Summary
Neuronal fiber længde inden for en tre-dimensionel struktur i en hjerne region er en pålidelig parameter til at kvantificere specifikke neuronal strukturel integritet eller degeneration. Denne artikel beskriver en stereologisk kvantificeringsmetode til måling af kolinerge fiberlængde i meynerts kernebasalis i mus som et eksempel.
Abstract
Længden af kolinerge eller andre neuronal axoner i forskellige hjerneregioner er ofte korreleret med den specifikke funktion af regionen. Stereologi er en nyttig metode til at kvantificere neuronale profiler af forskellige hjernestrukturer. Her leverer vi en software-baseret stereologi protokol til at vurdere den samlede længde af kolinerge fibre i kernen basalis af Meynert (NBM) af basal forhjernen. Metoden bruger en rumkuglesonde til længdeestimater. De kolinerge fibre visualiseres ved cholin acetyltransferase (ChAT) immunfarvning med peberrod peroxidase-diaminobenzidin (HRP-DAB) detektionssystem. Farvningsprotokollen gælder også for fiber- og cellenummerestimering i forskellige hjerneområder ved hjælp af stereologisoftware. Stereologi protokollen kan bruges til estimering af eventuelle lineære profiler såsom kolinoceptive fibre, dopaminerge/catecholaminergic fibre, serotonergic fibre, astrocyt processer, eller endda vaskulære profiler.
Introduction
Kvantitative skøn over længden og/eller tætheden af nervefibre i hjernen er vigtige parametre for neuropatologiske undersøgelser. Længden af kolinerge, dopaminerge, og serotonerge axoner i forskellige hjerneregioner er ofte korreleret med de specifikke funktioner i regionen. Fordi fordelingen af disse axoner er generelt heterogen, design-baseret stereologi bruges til at undgå bias under prøveudtagning. Rumkuglesonden af stereologi er designet til at give effektive og pålidelige foranstaltninger af linjelignende strukturer såsom neuronale fibre i en region af interesse1. Sonden gør en virtuel kugle, der pålægges systematisk i vævet til at måle linje skæringspunkter med overfladen af sonden. Fordi det er umuligt at sætte sfære sonder i vævet til analyse, den kommercielt tilgængelige software giver en virtuel tre-dimensionelle (3D) kugle, som er dybest set en række koncentriske cirkler af forskellige diametre, der repræsenterer overfladen af kuglesonden.
Selektiv kolinerge neurodegeneration er en af de konsekvente træk ved Alzheimers sygdom (AD)2,3,4. Dysfunktionel kolinerge transmission betragtes som en årsagsfaktor for kognitiv tilbagegang i AD. Kolinerge dysfunktion er også tydeligt i mange andre psykiske lidelser såsom Parkinsons, afhængighed, og skizofreni. Forskellige aspekter af kolinerge neurodegeneration er undersøgt i dyremodeller (f.eks reduktion i acetylcholin5, ChAT protein6, kolinerge fiber neurodegeneration i nærheden af amyloid plaques6, og fald i kolinerge fibre og synaptic varicosities7,8). Fiber degeneration menes at finde sted tidligere end neuronal tab, fordi kolinerge neuronal tab ikke altid observeres i undersøgelser. De fleste af de kolinerge neuroner er i de basale forhjernen og hjernestammen, og deres axoner projekt til forskellige hjerneregioner såsom korticeer og hippocampus. NBM er beliggende i basal forhjernen og viser sig at være en af de almindeligt ramte hjerneområder i AD.
Den fraktioneret metode stereologi er baseret på systematisk stikprøveaf et væv på flere niveauer. Sektionsprøvefraktion (SSF) er den ikke-computerbaserede systematiske prøveudtagning af sektioner til fraktionerets tenologiske metode. Arealprøvetagningsfraktion (ASF) er fraktionering af et område i området af interesse for sektionen. Tykkelse sprøveudtagning fraktion (TSF) er fraktioneringen af tykkelsen af en sektion. Rumkuglesonden giver os mulighed for at kvantificere interesseprofiler i en 3D-kugle på fraktionerede steder. Her bruger vi en rumkuglesonde til estimering af den samlede længde af kolinerge fibre i NBM af musehjernen til at illustrere procedurerne. Den nuværende protokol indeholder oplysninger om vævsbehandling, prøvetagningsmetoder til stereologi, immunhistokemisk farvning ved hjælp af ChAT antistof, og upartisk stereologi til at vurdere kolinerge fiber længde og fibertæthed i NBM af musen shjerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer for brug af disse dyr er blevet godkendt af Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Atten måneder gamle mus overudtrykker svenske mutant beta-amyloid prækursor protein (ApPswe) og deres C57/BL6 WT littermates blev brugt til forsøgene. Nærmere oplysninger om avl og genoyping er givet i He et al.8.
