マウス脳のマイナート核基底部におけるコリン作動性繊維長の立体的推定
Summary
脳領域の三次元構造内の神経線維の長さは、特定の神経構造の完全性または変性を定量化する信頼できるパラメータである。本稿では、マウスにおけるマイナート核内のコリン作動性繊維長を測定する立体定量法を例に説明する。
Abstract
様々な脳領域におけるコリン作動性または他の神経軸索の長さは、しばしば領域の特定の機能と相関している。ステアロジーは、様々な脳構造の神経細胞のプロファイルを定量化するのに有用な方法です。ここでは、基礎前脳のメイナート核(NBM)の基底にあるコリン作動性繊維の全長を推定するソフトウェアベースのステレロジープロトコルを提供します。この方法では、長さの推定にスペース ボール プローブを使用します。コリン作動性繊維は、西洋ワサビペルオキシダーゼ-ジアミノベンジジン(HRP-DAB)検出システムを用いたコリンアセチルトランスファーゼーション酵素(ChAT)免疫染色によって可視化される。染色プロトコルは、ステレロジーソフトウェアを用いた様々な脳領域における繊維および細胞数の推定にも有効である。このステレオロジープロトコルは、絨毛ノセプティブ繊維、ドーパミン作動性/カテコールアミン作動性繊維、セロトニン繊維、アストロサイトプロセス、あるいは血管プロファイルなどの任意の線形プロファイルの推定に使用できます。
Introduction
脳内神経線維の長さおよび/または密度の定量的推定は、神経病理学的研究の重要なパラメータである。様々な脳領域におけるコリン作動性、ドーパミン作動性、およびセロトニン作動性軸索の長さは、しばしばその領域の特定の機能と相関する。これらの軸索の分布は一般的に不均一であるため、設計ベースのステレロジーは、サンプリング中のバイアスを回避するために使用されます。ステレロジーの宇宙ボールプローブは、関心のある領域で神経線維などのライン状構造の効率的かつ信頼性の高い対策を提供するように設計されている1.プローブは、組織に体系的に課せられる仮想球を作り、プローブの表面との線の交差を測定する。分析のために球プローブを組織に入れることは不可能であるため、市販のソフトウェアは、基本的には球プローブの表面を表す様々な直径の一連の同心円である仮想3次元(3D)球を提供します。
選択的コリン作動性神経変性は、アルツハイマー病(AD)2、3、4の一貫した特徴の1つである。機能不全のコリン作動性伝達は、ADにおける認知機能低下の原因因子と考えられている。コリン作動性機能不全は、パーキンソン病、中毒、統合失調症などの他の多くの精神障害でも明らかです。コリン作動性神経変性の異なる態様は、動物モデル(例えば、アセチルコリン5の減少、ChATタンパク質6、アミロイドプラーク6付近におけるコリン作動性繊維神経変性、及びコリン作動性繊維およびシナプス変動性の減少7、8)において研究されている。繊維変性は神経細胞の損失よりも早く起こると考えられています, コリン作動性神経細胞の損失は、常に研究で観察されないので、コリン作動性ニューロンのほとんどは基底脳と脳幹にあり、その軸索は皮質や海馬などの様々な脳領域に投影する。NBMは基礎前脳に位置し、ADで一般的に影響を受ける脳領域の1つであることがわかりました。
分数体の分数法は、複数のレベルでの組織の系統的ランダムサンプリングに基づいています。セクションサンプリング分率(SSF)は、フラクテレータ法のステラゲオ法に対する非コンピュータベースの系統的な断面サンプリングである。エリア サンプリング分数(ASF)は、セクション内の対象領域の領域の分数です。厚さサンプリング分率(TSF)は、断面の厚さの分画です。スペースボールプローブを使用すると、分画された位置にある3D球体の関心プロファイルを定量化できます。ここでは、マウス脳のNBMにおけるコリン作動性繊維の全長を推定するスペースボールプローブを用いて、手順を説明する。現在のプロトコルは、組織処理、ステレロジーのサンプリング方法、ChAT抗体を用いた免疫組織化学染色、およびマウス脳のNBMにおけるコリン作動性繊維長と繊維密度を推定する非バイアスステローロジーに関する詳細を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、スペースボール(球)プローブを用いてNBM中のコリン作動性繊維の密度を推定する方法を示す。このプローブは、対象領域の総繊維長を推定します。全長を領域の体積で割って、繊維密度を取得できます。リージョンのボリュームを推定するには、カバリエリポイント数法を使用しました。カバリエニポイント数法は、任意のリージョンの3D参照ボリュームの公平で効率的な推定値で…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、医学研究開発サービス、退役軍人省(メリットレビュー1I01 BX001067-01A2)、アルツハイマー病協会(NPSPAD-11-202149)、中西部バイオメディカルからのリソースからのW.Z.S.への助成金によって支えられた研究財団。
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
