Этот протокол обеспечивает быстрый и надежный метод количественного измерения фагоцитоза Aspergillus fumigatus conidia человеческими первичными фагоцитами с использованием цитометрии потока и дискриминировать фагоцитоз конидии от простого прилипения к лейкоцитам.
Инвазивная легочная инфекция плесенью Aspergillus fumigatus представляет большую угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом. Вдыхаемые грибковые конидии (споры) очищаются от альвеолов легких человека путем фагоцита врожденными моноцитами и/или нейтрофилов. Этот протокол предлагает быстрое и надежное измерение фагоцитоза цитометрией потока с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC) с маркировкой кониии для совместной инкубации с человеческими лейкоцитами и последующего противопоразрезания с анти-FITC антитела, чтобы позволить дискриминации интернализированной и клеточной приверженности conidia. Основными преимуществами этого протокола являются его быстрота, возможность совмещения анализа с цитометрическим анализом других клеточных маркеров, представляющих интерес, одновременный анализ моноцитов и нейтрофилов из одного образца и его применимость к другим клеточным настенным грибам или бактериям. Определение процентных долей фагоцитов лейкоцитов предоставляет микробиологам средства для оценки вирулентности патогена или для сравнения патогенных диких типов и мутантов, а также иммунологов для исследования возможностей лейкоцитов человека по борьбе с патогенными микроорганизмами.
Инвазивный аспергиллез легких представляет большую угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом, так как варианты лечения ограничены и успешны только при ранней диагностике, что приводит к высокой смертности1. Инфекционные агенты conidia (споры) формы Aspergillus fumigatus, которые повсеместно в большинстве мест обитания2. Conidia вдыхаются, проходят через дыхательные пути и может, наконец, войти в легких альвеолы. У иммунокомпетентных людей, эти конидии очищаются врожденными иммунными клетками, такими как моноциты или макрофаги и нейтрофильные гранулоциты, которые занимают (фагоциты) и переваривают патогены3. Фагоцитоз имеет важное значение для микробиологов и иммунологов также, когда заинтересованы в принимающей патогенвзаимодействия взаимодействия. Конфронтационные анализы, такие как совместное инкубацию лейкоцитов и конидии, часто включают маркировку спор флуоресценгом или его производным флуоресцеем изотиоциана (FITC). Используя микроскоп, это просто определить интернализированные флуоресцентные конидии и определить прилагается / приверженец conidia, хотя этот подход является громоздким и реально ограничивается несколько сотен клеток4. Однако, в потоке цитометрии, которая легко позволяет анализ сотен тысяч клеток в течение нескольких минут, дифференциальное окрашивание фагоцитозных и приверженцев conidia имеет жизненно важное значение. Таким образом, многие протоколы полагаются на Trypan Blue, чтобы утолить FITC-флуоресценцию от адепта conidia5,6,7,8. Другой подход является использование флуоресценции резонанса передачи энергии бромида этидия и FITC излучать красный вместо зеленого флуоресценции от приверженца conidia9,10,11. Если конкретные антитела доступны, как и в случае с некоторыми бактериями, клеточные частицы могут быть непосредственно окрашенных12,13.
Здесь мы представляем протокол для быстрой и количественной оценки фагоцитоза FITC-маркировки A. fumigatus conidia человеческими лейкоцитами наряду с прикреплением спор к клеткам и отсутствием взаимодействия, используя аллофикоцианин (APC)-связанные антитела FITC. Метод также позволяет одновременно цитометрический анализ потока дальнейших маркеров клеток, которые могут быть использованы для отдельного анализа фагоцитоза моноцитами и нейтрофиловизмом из того же образца.
Протокол может быть применен для характеристики грибковых штаммов (например, несколько видов Аспергилл и других форм из рода Mucorales представлены здесь) и их мутантов14 и иммунологических исследований на фагоциты, такие как лейкоциты от иммунокомпромиссных лиц.
Этот протокол представляет собой метод быстрого потока цитометрического измерения взаимодействия A. fumigatus conidia с большим количеством первичных человеческих лейкоцитов, что невозможно в общих микроскопических протоколах. Воображение клеток с микроскопом и вручную подсчета интер?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим г-жу Пиа Стьера за отличную техническую помощь. М. фон Лилиенфельд-Тоал поддерживается Центром контроля и ухода за сепсисом (Федеральное министерство образования и здравоохранения Германии, BMBF, ФКЗ 01E01002) и исследовательским кампусом InfectoGnostics (BMBF, ФКЗ 13GW0096D). Тхи Нгок Май Хоанг поддерживается Школой микробной коммуникации Джены (Deutsche Forschungsgemeinschaft, ФКЗ 214/2)
Adhesive foil | Brand | 701367 | |
anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |