Måle fagocytose av Aspergillus fumigatus Conidia av menneskelige leukocytter bruker Flow flowcytometri
Summary
Denne protokollen gir en rask og pålitelig metode for å kvantitativt måle fagocytose av Aspergillus fumigatus conidia av menneskelig primære phagocytes bruker flyt flowcytometri og å diskriminere fagocytose av conidia fra bare vedheft til leukocytter.
Abstract
Invasiv lungeinfeksjon av mold Aspergillus fumigatus utgjør en stor trussel mot immunsupprimerte pasienter. Inhalert fungal conidia (sporer) er ryddet fra den menneskelige lunge alveoler ved å være phagocytosed av medfødte monocytter og/eller nøytrofile. Denne protokollen gir en rask og pålitelig måling av fagocytose ved å flyte flowcytometri ved hjelp av fluorescein isothiocyanate (FITC)-merket conidia for co-inkubasjons med menneskelige leukocytter og påfølgende counterstaining med et anti-FITC antistoff for å tillate diskriminering av internalisert og celle-tilhenger conidia. Store fordeler av denne protokollen er dens rapidness, muligheten til å kombinere analysen med analytiske analyse av andre celle markører av interesse, samtidig analyse av monocytter og nøytrofile fra en enkelt prøve og dens anvendelighet til andre cellevegg-bærende sopp eller bakterier. Fastsettelse av prosenter av phagocytosing leukocytter gir et middel til å mikrobiologer for å evaluere virulens av en patogen eller for å sammenligne patogen wildtypes og mutanter samt å immunologer for å undersøke menneskelig leukocytter evner å bekjempe patogener.
Introduction
Invasiv lunge aspergillose er en stor trussel mot immunsupprimerte pasienter som behandlingstilbud er begrenset og bare vellykket ved tidlig diagnose, noe som fører til høy dødelighet1. Smittsomme midler er conidia (sporer) av mold Aspergillus fumigatus som er allestedsnærværende til de fleste habitater2. Conidia er inhalert, passerer gjennom luftveiene og kan endelig gå inn i lunge alveoler. I immunkompetente mennesker, disse conidia er ryddet av medfødte immunceller som monocytter eller makrofager og nøytrofile granulocytter, som tar opp (fagocyttere) og fordøye patogener3. Fagocytose er viktig for mikrobiologer og immunologer likeså når interessert i Host-patogen interaksjoner. Konfrontasjon analyser, slik som co-inkubasjons av leukocytter og conidia, ofte inkluderer merking av sporer av fluorescein eller dets avledede fluorescein isothiocyanate (FITC). Ved hjelp av et mikroskop, er det enkelt å identifisere internalisert fluorescerende conidia og å bestemme vedlagt/tilhenger conidia, selv om denne tilnærmingen er tungvint og realistisk begrenset til noen få hundre celler4. Men i Flow flowcytometri som lett tillater analyse av hundretusener av celler i løpet av minutter, differensial farging av phagocytosed og tilhenger conidia er avgjørende. Derfor er mange protokoller stole på Trypan blå å slukke FITC-fluorescens fra tilhenger conidia5,6,7,8. En annen tilnærming er å utnytte fluorescens resonans energi overføring av etidiumbromid bromide og FITC å avgi rød i stedet for grønne fluorescens fra tilhenger conidia9,10,11. Hvis spesifikke antistoffer er tilgjengelige, slik tilfellet er for enkelte bakterier, kan celle bundne partikler være direkte beiset12,13.
Her presenterer vi en protokoll for å raskt og kvantitativt vurdere fagocytose av FITC-merket a. fumigatus conidia av menneskelige leukocytter sammen med vedlegg av sporer til celler og mangel på interaksjon ved å ansette en ALLOFYKOCYANIN (APC)-kombinert anti-FITC antistoff. Metoden gir også mulighet for samtidig flyt analytiske analyse av ytterligere celle markører som kan benyttes for egen analyse av fagocytose av monocytter og nøytrofile fra samme prøve.
Protokollen kan anvendes for karakterisering av sopp stammer (f. eks, flere arter av Aspergillus og andre former fra slekten Mucorales presentert her) og deres mutanter14 og immunologiske forskning på phagocytes, slik som leukocytter fra immunsupprimerte individer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen presenterer en rask flyt analytiske metode for å måle interaksjon av a. fumigatus conidia med et stort antall primære menneskelige leukocytter som ikke er mulig i vanlige mikroskopiske protokoller. Imaging celler med et mikroskop og manuelt telling internalisert conidia er tungvint og realistisk kan gjøres for et par hundre celler bare. Flow flowcytometri overvinner dette problemet ved å måle tusenvis av celler i løpet av minutter. Et hinder felles for begge tilnærminger er skillet mell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker fru Pia stier for utmerket teknisk assistanse. M. von Lilienfeld-toal er støttet av Center for sepsis kontroll og omsorg (det tyske føderale departementet for utdanning og helse, BMBF, FKZ 01E01002) og InfectoGnostics Research campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc mai Hoang er støttet av Jena School of mikrobiell Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
