Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה כדי לכמת את phagocyציטוזה של אספגינוס באמצעות הפגוציטים הגוף האנושי באמצעות הזרימה cy, try ולהפלות את הפגוציטוזה של המחט מתוך הדבקה ללוקוציטים בלבד.
Abstract
דלקת בריאות פולשנית על ידי העובש אספרגייוס , מהווה איום גדול לחולים בסיכון חיסוני. שאפה פטרייתי פטריות (נבגים) נמחקים מן הריאה האנושית מכתשי על ידי להיות phagocytosed על ידי מונוציטים מולדת ו/או נויטרופילים. פרוטוקול זה מציע מדידה מהירה ואמינה של phagocyציטוזה על ידי זרימה cy, באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-מחט המסומנת לשיתוף הדגירה עם לוקיציטים האדם ולאחר הצביעת נגד נוגדנים נגד FITC כדי לאפשר אפליה של הפנפינט ותאי-חסיד המחט. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם מהירות, האפשרות לשלב את הטיפול עם ניתוח ציטומטרי של סמני תאים אחרים של עניין, הניתוח הסימולטני של מונוציטים ונויטרופילים ממדגם אחד את הישימות שלה כדי הקיר אחר הנושאת הפטריות או חיידקים. קביעת אחוזים של לוקיציטים מספקת אמצעי למיקרו-ביולוגים להערכת התקפה אלימה של פתוגן או להשוואת סוגי הפתוגן והמוטציות, כמו גם למחלות אימונולוגים לחקירת יכולות לוקמיה אנושיים כדי להילחם בפתוגנים.
Introduction
הריאות פולשנית הריאתי הוא איום גדול לחולים חיסוני כמו אפשרויות הטיפול מוגבלות ורק מוצלח על אבחנה מוקדמת, אשר מוביל שיעורי תמותה גבוה1. החומרים הזיהומיות הם עצי מחט (נבגים) של העובש אספרגייוס , שנמצאים בכל מקום לבתי הגידולהשניים. המחט משאפים, עוברים דרך דרכי הנשימה והוא יכול לבסוף להיכנס לריאות מכתשי. בבני אדם החיסונית, המחט האלה מנוקה על ידי תאים חיסוניים מולדים כגון מונוציטים או מקרופאגים ו נויטרופילים גרנולוציטים, אשר לקחת (phagocytose) ולעכל את פתוגנים3. Phagocyציטוזה חשוב עבור מיקרו ביולוגים ואימונוולוגים גם כאשר מעוניינים אינטראקציה המארחים-הפתוגן. העימות אומר, כגון דגירה שיתוף של לוקיציטים ו מחט, לעתים קרובות כוללים תיוג של הנבגים על ידי fluorescein או הנגזרת הנגזרות שלה isothiocyanate (FITC). באמצעות מיקרוסקופ, זה פשוט לזהות את המחט פלורסנט הפנפנידיה כדי לקבוע המחט מצורף/חסיד, למרות גישה זו היא מסורבלת מוגבלת מציאותית לכמה מאות תאים4. עם זאת, בזרימה cy, אשר בקלות מאפשר ניתוח של מאות אלפי תאים בתוך דקות, מכתים ההפרש של המחט המגולמת וחסיד הוא חיוני. לכן, פרוטוקולים רבים מסתמכים על טריפה כחול כדי להרוות את הקרינה הפלואורסצנטיתמתוך מחט של 5,6,7,8. גישה נוספת היא לנצל את העברת אנרגיה התהודה הפלואורסצנטית של אתידיום ברומיד ו fitc לפלוט אדום במקום זריחה ירוקה מ חסיד מחט9,10,11. אם יש נוגדנים מסוימים זמינים, כמו במקרה של חיידקים מסוימים, חלקיקים מאוגדים תא יכול להיות מוכתם באופן ישיר12,13.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול במהירות ובקוונטי להעריך phagocyציטוזה של התווית FITC מתויג על ידי האדם לוקיציטים, יחד עם החזקה של נבגים לתאים וחוסר אינטראקציה על ידי העסקת allophycocyanin (APC)-ביחד נוגדן ANTI-fitc. השיטה מאפשרת גם ניתוח הציטוטומטט זרימה בו של סמנים תאים נוספים, כי ניתן ליישם ניתוח נפרד של phagocyציטוזה על ידי מונוציטים ו נויטרופילים מאותה דוגמית.
הפרוטוקול יכול להיות מיושם על אפיון של זנים פטרייתיים (למשל, מינים של אספרגינוס וצורות אחרות מסוג mucorales הציג כאן) ואת המוטציות שלהם14 ו מחקר אימונולוגיים על phagocytes, כגון לוקיציטים מאנשים שנפגעו חיסוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כולל את השימוש של מעילים באפי האדם שהתקבלו מן המכון לרפואה עירוי, אוניברסיטת יינה בית החולים ובדם ורידי טרי שנמשך מחולים, הן לאחר בכתב הסכמה מושכלת של התורמים על פי אישור ועדת האתיקה 4357-03/15.
1. הכנת אספיוס מחטאים
- . תגדל בירה. ב1.5% מאלט מנות פטרי במשך 5 ימים ב 37 ° c ללא CO2.
זהירות: א. חיטוי הוא ברמה אבטחה טיחות 2 מיקרואורגניזם ויש לטפל במתקן המתאים באמצעות ארון בטיחות ביולוגי לובש חלוק מעבדה, כפפות מסכה מסנן.
הערה: הלוח צריך להיות מכוסה לחלוטין עם שכבה ירוקה-אפרפר של מחט. . תרבויות לבנות לא מספוריות הרכב של מאלט אגר: 4% (w/v) מאלט לחלץ, שמרים לחלץ 0.4% (w/v), אגר 1.5% (w/v), מאוד אקווה. - מחטניים
- מניחים מגבת נייר רטוב עם חיטוי לתוך הקבינט אבטחה טיחות ולשים את הצלחת על גבי כדי למנוע הפצה יתר של מחט נדיפים.
- הוסף 10 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) + 0.01% סבון על גבי הפטריה, השתמש במרית Drigalski לפזר את הנוזל על הצלחת ולשפשף את המחט בצבע כהה. להיזהר לא להסיר את mycelium לבן.
- שימו את המתלה מחט לצינור 50 mL באמצעות מסננת תא 30 יקרומטר כדי להסיר mycelium שיורית.
- חזור על שלבים 1.2.2 ו 1.2.3 ולאסוף באותו צינור 50 mL.
- ספין עבור 5 דקות ב 2,600 x g בטמפרטורת החדר.
- הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש ב-20 מ ל של מעשה המים הסטרילי.
- קבע את ריכוז המחט. עם תא ספירת תוממה
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ואת המתלה המחט המאוחסן עד לחודש אחד ב -4 ° c עם המכסה נדפקה בחוזקה.
- תיוג FITC
- להכין פתרון 0.1 mM של אבקת FITC ב סטרילי 0.1 M Na2CO3 (הומס ב PBS).
זהירות: אבקת fitc היא מסוכנת ויש לטפל בה עם כפפות, משקפי מגן ומסיכת מסנן. לאסוף פסולת על פי התקנות המקומיות.
הערה: השמט אור מלאכותי במהלך פעולה זו והשלבים הבאים הכרוכים במחט. - השהה מחדש 1 x 108 (או פחות) מחט ב 5 מ ל של פתרון fitc בצינור 15 מ"ל. דגירה של 20 דקות ב 37 ° c בתוך מסובבי.
- עבור השליטה השלילית, השהה מחדש את המחט ב 0.1 M Na2CO3 (ללא fitc) בצינור 15 מ"ל. דגירה של 20 דקות ב 37 ° c בתוך מסובבי.
הערה: בעת חישוב כמות המחט להיות מוכתם, לקחת בחשבון אובדן של עד 70% במהלך הכתמים, נפיחות כל שלבי הכביסה הדרושים. אם אין מסובבי זמין, ההשעיה צריך להיות מזועזע שלוש פעמים במהלך הדגירה. - לכביסה, להוסיף 10 מ ל של PBS + 0.01% אבקת כביסה להשעיה ו ספין עבור 5 דקות ב 2,600 x g בטמפרטורת החדר.
