Summary
Denne protokollen tar sikte på å beskrive trinnvis teknikk for utvinning og vurdering av hjertefunksjon ved hjelp av skinned kardiomyocytter. Denne metodikken tillater måling og akuttmodulering av myofilamentfunksjon ved hjelp av små frosne biopsier som kan samles inn fra forskjellige hjertesteder, fra mus til menn.
Abstract
I denne artikkelen beskriver vi trinnene som kreves for å isolere en enkelt permeabilisert ("skinned") kardiomyocytt og feste den til et kraftmåleapparat og en motor for å utføre funksjonelle studier. Disse studiene vil tillate måling av kardiomyocyttstivhet (passiv kraft) og aktivering med forskjellige kalsium (Ca2 +)-inneholdende løsninger for å bestemme blant annet: maksimal kraftutvikling, myofilament Ca2 +følsomhet (pCa50),cooperativity (nHill) og frekvensen av kraftutvikling (ktr). Denne metoden muliggjør også bestemmelse av effekten av legemidler som virker direkte på myofilaments og av uttrykket av eksogene rekombinante proteiner på både aktive og passive egenskaper av kardiomyocytter. Klinisk, skinned kardiomyocytt studier fremheve patofysiologi av mange myokardsykdommer og tillate in vitro vurdering av virkningen av terapeutiske intervensjoner rettet mot myofilaments. Til sammen muliggjør denne teknikken avklaring av hjerteveiofysiologi ved å undersøke sammenhenger mellom in vitro og in vivo parametere i dyremodeller og menneskelig vev oppnådd under åpent hjerte eller transplantasjon kirurgi.
Introduction
Tradisjonelt har vurdering av myokardiske egenskaper blitt forsøkt hovedsakelig i flercellede preparater, som papillære muskler og trabeculae1,2. Flercellede hjertemuskler strimler inkluderer en heterogen populasjon av celler, inkludert kontraktile kardiomyocytter med et ukjent mønster av orientering og kraftgenerering, elektrisk aktivitet og stress / belastning distribusjoner samt en omkringliggende bindevev matrise3,4. Et preparat uten kollagen og inneholder en enkelt kardiomyocyte ville tillate måling av sarcomere lengde og kryssbro kontraktile egenskaper på en svært presis og kontrollertmåte 5,6. Derfor, i løpet av de siste fire tiårene, ble det utviklet flere metoder slik at det å undersøke de mekaniske, kontraktile og avslapningsegenskapene til en enkelt kardiomyocyte6,7. Den kontraktile funksjonen til disse cellene er sterkt avhengig av sarcomere lengde og cross-bridge sykling kinetikk3. Dermed er det ønskelig å undersøke muskelfunksjon direkte i enkelt isolerte hjerteceller, med tanke på at det gjør det mulig å vurdere sarkomerlengde og ytelse, samt cross-bridge funksjon og kontraktile egenskaper. Imidlertid er det fortsatt utfordrende å isolere og feste funksjonelle kardiomyocytter med en rimelig optisk sarkomeroppløsning mens du registrerer kraftmåling på μN-nivå, ogutvikler seg 3,6. Andre utfordringer er logistikken som må installeres for å isolere kardiomyocytter fra nysamlede biopsier. Uforutsigbarheten til menneskelig biopsisamling, for eksempel, kan sette gjennomførbarheten av eksperimentene i fare.
Videre har etiske bekymringer om erstatning, reduksjon og raffinement av dyreeksperimentering for vitenskapelige prosedyrer (prinsipper for 3Rs) fremmet studieendringer på celle- og vevsnivå, helst i menneskelige biopsier, eller i mindre dyreprøver. Faktisk en progressiv raffinement av metoder for å vurdere hjertefunksjon in vitro på et mindre nivå av kompleksitet tillater riktig integrering av resultatene til hele kroppen og oversette dem til det kliniske scenariet7. Til sammen kan bruk av prøver lagret ved -80 °C for å trekke ut kardiomyocytter være et tiltalende alternativ.
Myokardvevet er skåret i små biter og homogenisert med en mørtel og en pestle. Resultatet av denne homogeniseringen er en suspensjon av skinned buntet og isolerte celler med varierende grad av sarkolemmal skade, karakterisert ved at myoplasma er utsatt for bademediet og alle cellulære komponenter vaskes ut. Strukturer som myofibrillene som er lenger unna sarcolemma, bevares. Dermed holdes sarcomere forkortende og funksjonelle egenskaper knyttet til myofibrillarapparatet intakt og kan registreres8,9.
Kardiomyocyte kraftmålingssystemet består av en elektromagnetisk motor, som brukes til å justere kardiomyocyttlengde, og en krafttransduser, som måler isometrisk kardiomyocyttkontroksjon. En permeabilisert, eller flådd, kardiomyocytt er plassert i et eksperimentelt kammer som inneholder en avslappende løsning ([Ca2+] < 10 nM) og silisiumlimt til 2 tynne nåler: en festet til motoren og den andre til krafttransduseren. Et optisk system brukes til å bestemme kardiomyocyte morfologi og sarcomere lengde. Den eksperimentelle protokollen består ofte av en rekke kraftopptak på bufferløsninger som inneholder forskjellige Ca2 + konsentrasjoner, bestemmelse av actin-myosin cross-bridge kinetikk og måling av passiv spenning av de monterte kardiomyocytter på forhåndsdefinerte sarkomer lengder (figur 1). Isolering av permeabiliserte kardiomyocytter fra myokardprøver frosset i flytende nitrogen (og deretter lagret ved -80 °C) er en teknikk som benytter cellulær mekanikk og proteinbiokjemi for måling av maksimal Ca2+-aktivert (aktiv) kraft per tverrsnittsområde (Taktiv,kN∙m-2),Ca2+-uavhengig (passiv) spenning (Tpassiv,kN∙m-2),myofilaments Ca2 +-følsomhet (pCa50),myofilaments cooperativity (nHill), frekvensen av force redevelopment (ktr) samt sarcomere lengde avhengigheter av Taktiv,Tpassiv,pCa50,nHill og ktr.
Målet med denne protokollen er å illustrere og oppsummere potensialet i kardiomyocyte kraftmålingssystemet som en pålitelig prosedyre for å vurdere de funksjonelle mekaniske egenskapene til enkelthudede kardiomyocytter isolert fra frosne prøver fra forskjellige arter.
Protocol
Alle dyreforsøk er i samsvar med veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr (NIH-publikasjon nr. 85-23, revidert 2011) og den portugisiske loven om dyrevelferd (DL 129/92, DL 197/96; I 1999 ble det 100 000 personer som ble booket på 1990.000. De kompetente lokale myndighetene godkjente denne eksperimentelle protokollen (018833).
1. Klargjøring av lageroppløsning (Tabell 1)
- Forbered 1000 ml avslappende løsning for kardiomyocytters isolasjon (RELAX-ISO) ved å følge instruksjonene i tabell 2. Løs opp reagensen ovenfor i ≈ 500 ml og juster pH til 7,0 med KOH. Juster det endelige volumet til 1000 ml.
- Fordel RELAX-ISO i 50 ml rør. Oppbevares ved -20 °C.
- Klargjør 250 ml aktiveringsløsning ved å følge instruksjonene i tabell 3. Løs opp reagensene ovenfor i ≈ 100 ml ultra rent vann. Juster pH til 7,1 med 5 M KOH ved 15 °C.
MERK: Vanligvis er det nødvendig å legge til en betydelig mengde KOH for å nå ønsket pH. Legg den volumetriske ballongen i en boks med is for å kjøle ned oppløsningen til 15 °C.- Juster det endelige volumet til 250 ml. Agiter denne løsningen kontinuerlig med en magnetisk rører til det øyeblikket du blander den med den avslappende løsningen.
- Forbered 100 ml avslappende løsning ved å følge instruksjonene i tabell 4. Oppløs reagensene ovenfor i ≈ 50 ml ultra rent vann. Juster pH til 7,1 med KOH 5 M ved 15 °C.
MERK: Vanligvis er det nødvendig å legge til en betydelig mengde KOH for å nå en pH på 7,1. Plasser den volumetriske ballongen i en boks fylt med is for å kjøle ned oppløsningen til 15 °C. Den ioniske styrken til løsningene som ble brukt under målingene utgjorde 180 mM.- Juster det endelige volumet til 100 ml. Agiter denne løsningen kontinuerlig med en magnetisk rører til det øyeblikket du blander den med aktiveringsløsning.
- Bland aktiverings- og avslappende løsninger i proporsjonene som presenteres i tabell 5 for å oppnå pCa-løsninger mellom 5,0 og 6,0.
- Fortsett alltid å slappe av og aktivere løsninger som agiterer mens du blander begge deler.
- Aliquot hver blanding til 2 ml mikrorør. Oppbevar alle mikrorørene ved -20 °C.
- Klargjør en annen batch av pCa-løsning (4,5 til 6,0) for hver protokoll.
2. Kalibrering av krafttransduseren
MERK: Kalibreringen av krafttransduseren er en rutineprosedyre som skal utføres hvert par måneder eller når det mistenkes å være ukalibrert. Krafttransduseren er svært følsom og er lett ødelagt. Det bør håndteres forsiktig i hvert trinn av bruken, inkludert kalibrering, liming av kardiomyocytten og rengjøring.
- Koble krafttransduseren fra resten av apparatet.
- Ved hjelp av en klemme, plasser krafttransduseren horisontalt på en slik måte at nålen peker nedover i samme retning som kardiomyocytten vil utvikle kraft. Dette vil lette hengende en rekke masser med kjente vekter (elastisk bånd, sutur eller pin).
MERK: Kontroller egenskapene til krafttransduseren før du går videre til dette trinnet for å kontrollere skalafaktoren [mg/volt] og for å unngå for stor vekt på svingeren. For krafttransdusermodellen er skalafaktoren 50 (50 mg tilsvarende 1 volt) og vi bruker 5 vekter mellom 12,5 og 250 mg. - Slå på krafttransduseren og la den varmes opp i 30 min.
- Start med å henge den lettere massen på krafttransduseren og registrere den tilsvarende spenningen målt ved FORCE OUT.
- Gjenta denne prosedyren for opptil fem vekter.
- Plottkraft brukt på krafttransduseren (belastning) versus spenning og se etter linearitet.
- Hvis det ikke er linearitet, justere null og få potensiometere i kretskortet på svingeren. Sjekk den spesifikke instruksjonen for ytterligere informasjon.
- Vri nullpotensiometeret til utgangsspenningen står 0,0 V.
- Gi en middels vekt på transdusernålen og juster forsterkningspotensiometeret for å lese den tilsvarende spenningen (for eksempel 50 mg tilsvarer 1 V). Fjern vekten og juster nullpotensiometeret til 0,0.
- Gjenta trinn 2.6.2 til utgangen med og uten vekten er riktig.
- Monter krafttransduseren tilbake i apparatet.
3. Stille inn det eksperimentelle apparatet
- Tin ett hetteglass med hver av aktiveringsløsningene, 4,5, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0 og avslappende løsninger og vedlikehold dem på is.
MERK: ATP og PCr er labile forbindelser som bør opprettholdes ved kalde temperaturer. - Klargjør mikroskopet, testapparatet og tilhørende datamaskin for bruk (figur 1).
- Juster temperaturen slik at termometeret i kammeret står 15 °C. Utfør alle eksperimenter ved denne temperaturen med unntak av kinase og fosfatase inkubasjoner (20 °C).
- Slå på krafttransduseren og motoren.
4. Ekstraksjon og permeabilisering av flådde kardiomyocytter
- Tin 50 ml RELAX-ISO-løsning.
- Slå på sentrifugen og avkjøl den raskt opp til 4 °C.
- Tin 3-5 μg av en myokardprøve i en petriskål som inneholder 2,5 ml RELAX-ISO-løsning.
- Skjær vevet i små biter med et skalpellblad (figur 2). Klipp prøven på en presis måte for å unngå unødvendige celler skade.
- Overfør 2,5 ml RELAX-ISO-løsning med vevet til et Potter-Elvehjem-glass med en kuttet pipettespiss.
- Mekanisk forstyrre vevet med en jeksel med en rotasjonshastighet på 30-40 rpm. Trykk vevet 3 ganger for 2 s hver for å få en god celle suspensjon.
- Forbered 10 % Triton i RELAX-ISO-oppløsning (250 μL Triton med 2,25 ml RELAX-ISO) i et 15 ml rør og tilsett denne løsningen i cellefjæringen.
- Bland forsiktig ved å snu røret 3 ganger.
- Inkuber ved romtemperatur i 1 min og 4 min på is.
- Vask ut Triton ved å legge RELAX-ISO opp til toppen av 15 ml rør; forsiktig blanding (inverterer 3 ganger røret) og til slutt spinner ned cellene i en vinklet sentrifuge (1 min ved 348 x g). Fjern supernatanten opptil 3 ml over cellepellet.
MERK: Fjern supernatanten forsiktig for å unngå å forstyrre cellepellet. Likevel vil noen celler i supernatant uunngåelig gå tapt. - Gjenta trinn 4.10 minst 4 ganger eller til det ikke er observert flere bobler produsert av Triton-rester.
MERK: Jo flere utvaskingstrinn er gjort, jo flere celler går tapt med det kasserte supernatantet. - I den siste utvaskingen fjerner du supernatanten opp til et volum på 5-10 ml cellefjæring.
5. Velge og lime den flåde kardiomyocyte
- Sett en cellefjæringsdråpe på en dekkslipp på toppen av et glasssklie i mikroskopsklieholderen (figur 1).
- Velg en enkelt stangformet kardiomyocytt med et godt striasjonsmønster og -størrelse (figur 2).
- Finn nålespissene på krafttransduseren og motoren ved hjelp av den laveste forstørrelsen av det inverterte mikroskopet.
- Drei dekkglasset for å plassere den valgte kardiomyocytten horisontalt slik at endene er på linje med nålen på krafttransduseren og motoren (figur 2).
- Plasser en tynn limlinje på siden av dekkslippen ved hjelp av en vattpinnespiss (figur 2).
- Dypp nålespissene på krafttransduseren og motoren i limledningen for å skape en limglorie rundt begge tuppene.
MERK: Trinn 5.6 - 5.10 oppnås ved nøye bruk av de motoriserte mikroposisjonsenhetene. - Flytt raskt nålespissene nær fokalplanet til kardiomyocytten.
- Flytt nålespissen på krafttransduseren ned slik at den limer seg til den ene kanten av kardiomyocytten.
- Gjenta denne prosedyren med spissen av motoren og den andre ekstremiteten til cellen.
MERK: Denne prosedyren må ta mindre enn 2-3 min som limet begynner å kurere veldig fort. - Etter 5-8 min løfter du kanylene ≈ 15 μm for å unngå å lime cellen til dekkslippen. Dette gjøres ved å flytte opp begge mikromanipulatorene samtidig.
- La limet kurere. Denne prosedyren kan vare fra 15 til 45 min, avhengig av type lim. I vårt tilfelle er kardiomyocytten tilstrekkelig limt etter ≈ 15 min.
6. Opptak av kraftmålinger av aktiv, passiv og Ca2+ følsomhet
- Fyll den første eksperimentelle brønnen med den avslappende løsningen (55-100 μL i det eksperimentelle apparatet) og den andre eksperimentelle brønnen med aktiveringsløsning.
- Bruk kameraprogramvaren til å plassere interesseområdet (ROI) i et område av kardiomyocytten med et klart mønster av striasjon.
MERK: For hjertemocytter varierer driftsserkomvarianten mellom 1,8 og 2,2 μm, og den optimale sarkomerlengden er rundt 2,15 μm. - Mål avstanden mellom de to ytterpunktene i kardiomyocytten (fra motoren til transduserlimglorie, figur 3) etter at den optimale sarkomerlengden er angitt (2,2 μm). Registrer verdien som myocyte lengde i programvaren.
- Mål kardiomyocytt bredde og dybde, sistnevnte ved hjelp av et prisme speil plassert vinkelrett på cellen.
MERK: En kraftig, ekstern lyskilde vil være nødvendig for å visualisere cellen gjennom prismet. I tilfelle det ikke er prisme, og forutsatt at hjerteceller har en elliptisk form, kan kardiomyocyttdybde utledes som 70% av kardiomyocyttbredden. - Beregn tverrsnittsområdet (CSA, mm2) forutsatt en elliptisk form av kardiomyocytten.
- Flytt forsiktig mikroskopstadiet slik at cellen beveger seg fra dekkslippen til den brønnholdige avslappende løsningen på baksiden av scenen.
MERK: Denne prosedyren kan enkelt skade cellen. Før du flytter cellen, må du forsiktig flytte nålene litt mer. Unngå å fjerne cellen ut av løsningen. - Velg protokollen i programvare som inneholder to celleforkortelse (80% av sin opprinnelige lengde), som vil oppstå når cellen er dukket opp i Ca2 + løsning og i avslappende løsning, henholdsvis (Figur 1, Supplerende fil).
MERK: Først vil "Slack" av cellen bli utført i aktiveringsløsningen og den andre "Slack" innen avslappende løsning. Ved å gjøre dette vil brukeren kunne beregne den totale kraften (Ftotalt) av cellen fra 1st og passiv kraft (Fpassiv) av cellen fra den andre. Bruk formelen til å beregne aktiv kraft, Faktiv = Ftotalt - Fpassiv. Cellen er forkortet 80% for å løsne alle kryssbroer rekordkraft. - Fremkalle isometrisk sammentrekning ved å flytte mikroskopstadiet slik at kardiomyocytten beveger seg fra den avslappende til aktiveringsløsningen (pCa = 4,5 (1)).
MERK: Hvis cellen er funksjonell, vil den umiddelbart trekke seg sammen. - Når du når kraftplatået, begynner du å registrere kraftdataene.
MERK: Testene kan gjøres individuelt. Avhengig av programvare er det mulighet til å lage en sekvens av tester som vil tilsvare de forskjellige Ca2 + -løsningene i en Ca2 +følsomhetsprotokoll (Figur 1, Tilleggsfil). - Vent ~ 10 s og bytt deretter cellen nedsenket i aktiveringsløsning.
