернализации отдыха conidia увеличивается с совместной инкубации времени. (B) Phagocytosis увеличено с conidial временем запухания когда co-incubated для 0.5 h. (C) Родная conidia были более лучшие phagocytosed чем фикчированная conidia. Данные были получены от 10 различных доноров(A,B) или 5 различных доноров (C) в 10 (A, B) или 5 (C) независимых экспериментов. Бары ошибок указывают sD. Эта цифра была изменена от Hartung et al., Цитометрия A, 95: 3, стр. 332-338 (2019)14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ фагоцитоза является средством оценки функциональности первичных фагоцитов человека и характеристики клинически значимых форм. (A) Образцовое сравнение моноцитов от здорового донора и иммунодепрессионного пациента (после гематопогетической трансплантации стволовых клеток) фагоцитоза покоя покоя покоится на 0,5 ч, 2 ч и 4 ч. (B) Phagocytosis отдыха грибковых conidia был определен для клинически значимых Aspergillus и Mucorales видов после 2 h. Данные были получены из 5 (Aspergillus) или 3 (Mucorales) различных доноров в 5 или 3 независимых экспериментов каждый. Ошибки баров указать SD. Abbreviations: А. Аспергиллус, Л. Лихтхеймия, М. Мукор, Р. Rhizopus Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет собой метод быстрого потока цитометрического измерения взаимодействия A. fumigatus conidia с большим количеством первичных человеческих лейкоцитов, что невозможно в общих микроскопических протоколах. Воображение клеток с микроскопом и вручную подсчета интернализированных conidia является громоздким и может реально сделать для нескольких сотен клеток только. Цитометрия потока преодолевает эту проблему, измеряя тысячи клеток в течение нескольких минут. Препятствием, общим для обоих подходов, является различие фагоцитоза и приверженца конидии в клетках или на клетках, соответственно. В микроскопии, краситель calcofluor белый часто используется для окрашивания приверженец conidia, но его использование ограничивается микроорганизмов с хитиносодержащей клеточной стенки.
Этот протокол, в отличие от используется различные флюорофоры для характеристики событий взаимодействия, что позволяет добавление дополнительных маркеров клеток, таких как маркеры линии CD45, CD14 и CD66b. Таким образом, можно также дискриминировать фагоцитоз патогенных микроорганизмов моноцитами и нейтрофиловами в одном образце. В то время как выбор маркеров и флюорофоров для идентификации клеток может быть адаптирован к потребностям эксперимента и возможностям доступного цитометра, рекомендуется использование конкретных антитела ХПК, упомянутых в этом протоколе, так как самые надежные антитела в наших руках.
Так как формальдегид-фиксированная конидия не интернализированы одинаково хорошо, родные споры рекомендуется для анализов фагоцитоза. Тем не менее, родной конидии начнется или продолжит сяпиль во время совместной инкубации с человеческими лейкоцитами и в конечном итоге прорастают. Как правило, A. fumigatus conidia прорастают примерно после 8-9 ч в глюкозсодержащих носителях при 37 градусах Цельсия. Сочетание времени отеков и времени совместной инкубации с фагоцитами не должно превышать этот временной промежуток, так как прорастание приводит к потере FITC на поверхности конидии. Что еще более важно, зародыши больше не могут быть фагоцитозными моноцитами или нейтрофиловами. Вместо этого, эти фагоциты накапливаются вокруг и придерживаться зародышей, которые производят клеточные кластеры, которые засорять цитометр, если не удалены. Аналогичным образом, 4 ч опухшие conidia, как правило, генерировать кластеры между собой и с клетками. Часто эти кластеры не могут быть разделены механически больше и клетки внутри теряются для потока цитометрического анализа.
Хотя gating является простым и легким в начале, тем больше conidia интернализированы клетками, размытые gating может стать. Использование MOIs sgt; 2 увеличивает фагоцитоз в начальные моменты времени, но gating вопросы могут возникнуть и раньше. Поэтому, MOIs должны быть тщательно определены с конкретными клетками и патогенными микроорганизмами, представляющими интерес.
Ограничение этого протокола заключается в двойственности популяции клеток с адептом конидии (FITC) APC), которая также может укрывать клетки с приверженцами, а также интернализированной конидией. Возможность для дальнейшей дискриминации является применение цитометрии потока изображений15, что позволяет визуальное изображение всех клеток, измеренных в цитометре потока.
Из-за неспецифической маркировки FITC конидиальной клеточной стенки, этот метод легко передаваемого к другим грибам интереса such as клинически уместные формы родmu Mucorales или дрожжи Candida albicans. Кроме того, также клеточные стены подшипников бактерий могут быть FITC-маркировки. Универсальное противотанковое противо-fitC антитела позволяет быстро и легко измерения фагоцитоза всех этих патогенов, так большое количество человеческих лейкоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим г-жу Пиа Стьера за отличную техническую помощь. М. фон Лилиенфельд-Тоал поддерживается Центром контроля и ухода за сепсисом (Федеральное министерство образования и здравоохранения Германии, BMBF, ФКЗ 01E01002) и исследовательским кампусом InfectoGnostics (BMBF, ФКЗ 13GW0096D). Тхи Нгок Май Хоанг поддерживается Школой микробной коммуникации Джены (Deutsche Forschungsgemeinschaft, ФКЗ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