1. Perfusion og vævsbehandling
- Bedøve mus ved hjælp af en intraperitoneal injektion med ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg). Knibe tæer for at bekræfte en manglende respons, før du fortsætter9.
- Tværgående gennemsyremed ~ 50 ml iskold 0,1 M Dulbecco's fosfat buffered saltvand (DPBS) efterfulgt af 4% paraformaldehyd (PFA) i 0.1M fosfat buffer (PB)10.
FORSIGTIG: PFA er giftig. Brug personlige værnemidler (PPE), når du arbejder med PFA. - Fjern hjerner10 og nedsænkes i 4% PFA i 0,1 M PB ved 4 °C til postfixing i 24 timer. Vask med DPBS 3x.
- Skift til 15% saccharoseopløsning i 0,1 DPBS natten over og derefter 30% saccharoseopløsning i 0,1 M DPBS for yderligere 48 timer ved 4 °C.
- Vævet fjernes fra saccharoseopløsningen, og fryses i et kryotomkammerforudindstilling til en temperatur på -20 °C. Frosne prøver kan opbevares i forseglede rør ved -80 °C indtil skæring.
- Integrer væv i optimalt skæretemperaturindlejringsmedium (se Materialetabel)og montering på en prøveskive. Skær serielle 30 μm tykke sektioner i et koronalplan ved hjælp af et kryotomog saml alle sektioner derfor i 24 brøndkulturplader fyldt med kryobeskyttende opløsning (30% glycerol, 30% ethylenglycol, 40% DPBS; Figur 1A-C). Opbevares i en -20 °C fryser.
BEMÆRK: Tykkere sektioner (f.eks. 50 μm) er at foretrække, når det er muligt. Sørg for, at sektionerne holdes i skæreklar stand, og at alle sektioner er helt i kryobeskyttende. En 96 brøndplade kan bruges som et alternativ til 24 brøndplader til at samle sektioner. - Dæk brøndene med pladetætningsmiddel for at forhindre fordampning og tørring. Pladerne opbevares ved -20 °C indtil videre brug. Sektioner, der opbevares ved -20 °C, er stabile i flere måneder for ChAT-immunhistokemi.
2. Systematisk sektionsudvælgelse for IHC
BEMÆRK: Der bør foretages en pilotundersøgelse for at kende det samlede antal sektioner, der er nødvendige for at opnå en acceptabel fejlkoefficient.« CE-værdien er et udtryk for den samlede fejlmængde i prøveudtagningsproceduren. Den laveste værdi repræsenterer den minimale fejl , og en CE-værdi, der er lavere end 0,1 , anses for acceptabel af den software , der bruges her (se Materialetabellen)11.
- Identificer de første og sidste afsnit for hver hjerne ved at sammenligne morfologiske træk med en standard mus hjerne atlas såsom Franklin og Paxinos. NBM begynder ved bregma -0,0 mm og slutter ved -1,6 mm. Derfor indeholder omkring 50 sektioner NBM. Det samlede antal sektioner er en af de parametre, der kræves under stereologi. Udvælgelsen af hver8. sektion (SSF = 1/8) gav i alt 6-7 sektioner til analysen og gav et acceptabelt CE for både volumenestimering og fiberlængdevurdering i vores pilotundersøgelse.
- Tilfældigt starte med en af de første otte sektioner og derefter systemisk prøve hver 8th sektion indtil den sidste bageste sektion, der indeholder NBM (Figur 1C).
3. Immunhistokemi
- Overfør de kryoreserverede sektioner til stuetemperatur i kryobeskyttelsesmiddel og derefter 0,1 M fosfat buffer (PB) i 6 brøndplader.
- Vask 3x i PB.
- Inkuberi i 0,3% H2O2 i methanol i 15 min.
- Vask 3x i Tris-buffered saltvand (TBS).
- Inkuberi i 0,25% Triton X-100 i TBS i 30 min.