MERK: Det er viktig å vente 10 s før du senker cellen i avslappende løsning. Hvis cellen flyttes for tidlig, kan viktige data for å beregne ombyggingskraften til cellen (ktr-verdien) gå tapt. - Flytt raskt scenen slik at kardiomyocytten fordyper seg i den avslappende løsningen.
- Vent til testen stopper.
- Gjenta trinn 6,8 - 6,12 slik at cellen aktiveres to ganger i aktiveringsløsning (pCa = 4,5 (2)).
MERK: Vanligvis, etter den første aktiveringen, kan kardiomyocytterender løsne litt fra nålespissene, endre kardiomyocyttlengden, CSA og/ eller sarkomerlengden. Juster til ønsket sarcomere lengde og introdusere de korrigerte dimensjonene i programvaren.- Fortsett å trinn 6.13.2 for Ca2 + følsomhetsprotokoll eller lagre dataene, hvis verdier av passiv og aktiv kraft av cellen er de eneste parametrene som trengs og løsne cellen fra nåler og rengjør dem med aceton for å fjerne limet.
- Juster sarcomere lengden på cellen til 2,2 μm ved å strekke den litt igjen, om nødvendig.
- Bytt ut aktiveringsløsningen med neste Ca2+-oppløsning (55-100 μL her). Gjenta trinn 6.8 - 6.12.
- Bytt ut aktiveringsløsningen med neste Ca2+-oppløsning (55-100 μL her) og gjenta trinn 6,8 - 6,12 til alle løsninger er testet (5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0).
- Til slutt aktiverer du cellen på nytt med aktiveringsløsning (pCa4.5(3)). Gjenta trinn 6.8- 6.12.
7. Inkubasjon med kinaser og fosfataser
- Etter å ha utført den valgte baselineprotokollen, fortynne kinase/fosfatase i avslappende oppløsning ved anbefalt konsentrasjon.
MERK: Det anbefales å utføre en doseresponskurve før forsøket. - Still inn temperaturen på de eksperimentelle brønnene til 20 °C.
- Fyll de eksperimentelle brønnene med kinase/fosfatase, avslappende løsning og aktiveringsløsning (55-100 μL).
- Flytt mikroskopstadiet forsiktig slik at cellen blir nedsenket i brønnen som inneholder kinase/fosfatase.
- Inkuber kardiomyocytet med kinase/fosfatase i minst 30 min eller i henhold til produsentens instruksjoner.
- Gjenta den valgte grunnlinjeprotokollen.
8. Fullføre eksperimentet
- Unglue kardiomyocytten fra spissene på krafttransduseren og motoren ved å strekke cellen.
- Fjern forsiktig limglorie fra nålespissene ved hjelp av en bomullspinne gjennomvåt i aceton.
- Slå av utstyret.
9. Analysere dataene
- Samle alle filer fra hver kardiomyocyte testet.
MERK: Hver test vil tilsvare én fil. Dette betyr at for hver Ca2 + løsning eller sarcomere lengde, vil det være en tilsvarende fil. - Beregn aktive og passive krefter av en enkelt kardiomyocytt.
- Åpne filen som tilsvarer første aktivering (pCa=4.5(1)) ved hjelp av et regneark (Figur 3A, Vedlegg A i tilleggsfil).
MERK: Vi brukte et skreddersydd program til å utføre analysen. Se Vedlegg A i tilleggsfilen. - Gjennomsnittlig ≈ 60 verdier før og gjennomsnittlig ≈60 verdier etter 1st slakk av cellen (når cellen er nedsenket i Ca2 + løsning). Disse 2 verdiene tilsvarer henholdsvis a og b.
- Gjenta den samme analysen forden andre slakken i cellen (når cellen er nedsenket i avslappende løsning). Disse 2 verdiene tilsvarer henholdsvis c og d.
- Beregn forskjellen mellom a og b (total kraft, Ftotalt).
- Beregn forskjellen mellom c og d (passiv kraft, Fpassiv).
- Beregn aktiv kraft, Faktiv = Ftotalt - Fpassiv.
- Normaliser alle kraftverdier til CSA (se formelen ovenfor) for å oppnå den totale spenningen (Ttotalt),passiv spenning (Tpassiv) og aktiv spenning (Taktiv).
- Gjenta trinn 9.2.1 til 9.2.5 for den andreaktiveringen (pCa= 4,5 (2)).
- Vurder disse verdiene som de som representerer Ttotalt,Taktiv og Tpassiv av kardiomyocyte under analyse.