- הסר את הסופרנטאנט וחזור על הכביסה פעמיים עם 10 מ ל של PBS + 0.01% כביסה.
- להכין פתרון 0.1 mM של אבקת FITC ב סטרילי 0.1 M Na2CO3 (הומס ב PBS).
- נפיחות של עצי מחט (ניתן להשמיט אם לא רצוי)
- השעיה מחדש FITC התווית המחט ב 5 מ ל של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני + 10% סרום העוברי העובר (FCS) ו דגירה בתוך מסובבי ב 37 ° c עבור הזמן הרצוי (למשל, 2 h, 4 ח).
הערה: אם אין מסובבי זמין, ההשעיה צריך להיות מזועזע לפחות כל 20 דקות במהלך הדגירה. - הוסף 10 מ ל של PBS + 0.01% סבון להשעיה ו ספין עבור 5 דקות ב 2,600 x g בטמפרטורת החדר.
- הסר את הסופרנטנט ושטוף פעמיים עם 10 מ ל של PBS + 0.01% כביסה.
- לסנן דרך מסננת תא 30 יקרומטר כדי להסיר גושים גדולים של מחט.
- השעיה מחדש FITC התווית המחט ב 5 מ ל של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני + 10% סרום העוברי העובר (FCS) ו דגירה בתוך מסובבי ב 37 ° c עבור הזמן הרצוי (למשל, 2 h, 4 ח).
- תיקון המחט (ניתן להשמיט אם לא רצוי)
- השהה מחדש את FITC התווית והנפוחה ב 1 מ ל של פורמלדהיד ו דגירה עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- הוסף 10 מ ל של PBS + 0.01% סבון להשעיה ו ספין עבור 5 דקות ב 2,600 x g בטמפרטורת החדר.
- הסר את הסופרנטנט ושטוף פעמיים עם 10 מ ל של PBS + 0.01% כביסה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ואת עצי המחט המאוחסנים ב-PBS בחשיכה (הצינור עטוף ברדיד אלומיניום) עד שבוע אחד ב -4 ° c.
2. הכנת לוקיציטים ראשיות אנושיות
- לשים 5 מ ל של מעיל באפי בצינור 50 mL. לחילופין, השתמש בדם טרי היקפי ורידי דם שנמשך לתוך החומצה אתיוליאדיםmonovettes (EDTA) (10 מ"ל לכל 50 mL).
זהירות: דם האדם עשוי להעביר וירוסים כגון נגיף הכשל החיסוני האנושי ו צהבת B וירוס. לטפל רק לאחר שחוסנו נגד צהבת B. ידית בארון בטיחות לובש חלוק מעבדה וכפפות. - ממלאים את הצינור עם אריתרופוזיס הליזה (EL) מאגר, להפוך שלוש פעמים ו דגירה עבור 5-8 דקות אופקית עד המראה החלבי של התערובת הופכת ברורה.
הערה: לפעמים הדם עלול להימשך זמן רב יותר. . לך לפי המראה זה לא יוצא דופן, כי שתי שפופרות של אותו דם לקחת פעמים שונות כדי lyse. הרכב של מאגר אל: 0.15 M NH4Cl, 10 מ"מ khco3, 0.1 mm edta - ספין עבור 10 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר. . מחק את הסופרנטאנט
- השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר אל על ידי ליטוף. לאחר מכן הוסיפו עוד 24 מ ל של מאגר אל, והיפוך מספר פעמים.
- ספין עבור 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר.
- מחק את התאים החוזרים והשהה מחדש ב-1 mL של RPMI + 10% FCS.
- קבע את ריכוז התא עם תא מונה נויבאואר.
3. שיטת פייגוציטוזה
- דגירה 2 x 106 לוקיציטים ו 4 x 106 fitc התווית מחט (ריבוי של זיהום = 2) ב 1.5 mL של RPMI + 10% fcs בלוח 12-היטב של תרבות התא. כפקדים, כלול תאים בלבד (ללא מחט) ותאים + מחט ללא תווית.
- המקום בתוך מחולל לחות CO2 בחממה ב 37 ° c ו דגירה עבור התקופה הרצויה של זמן (למשל, 0.5 h, 2 h או 4 h).