- Blok er blokeret med 10% normalt kvægserum (NBS) i 0,1% Triton X-100 i TBS i 30 min.
- Inkubermed 1:1.000 fortynding af gede anti-humanChAT primære antistoffer (se Tabel over materialer)i TBS med 0,1% Triton X-100 og 1% NBS for 48 h ved 4 °C.
- Vask 3x i TBS ved stuetemperatur. Udfør alle yderligere inkubation og vask ved stuetemperatur.
- Inkuber med biotinylated kvæg anti-ged sekundært antistof (se Tabel over materialer)i 1 time.
- Vask 3x i TBS.
- Inkubere med avidin-biotin-peroxidase kompleks (se Tabel over materialer).
- Vask 3x i TBS.
- Udvikl ved hjælp af en forbedret DAB peroxidase substratopløsning (se Materialetabel)i henhold til producentens anbefalinger.
FORSIGTIG: DAB er et formodet kræftfremkaldende stof. Det er giftigt ved kontakt og indånding. Brug PPE, når du arbejder med DAB. - Vask sektionen et par gange med destilleret vand og opbevares i Tris pH = 7,6.
- Monter sektionerne på gelatiniserede dias. Alle sektioner fra ét væv kan sættes på samme dias. Luft tørre sektioner, dehydrere 2x for 5 min hver med 70%, 90%, 95%, og 100% ethanol, og derefter rydde sektioner med to 10 min xylen vasker. Dæksel sektionerne ved hjælp af monteringsmedium (se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Behandlingstiden for dehydrering og clearing påvirker tykkelsen af sektionerne. Derfor bør de samme betingelser anvendes for alle sektioner. I den aktuelle undersøgelse var gennemsnitsværdien for den endelige tykkelse 21,11 ± 0,45 μm. - Hold sektionerne i røghætten tørre. De tørre sektioner er klar til stereologi.
4. Stereologi
BEMÆRK: Se materialetabellen for det anvendte mikroskop og den anvendte software. En nedsænkning smålsætning med en numerisk blænde (NA) > 1,2 vil være nyttig og bør anvendes, hvis det kræves. Slides skal grupperes efter genotype eller behandlingsgruppe og kodes. Den fuldstændige stereologi for en undersøgelse bør udføres af den samme person , og den person , der udfører stereologien , skal være blind for identiteten af de enkelte dias eller grupper , der undersøges1,12,13.
- Åbn en ny undersøgelse i softwaren. (Fil > Ny undersøgelse). Dialogboksen'Studieinitialisering'åbnes. Udfyld undersøgelsesoplysningerne ved hjælp af multiniveau (fraktionbaseret) (figur 2A).
- Dobbeltklik på 'Volume' under Parametre, som åbner dialogboksen Lydstyrke. Navngiv funktionen af interesse, og vælg 'Region Point Counting' sonde. Klik på Næste.
- Dobbeltklik på den næste parameter, 'Længde'.
- Angiv et navn på funktionen (f.eks.
- Klik derefter på dialogboksen 'Studieinitialisering',som åbner boksen'Case Initialization'. Udfyld sagsoplysningerne. Grupper skal kodes, før undersøgelsen påbegyndes. Det samlede antal sektioner er antallet af sektioner fra første afsnit, der indeholder det interesseområde, der indeholder interesseområde (se trin 2.1). Sektionsprøveintervallet er otte, fordi hver8.
- Hvis du klikker på Næste, åbnes dialogboksen 'Sondeinitialisering',som automatisk angiver den laveste forstørrelse for områdevalg og volumenestimering. Bekræft indstillingerne, og kontroller, om interesseområdet kan identificeres ved den valgte lavere forstørrelse. Dobbeltklik på'Volume' og fyld 50.000 μm3 pr. punkt for områdevolumenfraktionen. Klik på Udført.
- Angiv Længde til 63x eller 100x under Objekt (høj). Dobbeltklik på 'Længde' for at åbne dialogboksen Længde-kugle og indstille diameteren af kuglen til 10 μm. Klik på Udført.
BEMÆRK: Beskyttelseszonen skal bestemmes på grundlag af sektionernes faktiske tykkelse. Operatøren skal kontrollere tykkelsen af sektionerne på flere steder for at undgå skader. Om nødvendigt justeres skærmzonens tykkelse baseret på sektionstykkelse. - Angiv passende værdier for rammeområde, rammehøjde, beskyttelseszone og rammeafstand.
BEMÆRK: Disse værdier afhænger af heterogeniteten af objektprofilerne (fibre) i studieområdet. Et rammeareal på 400 μm2,rammehøjde på 10 μm, beskyttelseszone på 2 μm, og rammeafstand på 300 μm giver acceptable CE-værdier for fiberlængdeestimering i NBM. Der skal udføres en pilotundersøgelse med disse værdier, før der går til næste sag. - Følg vejledningen fra softwaren efter hvert trin. Instruktionerne vises enten som en dialogboks og/eller nederst på skærmen.
- Indsæt sektion 1.
- Ved lav forstørrelse (5x) skal du definere interesseregionen ved at skabe en vilkårlig grænse omkring NBM. Klik på knappen Næste i venstre hjørne af videovinduet. Følg vejledningen og bekræft alle grønne punkter er i NBM. Pointene kan medtages eller udelades ved at klikke på pointene.
BEMÆRK: Der er ingen klar, indstillet grænse omkring NBM. Udvælgelsen er for det meste investigator-defineret. Den ChAT + kolinerge neuroner af NBM kan observeres i den interne kapsel (ic) og globus pallidus (GP). I denne protokol er ic med ChAT+ kolinerge neuroner og deres fremskrivninger (fibre) og hele gp inkluderet i NBM(Figur 1D). - Følg instruktionerne og skift til 63x for fiber målinger på den nuværende fraktion. Dialogboksen 'Sektionstykkelse'vises på skærmen. Indstil sektionens øverste og nederste overflade for at måle sektionens faktiske tykkelse. Den manuelle Z-aksebevægelse skal anvendes. Klik på Udført.
BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen fiber i området, kan trinnet springes over for at gå til den næste brøkplacering. - Flyt Z-aksen langsomt fra top til bund i sektionens rammehøjde, og markér alle krydsende fibre på overfladen af den virtuelle kuglesonde (Figur 3). Når det er gjort, skal du klikke på Næste for at gå til den næste placering.
- Når du har fuldført alle brøker, vil softwaren bede om at indsætte næste afsnit. Gentag trin 4.9-4.12 for alle seks eller syv dele af vævet.
- I slutningen vil softwaren generere et resultat for sagen, der viser CE-værdierne (figur 4). Hvis CE er acceptabelt, skal du gå videre til næste sag. Fil > Ny sag. Hvis CE ikke er acceptabelt (figur 4A), giver softwaren anbefalinger til at ændre nogle af parametrene. I mange tilfælde reducerer hvis du formindsker rammeafstanden CE-værdierne til et acceptabelt interval (figur 4B).
- Når du har fuldført alle tilfældene, skal du generere resultater for hver sag og gruppe (Filer > Resultater).
5. Analyse og statistik
- Softwaren indeholder data for hver prøve og hver gruppe. Selve softwaren beregner fraktioner som SSF, ASF og TSF og leverer den samlede referencevolumen (VREF) og den samlede længde (L) af fibrene i referenceområdet (i dette tilfælde NBM) (figur 4B). Eksporter dataene, og gem eller kopiér til den statistiske foretrukne software til mellem gruppeanalyse. Tabel 1 viser typiske resultatdata for statistisk analyse. Analysér fibertæthed (Lv) ved at dividere den samlede fiberlængde med referencevolumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater er vist i tabel 1 og figur 5. Gruppe C, som blev afkodet som ApPswe gruppe (APP), havde betydeligt lavere fiberlængde(Figur 5B)og fiber længdetæthed (Figur 5C) i forhold til deres vilde type (WILD) littermates. Resultaterne viste, at der ikke var nogen signifikant forskel i nbm-mængden mellem de to analyserede grupper (figur 5A).