MERK: Den første aktiveringen av cellen med pCa4.5(1) er vanligvis forbundet med endringer i celledimensjoner. Av denne grunn er den andre aktiveringen med pCa4.5 mer nøyaktig og er den som skal brukes. - Gjenta trinnene 9.2.1 til 9.2.5 for hver fil/pCa-testede løsninger (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- Åpne filen som tilsvarer første aktivering (pCa=4.5(1)) ved hjelp av et regneark (Figur 3A, Vedlegg A i tilleggsfil).
- Beregn pCa50 og nHill av en enkelt kardiomyocyte.
MERK: For denne analysen bruker du de ikke-normaliserteF-aktive verdiene fra filene 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 og 4.5(3).- Plasser alle ikke-normaliserte verdierfor F aktiv for hver Ca2+-løsning som er testet (4,5(2),5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 4,5(3)).
- Beregn korreksjonsfaktoren = Faktiv [4,5(2)] - Faktiv [4,5(3)] / 7.
- Beregn de korrigerte verdiene for Faktiv for hver Ca2 + løsninger (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) ved å trekke Faktiv - korreksjonsfaktor.
- Beregn den relative kraften (Frelativ) for hver Ca2+-løsning ved å normalisere hverF-aktive verdi med tilsvarende korrigert verdi.
MERK:F-slektningen [4,5(3)] skal være lik 1. Hver eksperimentelle protokoll begynner og slutter med en kontrollaktivering ved mettende Ca2 + konsentrasjon (pCa 4.5 (2) og 4.5 (3)). Dette gjør det mulig å tvinge normalisering og vurdering av nedkjøringen av preparatene gjennom sammenligning av endringer i maksimal Ca2 +aktivert kraft (Fmaks). Hvis kardiomyocytten på slutten av den eksperimentelle protokollen produserer mindre enn minst 70% av maksimal kraft av den første sammentrekningen, bør den cellen / målingen utelukkes fra analysen. - BrukF-slektningen og de tilsvarende pCa-verdiene for å passe til en sigmoidal kurve med følgende ligning F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill).
- Ekstrapolere pCa og nHill verdier fra ligningen ovenfor nevnt.
- Beregn hastigheten på kraftutvikling (ktr) av en enkelt kardiomyocyte.
- Utfør en passform til kurven som tilsvarer verdiene umiddelbart etter 1m celle slakk.
- Beregn skråningen av kurven, og denne verdien vil tilsvare frekvensen av kraftutbygging.
- Gjenta trinn 9.4.1 og 9.4.2 for hver Ca2+-løsning.
MERK: En dårlig kurvepassform vil bli oppnådd for de laveste Ca-løsningene (R kvadrert≤0,90).
Representative Results
Funksjonelle permeabiliserte kardiomyocytter skal virke ensartede og med et konsekvent striasjonsmønster gjennom hele eksperimentet. Selv om en viss grad av forverring og kraftreduksjon forventes etter langvarige eksperimenter, bør verdiene av aktiv spenning være relativt stabile. Celler som viser klare tegn på striasjonstap eller signifikant kraftreduksjon (< 15 kN∙m-2 eller <80 % av den opprinnelige aktive kraften) bør utelukkes. Tabell 6 viser de normale verdiene som forventes for de viktigste parametrene avledet fra gnagere, griser og menneskelige prøver.
Parametrene som er oppnådd avhenger hovedsakelig av den valgte protokollen. Figur 5 viser representative kraftspor av 3, av 8, kraftopptak som trengs for å utføre en protokoll av myofilaments Ca2 +følsomhet. Ved å overføre cellen til en brønn som inneholder aktiveringsløsningen, begynner kardiomyocytten å utvikle kraft til den når et platå. Etter en rask slakktest (varighet på 1 ms), hvor kardiomyocytten forkorter til 80% av lengden, får vi grunnlinjeverdiene for null kraft. Etter slakktesten fortsetter cellen å utvikle kraft når den er nedsenket i aktiveringsløsningen. Total kraft (Ftotalt)beregnes ved å trekke platåverdien fra den minimale verdien. Skråningen av den siste delen av denne kurven gir oss verdien av frekvensen av kraftutbygging (ktr) (Figur 6), som er et mål på den tilsynelatende frekvensen av kryssbrovedlegg og løsrivelse (fapp og gaap)10. Når ktr R2-verdien er <0,90, bør ktr-verdien utelukkes, og vanligvis skjer dette ved lavere Ca2+ konsentrasjoner (pCa 5.6, 5.8 og 6.0). Etter å ha overført cellen tilbake til en brønn som inneholder den avslappende løsningen, slapper cellen av og kraften faller. Passiv kraft (Fpassiv) beregnes ved å trekke den minimale verdien (oppnådd etter en langvarig celleforkortelse) til denne nye kraftverdien. Aktiv kraft skyldes forskjellen mellom Ftotalt og Fpassiv.