- לאחר הדגירה, לקצור תאים עם מגרד תא ולשים בצינור 15 מ ל.
- ספין עבור 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר.
- לאסוף סופרנטאנט לניתוח ציטוקין או להשליך אם לא רצוי. השהה מחדש כל דגם ב-100 μL של PBS + 2 מ"מ EDTA.
4. מכתים את הנוגדן
- עבור כל מדגם, להכין 100 μL של שילוב נוגדן, כולל הנוגדן APC anti-FITC, על פי לוח 1.
- לשים דגם μL 100 לתוך הבאר אחת של 96-טוב הצלחת V-התחתון. הוסף 150 μL של PBS + 2 מילימטר EDTA לכביסה.
- עבור פיצוי צבע, מקום 1 x 106 תאים עבור כל צבע בבארות נוספות של 96-טוב V צלחת התחתונה. כלול גם תאים שאינם מוכתמים. הוסף 150 μL של PBS + 2 מילימטר EDTA לכביסה.
- לכסות את הצלחת עם נייר דבק.
- ספין עבור 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר. הסר את נייר הכסף.
- השמט את הסופרנטנט במהירות ובכוח היפוך הצלחת רק פעם אחת מעל הכיור או מגבת נייר חד פעמית.
הערה: לא לחזור או להקיש על הצלחת על נייר עד יבש כמו זה יגרום לאובדן מסיבי של תאים מהצלחת. - השהה תאים מחדש בתמהיל הנוגדנים 100 μL, וערבבו היטב באמצעות ליטוף.
- עבור פיצוי צבע, השהה מחדש את התאים המתאימים ב-100 μL של PBS + 2 מ"מ EDTA ולהוסיף נוגדן יחיד לכל טוב באותו סכום בשימוש בתמהיל נוגדן.
- מכסים עם נייר דבק ו דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- הסר את נייר הכסף. הוסף 150 μL של PBS + 2 מילימטר EDTA לכל טוב עבור כביסה. מכסים בנייר דבק.
- ספין עבור 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר. הסר את נייר הכסף. השמט את הסופרנטנט במהירות ובכוח היפוך הצלחת מעל הכיור או מגבת נייר חד פעמית.
- השהה מחדש ב-200 μL של PBS + 2 מ"מ והעבר תאים מכל באר לצינור תחתון נפרד. ודא שאין אשכולות תאים בהשעיה. הסרת אשכולות אחרת.
הערה: כל אשכול הגדול מספיק כדי שהעין תראה גדולה מספיק כדי לסתום את הציטומטר.
5. הזרמה לזרימה
- הפעל את cytometer הזרימה ולתת לו להתחמם. הפעל את תוכנת הרכישה.
- צור ניסוי חדש והתקנה ותייג את הדגימות.
- להגדיר פרמטרים (FSC 250, אס. אס 250) וגלאים עבור fluorophores FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-Cy 5.5.
- כיוונון פיצוי
- פתח כיוונון פיצוי.
- ציין צבעים בודדים.
- באמצעות תאי הבקרה שאינם מוכתמים או עם הסטטינוגים הבודדים, הגדר את מתח הגלאי של PMT כדי לכלול את כל האירועים בקנה המידה.
- שיא לפחות 10,000 אירועים של כל פקד.
- השתמש בכיוונון הפיצוי כדי לחשב את הגלישה של fluorophores ולהחיל על הגדרות cytometer של הניסוי.
- הקלטת נתונים לדוגמה
- הציגו FSC ו-מהאס-אס בתוכנת הרכישה וקבעו שער סביב הלוקוציטים.
- בהתבסס על השער הלוקואני, להציג נקודה העלילה למטה/CD45 ושער עבור CD45 + תאים להפריד מתוך מחט.
- הצג CD45 + תאים בעלילה נקודה CD14/CD66b ומונוציטים השער (CD14 +) ו נויטרופילים (CD66b +) בנפרד.
- להציג נויטרופילים בעלילה נקודה anti-FITC/FITC.
- באמצעות המדגם עם מחט ללא תווית, להגדיר הרביעים anti-FITC ו-FITC אותות, המאפשר מקסימום של 1% תאים ברבעים המתאימים.