Figur 1: Illustration af vævsbehandling og prøveudtagning, der anvendes i denne undersøgelse. Prøveforberedelse og prøveudtagning. (A) Cerebellum og olfaktoriske pære fjernes før montering på prøveskiven. (B) Hjernens orientering på prøveskiven til sektionsskæring. En lavvandet langsgående snit (markeret med en linje) på den ene halvkugle hjælper med at identificere den side af hjernen i sektionerne. C) Skemadiagram over en 24 brøndplade, der viser systematisk udvælgelse af hver8. (D) Skemadiagram over koronale sektioner, der afgrænser NBM's grænser i de systematisk udvalgte seks sektioner. (E-G) Repræsentative billeder af koronale sektioner immunplettet for ChAT og placering af NBM (skitseret). (H) Et højt forstørrelsesbillede, der viser NBM-grænserne. LV = lateral ventrikel; VL = ventrolateral thalamic kerne; ic = intern kapsel; GP = globus pallidus; CPu = caudate putamen (striatum); NBM = kernen basalis af Meynert (repræsenteret som 'B' i Franklin og Paxinos mus atlas). Skalastang = 1 mm (E-G), 200 μm (H). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skærmbillede af billeder. (A) 'Undersøgelse Initialisering' (B) 'Case Initialization' og (C) 'Sonde Initialisering' dialogbokse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kuglesonde ved hjælp af en optisk dissektor. Repræsentant screenshot billeder, der viser de fire planer i en kugle og mærkning af krydsende fibre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater. A) udviser et uacceptabelt CE, ogb) udviser et acceptabelt CE for længdeoverslag. ASF, SSF og TSF for hvert enkelt tilfælde præsenteres også i resultaterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative data og analyser. Grafisk gengivelse af volumen (A),længde(B)og længdetæthed (C) i NBM i to grupper. Dataene blev analyseret inden for to forskellige grupper ved hjælp af Student t-test. *p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Gruppe | Tilfælde # | Volumen (μm^3) | Længde (μm) | Lv (μm/μm^3) |
| B | 1 | 926885302 | 16446282 | 0.018 |
| B | 2 | 856582400 | 19254528 | 0.022 |
| B | 3 | 1150520830 | 15980131 | 0.014 |
| C | 1 | 981056585 | 12108328 | 0.012 |
| C | 2 | 894169486 | 6905567 | 0.008 |
| C | 3 | 998618871 | 10359766 | 0.010 |
| Statistik | ||||
| Middelgruppe B | 977996177.3 | 17226980.33 | 0.018 | |
| SD Gruppe B | 153490036.6 | 1771309.218 | 0.004 | |
| Gennemsnitlig gruppe C | 957948314 | 9791220.333 | 0.010 | |
| SD Gruppe C | 55927744.89 | 2647567.494 | 0.002 | |
| TTEST B vs C | 0.84 | 0.02 | 0.049 | |
Tabel 1: Repræsentative data og analyser. Volumen- og længdeværdier blev direkte kopieret fra resultaterne fra stereologisoftwaren. Længdetætheden (Lv) blev beregnet ved at dividere længdeværdierne med volumenværdierne i hvert enkelt tilfælde. p-værdier blev beregnet ved hjælp af Elevens t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstrerer vi en metode til at vurdere tætheden af kolinerge fibre i NBM ved hjælp af en rumkugle (kugle) sonde. Denne sonde anslår den samlede fiberlængde i interesseområdet. Den samlede længde kan divideres med mængden af regionen for at få fibertætheden. For at anslå regionens volumen blev Kavalieri-pointtællingsmetoden anvendt. Cavalieri point count metoden er en upartisk og effektiv estimator af en 3D-referencevolumen for enhver region. Metoden beregner et skøn over arealet på en afskåret flade af en sektion ved at tælle punkter (der repræsenterer områdefraktioner) og derefter gange storre med afstanden mellem to analyserede sektioner11. Metoden kræver ikke arbejdskrævende, nøjagtig sporing af omkredsen af området af interesse. Det bruges sammen med optiske fraktioner til at vurdere tætheden af celler og fibre.
Stereologisk analyse kræver en præcis prøveudtagningsmetode. Hjernen sandområde af interesse bør defineres ordentligt med farvning. NBM ligger mellem AP bregma -0,0 mm til -1,6 mm pr. Franklin og Paxinos museatlas. For immunhistokemi bør sektioner vælges systematisk, tilfældigt, hvilket betyder, at det første afsnit skal udvælges tilfældigt, og derefter vælges andre sektioner systematisk. For en voksen musehjerne består NBM af ca. 1.600 μm (anterior-posterior), hvilket betyder ca. 53 koronale sektioner, der er 30 μm tykke. Hvis hver8. sektion er valgt, vil der være 6−7 sektioner, der kræves for at plette til stereologisk analyse. I vores sædvanlige procedure er 6−7 sektioner nok til at anslå det samlede antal kolinerge fibre i NBM. Analyse af CE foreslås til verifikation i begyndelsen af den metodologiske optimering12.