- חזור על שלבים ה5.5.4 וה5.5.5 עבור שער מונוציט.
- הקלט את כל הדגימות עם לפחות 20,000 אירועים בשער הלוקוציט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ב מדידת phagocyציטוזה של א. חיטוי המחט על ידי התאים האנושיים phagocytosis, האפליה בין הפנמה אמיתי מצורף גרידא של מחט לתאים הוא מכשול, במיוחד כשמדובר בשיטות תפוקה גבוהה כגון הזרימה cy, לנסות. על מנת להתגבר על משוכה זו, אנו מציגים פרוטוקול מהיר ואמין מבוסס על כתמים של עצי מחט עם צבען פלורסנט FITC לפני הדגירה המשותף של תאים, מחט, ואחריו כתמים נגד עם הנוגדן APC נגד-FITC לאחר הדגירה (איור 1א). כפי שמוצג באיור 1B, מחט בתווית fitc הם phagocytosed על ידי האדם מונוציטים ו נויטרופילים המספקים אות ירוק לתאים. המחט האלה אינם נגישים לנוגדן anti-FITC ולכן, לא ניתן לאגד את הנוגדן ואת התאים מופיעים APC שלילית (FITC +, APC-). תאים שאינם בעלי אינטראקציה אינם רוכשים אות ירוק ממחט המסומנת ב-FITC ונשארים FITC-, APC-. כמה תאים מופיעים FITC-, APC +. מאז אנטי-FITC נוגדן APC לא צריך להיות מסוגל לאגד תאים ללא מחטניים FITC התווית, אירועים אלה נחשבים חפצי הצביעת. המחט FITC התווית, אשר מחוברים התאים אך לא הפנימו, התאים לעבד גם חיובי עבור FITC אך גם לספק יעד עבור הנוגדן anti-FITC ההופך תאים אלה כפול חיובי עבור FITC ו APC (FITC +, APC +). כאשר מנותח המיקרוסקוזה, האוכלוסיה הכילה עד 20% מהתאים עם מחט מצורפת רק בניסויים שלנו.
באמצעות הנוגדנים המתוארים בפרוטוקול זה ובעקבות האסטרטגיה של הפעלת התוכנית באיור 1,מלווה כללי של לוקיציטים אנושיים על ידי מאפייני fsc ו-מדינת אס-אס ואחריו הפרדה של לוקיציטים ומחט בחינם על-ידי סמן CD45 המחבת. במיוחד כאשר משתמשים בעצי מחט נפוחים ו/או בזמני הדגירה הארוכים, המחט יכולה להגיע לגודל כמעט תאים בזמן הזרימה cy, ולכן ניתוח הטיה. מאז מונוציטים הראשי האדם ו נויטרופילים לקחת את המחט אחרת, פרוטוקול זה מאפשר לנתח בנפרד את האוכלוסייה הזאת בהתבסס על הצביעת עם CD14 היוחסין של השושלת היטב סמנים מונוציטים ו CD66b עבור נויטרופילים. ביצוע של שליטה על אוכלוסיות התאים ומחסיד מבוסס על דגימות בקרה עם מחט בלתי מסומן כי לסחוב לא FITC או האות האנטי-FITC. כאשר APC ו-FITC מותווים זה נגד זה, הרבעים מוגדרים בצורה כזאת, כי מקסימום של 1% תאים מותרים בשערי הריבית.
אחוז הפגוציטים העיקרי של הגוף האנושי יכול להיות משתנה מאוד בקרב תורמי דם, אלא גם תלוי בגורמים הניסיוניים כגון זמן דגירה ומצב הנפיחות של המחט. הפנמה נבג ניתן להבחין לאחר 0.5 h של שיתוף הדגירה כבר ומגדיל עם הזמן (איור 2א). מחט נפוחה מראש נלקחים בקלות יותר ממנוחה (לא נפוחות) נבגים אפילו בזמני הדגירה הקצרים (איור 2ב). אם המחט הם קבועים עם פורמלדהיד, phagocyציטוזה הוא פחתה לעומת המחט המקורית (איור 2ג).
| ריאגנט | μl לכל מדגם |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b PerCP-Cy 5.5 | 1.5 |
| נגמ ש נגד FITC | 0.5 |
| ערוץ PBS + 2 מ"מ | 97 |
| כולל | 100 |
טבלה 1: הנוגדן לערבב עבור cy, הזרימה. כמויות של כל מגיב מוענק כמיקרו ליטר למדגם (1 x 106 תאים) כדי להיות מנותח.