En ordentlig farvningsmetode er det grundlæggende krav for en undersøgelse. ChAT farvning for kolinerge fibre kan være udfordrende, og mange antistoffer pletter nogle af de cellulære dele, men ikke de fjerne axodendritic processer. Se vores tidligere beskrevne protokol for de relevante oplysninger om ChAT farvning8.
Metoden hovedsagelig kræver tykke sektioner, fordi histologisk behandling forårsager svind i vævet. Ideelt set er dele af mere end en 20 μm efterbehandling, endelig tykkelse (ofte tyndere end den oprindelige væv sektion tykkelse) er nødvendig for plads bold sonder. Derfor anbefales en sektionstykkelse på 50 μm. Krympningen er generelt ujævn, og det kan påvirke volumetriske forvrængninger i vævet og derfor ændre i Lv værdi. For eksempel blev der observeret en multifold forskel i kapillær længdetæthed, da den blev analyseret in vivo ved hjælp af multifoton imaging14,15. I betragtning af dette spørgsmål er det mere effektivt at rapportere længde pr. region i stedet for længde pr. volumen.
Selv om de givne værdier i protokollen fungerede perfekt, anbefales det altid til en pilotundersøgelse for en individuel undersøgelse. Efter at have udfyldt et enkelt vævsprøvetilfælde giver softwaren en CE-værdi for det valgte prøvetagningsdesign. CE-værdien bruges til at estimere estimatets præcision og kan beregnes med flere formler. Den software, der anvendes her bruger Gunderson's 1999 formel til at analysere CE og finder det acceptabelt, hvis værdierne er mindre end 0,11,16. Prøveudtagningskonstruktionsordningen bør justeres, indtil CE-værdien bliver acceptabel, før protokollen tilpasses andre prøver. Generelt reducerer et øget antal prøvetagninger (ved at reducere rammeintervallet) CE-værdien. Stort set ingen struktur i det biologiske system er en ideel linjeprofil, men bånd eller cylindre. Derfor, at beslutte den nøjagtige krydsende funktion på et fokuspunkt varierer fra person til person. Stereologien af alle prøver af en bestemt undersøgelse bør således udføres af samme person. For at undgå eventuelle skævheder skal stereologioperatoren være blind for eksempel-identifikatoren.
Reproducerbarhed er et stort problem i denne metode. En faktor er vævssvind og deformiteter under prøvebehandling , som til en vis grad kan overvindes ved hjælp af in vivo confocal mikroskopi13,14,15. Rumkuglen kræver høj kontrast farvning og god billedopløsning til at visualisere strukturer. Da fibre normalt ikke er i lineær form, er bestemmelsen af aflytninger for det meste operatørens beslutning. Automatiseret segmentering af histologiske træk er blevet foreslået for at løse dette problem. Dette er dog endnu ikke tilgængeligt13.
Fordelen ved at bruge stereologi er, at det giver en upartisk ordning til at analysere strukturer i et 3D-væv. Rumkuglesonden giver isotropiske fraktioner i vævsprøver og tilbyder derfor en upartisk tilgang til at kvantificere fiberlængde. En alternativ metode til at analysere fibertæthed en måling af den optiske tæthed af en histokemisk farvning. De farvningintensitetsbaserede metoder giver semikvantitativ vurdering af farvningstætheden og er måske eller måske ikke følsom nok til at differentiere ændringerne af kolinerge neuroner og fibre i NBM. Stereologiske metoder ved hjælp af rumkugle (kugle) sonden bruger bestemmelse af fibre baseret på deres visuelle egenskaber og giver estimering af den reelle længde af fibrene. Protokollen kan også bruges til at analysere andre lineære profiler i hjernen, såsom cholinoceptive fibre (ved hjælp af acetyl cholin esterase histokemi), dopaminerge eller katekolaminerge fibre (tyrosin hydroxylase immunse), serotonergic fibre (serotonin immunfarvning), vaskulære strukturer (CD31 immunfarvning), eller astrocyt processer (gliaial fibrille syreholdige protein, GFAP, immunfarvning)17,18,19,20,21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud til W.Z.S. fra Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimers Association (NPSPAD-11-202149), og ressourcer fra Midtvesten Biomedical Forskningsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. Unbiased Stereology-A Concise Guide. , Johns Hopkins University Press. (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered. Journal of Microscopy. 193, Pt 3 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