איור 1: התקנה וניתוח של שיטת הזרימה של הציטוציטוציטוזה. (א) ערכה של הפרוטוקול כולל מחט והכנה לתאים וכתמים מנגד. (ב) phagocyציטוזה מנותח על ידי התוויית נתונים של הציטוטומטלי הזרימה של המחט fitc התווית נגד הנגמ ש ANTI-fitc נגד כתמים. אוכלוסיות כתוצאה מציינות אחוזים של לוקיציטים ללא אינטראקציה (FITC-, APC-), לוקיציטים עם עצי מחט (fitc +, apc +) ו-phagocytosing לוקיולוציטים (fitc +, apc-), כמו גם לצביעת חפצים (FITC-, APC +). (ג) אוכלוסיית תאים חיובית כפולה מ -3 ניסויים שונים עם 3 תורמים שונים (שניים מהם ביצעו בכפולות, אחת בוצעה) היו מיקרוסקותיים שנספרו לפנימו ומצורפות רק מחט. (ד) נציג האסטרטגיה של זרימת נתוני הזרימה לזיהוי לוקיולוציטים (CD45), זהה את מונוציטים (CD14) ונויטרופילים (CD66b) וקבע אוכלוסיות אינטראקציה (fitc, ANTI-fitc). דמות זו שונתה מהרטונג ואח ', Cy, 95:3, עמ' 332-338 (2019)14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פאיגוציטוזה של המחט על ידי phagocytes האדם העיקרי תלוי בכמה תנאים. (א) אחוז התאים החוצה את עצי המחט המונחים בזמןהדגירה המשותף. (ב) פאיגוציטוזה גדל עם זמן הנפיחות con, כאשר שיתוף ב-0.5 h. (ג) מחט מקורית הייתה יותר מאשר מחט מלאכותית קבועה. הנתונים התקבלו מ 10 תורמים שונים (a, b) או 5 תורמים שונים (c) ב 10 (א, ב) או 5 (ג) ניסויים עצמאיים. קווי שגיאה מציינים את SD. דמות זו שונתה מהרטונג ואח ', Cy, 95:3, עמ' 332-338 (2019)14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח של phagocyציטוזה הוא אמצעי להעריך את הפונקציונליות של phagocytes הראשי האנושי ואפיון תבניות רלוונטיות קליניות. (א) השוואה למופת של מונוציטים מתורם בריא וחולה חיסוני מודחק (לאחר השתלת תא גזע המטבית) phagocytosing במנוחה המחט עבור 0.5 h, 2 h ו 4 ה. (ב) פאיגוציטוזה של מנוחה מחט פטרייתי נקבע עבור מינים הרלוונטיות קלינית אספרגינוס ו mucorales לאחר 2 שיתוף הנתונים התקבלו מ 5 (אספרגינוס) או 3 (mucorales) תורמים שונים 5 או 3 ניסויים עצמאיים כל אחד. קווי שגיאה מצביעים על SD. קיצורים: א. אספרגינוס, ל' ליכטמיה, מ. מוקור, ר. רג'ה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטת הזרמה מהירה של הסייטוטומטל למדוד אינטראקציה של המחט. בעלת מספר רב של לוקיציטים אנושיים מרכזיות שאינן אפשריות בפרוטוקולים מיקרוסקופים משותפים. הדמיה תאים עם מיקרוסקופ באופן ידני לספור הפניהמחט היא מסורבלת יכול להיעשות בצורה מציאותית עבור כמה מאות תאים בלבד. הארגון מתגבר על בעיה זו על ידי מדידת אלפי תאים בתוך דקות. משוכה המשותפת לשתי הגישות היא ההבחנה בין המחט לבין מחטניים ובתאים, בהתאמה. במיקרוסקופיה, הצבע הלבן משמש לעתים קרובות לצביעת עצי מחט, אך השימוש בו מוגבל למיקרואורגניזמים עם קיר תא המכיל כדוריות-העור.
פרוטוקול זה בניגוד בשימוש fluorophores ברורים לאפיון אירועים אינטראקציה המאפשרת תוספת של סמנים תא נוסף, כגון סמני השושלת CD45, CD14 ו CD66b. לפיכך, ניתן גם להפלות את phagocyציטוזה של פתוגנים על ידי מונוציטים ו נויטרופילים במדגם אחד. בעוד הבחירה של סמנים fluorophores עבור זיהוי התא ניתן להתאים את הצרכים של הניסוי ואת הקיבולות של cytometer השימוש של הנוגדן הספציפי APC נגד FITC המוזכרים בפרוטוקול זה מומלץ כפי שהיה נוגדן האמין ביותר בידינו.
מאז פורמלדהיד-מחט קבוע אינם הפנימו היטב, נבגים מקומיים מומלצים עבור phagocyציטוזה assays. עם זאת, מחט טבעית תתחיל או להמשיך נפיחות במהלך הדגירה המשותף עם לוקיציטים האדם ובסופו של דבר לנבוט. בדרך כלל, א. חיטוי המחט לנבוט לאחר כ 8-9 h ב גלוקוז המכיל מדיה ב 37 ° c. השילוב של זמן נפיחות ושיתוף הזמן הדגירה עם phagocytes לא יעלה על מסגרת זו הפעם כמו נביטה גורם לאובדן של FITC על פני השטח מחט. יותר חשוב, הגררונים לא יכולים להיות מגוחים יותר על ידי מונוציטים או נויטרופילים. במקום, phagocytes אלה להצטבר מסביב ולדבוק germlings כי לייצר אשכולות תא החוסמים את cytometer אם לא הוסרו. באופן דומה, 4 שעות המחט נפוחות נוטים ליצור אשכולות בינם לבין עצמם עם תאים. לעתים קרובות אשכולות אלה לא יכולים להיות מופרדים מכנית יותר התאים בתוך יאבדו לניתוח הזרימה cytometric.
למרות שה "מאוד פשוטה וקלה בהתחלה, יותר מעצי המחט הפנימו על-ידי תאים, העליה הבטושטשת עשויה להיות. באמצעות MOIs > 2 מגביר את phagocyציטוזה בנקודות הזמן הראשוניות, אך בעיות שעלולות להתעורר מוקדם יותר גם כן. לכן יש לקבוע את מוהר בזהירות עם התאים הספציפיים וגורמי העניין.
הגבלה של פרוטוקול זה הוא בדואליות של אוכלוסיית התאים עם מחט מדומה (FITC + APC +) זה יכול להיות גם מחסה תאים עם חסיד, כמו גם הפנפידיה. אפשרות לאפליה נוספת היא היישום של זרימת ההדמיה cy, הדמיה15 המאפשר הדמיה חזותית של כל התאים נמדד cytometry הזרימה.
בשל התיוג הבלתי ספציפי fitc של הקיר התא con, שיטה זו ניתן להעברה בקלות לפטריות אחרות של עניין כגון תבניות רלוונטיות קלינית של סוג mucorales או קנדידה השמרים אלביקנס. יתר על כן, גם קיר תא הנושאת חיידקים יכול להיות מתויג FITC. הנוגדן האוניברסלי עם נוגדנים נגד FITC מאפשר מדידה מהירה וקלה של phagocyציטוזה של כל הפתוגנים האלה כאחד על ידי מספר גדול של לוקיציטים אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לגברת פיה שטיר על סיוע טכני מעולה. מ. פון לילינפלד-Toal הוא נתמך על ידי המרכז לבקרת אלח דם וטיפול (משרד הפדרלי הגרמני של החינוך והבריאות, BMBF, FKZ 01E01002) והנגועים בקמפוס המחקר הגנוסטים (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai ואנג נתמך על ידי בית הספר היינה של תקשורת מיקרוביאלית (דויטשה פורשונגסביסםגיסמייססבאחאי, FKZ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