Den maksimale aktive og passive kraften som karakteriserer en kardiomyocytt er den som stammer fra den andre celleaktiveringen med en mettende Ca2 +-løsning (pCa = 4,5). Den første aktiveringen kastes vanligvis, da sarcomere-lengden ofte må justeres på nytt.
For å utføre en myofilament Ca2 +følsomhetsprotokoll, er det nødvendig å utføre minst 9 aktiveringstester (4,5; 4,5; 5,2; 5,6; 6,0; 5,0; 5,4; 5,8 og 4,5). Denne sekvensen er bare eksemplifiserende, men bør alltid starte med 4,5 (to ganger) og avslutte med 4,5. Programmeringen av data-oppkjøp programvare for en myofilament Ca2 +følsomhet protokollen er avbildet i figur 1 av supplerende fil.
Etter beregning av aktiv kraft for alle disse aktiveringsløsningene, sjekk om den siste aktiveringen ga mer enn 80% av den opprinnelige maksimale kraften (ellers bør dette celleresultatet kastes, som nevnt ovenfor). For å korrigere for nedgangen i Fmax under eksperimentelle serien, kan de interpolerte Fmax-verdiene brukes til å normalisere datapunktene. De normaliserte dataene kan passe til en sigmoidal kurve med følgende ligning F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill). Parameterverdiene som oppnås representerer kalsiumfølsomheten (Ca50, som kan konverteres til pCa50) og cooperativity (nHill). Alle kraftverdier kan konverteres til spenningsverdier etter normalisering til tverrsnittsområdet. Foruten myofilament Ca2 +følsomhet og de lengdeavhengige aktiveringsprotokollene, kan andre tester utføres. Slik er tilfelle av sarcomere lengde avhengigheter av Taktiv, Tpassiv (Figur 7), og kardiomyocyte gjenværende kraft. Restkraftopptak beregnes ut fra den første kraftgjenopprettingen (pCa 4.5) som er nådd etter lengden av cellen (80 %) og normalisert til hver total steady-state kraft nådd før lengdeendring11. Økning i restkraft er vanligvis et tegn på kryssbroer med langsom løsrivelseskinetikk og høyere stivhet.
Til slutt bør vi understreke at denne teknikken kan utføres i skinned kardiomyocytter ekstrahert mekanisk fra frosne eller nysamlede prøver, samt isolert enzymatisk etterfulgt av permeabilisering av membranene. Måten kardiomyocytter er isolert påvirker betydelig resultatene avledet fra denne teknikken. Figur 8 viser forskjellene som er observert blant de tre isolasjonsprosedyrene.
Figur 1: Integrert plan for testapparatet. Testapparatet inkluderer mikroskopet, mikromanipulatorene og den tilhørende datamaskinen. Bunnen av figuren viser en flådd kardiomyocytt limt mellom motoren og krafttransduseren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Strømningsdiagram av protokollen for celleisolasjon, permeabilisering og liming. Bildet øverst til venstre består av 4 bilder som viser biter av hjerteprøven i RELAX-ISO-løsningen (A) i en petriskål, (B) i et rør som brukes til mekanisk homogenisering av vev, (C) homogenisatoren, (D) vevet umiddelbart etter homogenisering og (E) når det er i et rør for Triton-permeabilisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemmelse av lengde og sarkomerlengde på en flådd kardiomyocyte. Cellelengde og bredde bestemmelse på en sarcomere lengde på ≈2,2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Lengdeavhengig aktiveringsprotokoll (etterligner Frank-starling mekanisme in vitro). Representative force spor og parametere avledet fra myofilaments 'Ca2 + følsomhet protokoller utført før (A, 1,8 μm) og etter strekking en kardiomyocyte opp til 2,2 μm (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Myofilaments Ca2 +følsomhet protokoll. Representative kraftspor og avledede parametere. For enkelhets skyld er bare 3 av 8 kraftkurver avbildet. Nemlig en kardiomyocytt aktivert med mettende, en mellomliggende og den laveste Ca2 +-inneholdende løsningen (henholdsvis 4,5, 5,6 og 6,0). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative spor fra en mus hjertecelle aktivert ved ulike kalsiumløsninger og den respektive ktr fit kurven. (A) pCa 4.5; (B) pCa 5.0; (C) pCa 5.2; (D) pCa 5.4; (E) pCa 5.6; (F) pCa 6.0 og E verdier for total, passiv og aktiv spenning, ktr verdi og Rsquare for ktr passform. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Protokoller for sarcomere lengde avhengigheter av Tpassiv (A) og Taktiv (B). Passiv spenning og aktiv spenning ble beregnet i en enkelt kardiomyocyte med en sarcomere lengde på 1,8 μm til 2,3 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Representative resultater for kardiomyocytter mekanisk isolert fra ferske ("Friske") og frosne myokardprøver ("Frozen") samt fra kollagnase fordøyd hjerte (modifisert Langgendorf teknikk) med bakre permeabilisering med Triton ("Collag + Triton"). Verdier av (A) Total spenning, (B) Aktiv spenning og (C) Pasisve Spenning fra kardiomyocytter aktivert med pCa 4.5-oppløsning med en sarcomere lengde på ≈2,2 μm. (D) Kalsiumfølsomhetskurve ogde respektive verdienefor ( E ) pCa50 og (F) nHill. (G)Restkraft og (H) ktr verdier beregnet ved maksimal aktiveringsløsning (pCa 4.5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
| Oppbevares på | Lagerløsninger | [M] | Endelig volum (ml) | Vekt/volum | Notater |
| 4 °C (andre) | Kaliumhydroksid (KOH) | 1 | 100 | 5.611 g | Slik justerer du pH |
| 4 °C (andre) | Kaliumhydroksid (KOH) | 5 | 50 | 14.03 g | Slik justerer du pH |
| 4 °C (andre) | BIER | 1 | 50 | 10.66 g | |
| 4 °C (andre) | Propionsyre | 1 | 100 | 7.483 ml | Juster pH til 7,0 med 5M eller 1M KOH |
| 4 °C (andre) | CaEGTA består av: | 0.1 | 100 | Bland og varm oppløsningen til 60 °C i mer enn 1 time. Juster pH til 5-6 med 1M KOH. | |
| - CaCO3 Leilighet | 0.1 | 1.001 g | |||
| - Titriplex (EGTA) | 0.1 | 3.804 |
Tabell 1: Instruksjoner for lagerløsningsforberedelse.
| RELAX-ISO (for kardiomyocytter' isolasjon) | [mM] | Vekt |
| Na2ATP | 5.95 | 3.28 g |
| MgCl2.6H2O | 6.04 | 1.23 g |
| Tritiplex (EGTA) | 2 | 0.76 g |
| KCl (andre | 139.6 | 10.41 g |
| Imidazol | 10 | 0.68 g |
Tabell 2: Instruksjoner for forberedelse av Relax-ISO-løsning.
| Aktivere løsning (for målingene) | [mM] | Vekt / volum |
| Na2ATP | 5.97 | 0.823 g |
| MgCl 1M Leilighet | 6.28 | 1,57 ml |
| Propionsyre | 40.64 | 10,16 ml |
| BIER | 100 | 25 ml |
| CaEGTA (lagerløsning tidligere forberedt) | 7 | 17,5 ml |
| Na2PCr | 14.5 | 0.925 g |
Tabell 3: Instruksjoner for aktivering av løsningsforberedelse.
| Avslappende løsning (for målinger) | [mM] | Vekt / volum |
| Na2ATP | 5.89 | 0.325 g |
| MgCl 1M Leilighet | 6.48 | 0,65 ml |
| Propionsyre | 40.76 | 4,08 ml |
| BIER | 100 | 10 ml |
| Titriplex (EGTA) | 6.97 | 0.265 g |
| Na2PCr | 14.5 | 0.370 g |
Tabell 4: Instruksjoner for avslappende løsningsforberedelse.
| pCa = -Logg [Ca2+] | Avslappende (pCa=9,0) Ml |
Ativating (pCa = 4,5) Ml |
| 5 | 0.86 | 39.14 |
| 5.1 | 1.2 | 38.80 |
| 5.2 | 1.54 | 38.46 |
| 5.3 | 2 | 38.00 |
| 5.4 | 2.51 | 37.49 |
| 5.5 | 3.14 | 36.86 |
| 5.6 | 3.89 | 36.11 |
| 5.7 | 4.8 | 35.20 |
| 5.8 | 5.89 | 34.11 |
| 5.9 | 7.14 | 32.86 |
| 6 | 8.57 | 31.43 |
Tabell 5: Instruksjoner for klargjøring av pCa-løsninger.
| Parameteren | Gnager | Gris | Menneskelige |
| Aktiv spenning, kN.m-2 (ved 2,2 μm) | 17 – 28 | 19 – 40 | 19 – 36 |
| Passiv spenning, kN.m-2 (ved 2,2 μm) | 3.6 – 5.5 | 1.9 – 6.8 | 1.8 – 2.3 |
| PCa50 Inn | 5.58 – 5.64 | 5.40 – 5.50 | 5.43 – 5.82 |
| i 1999 ble det | 2.60 – 2.76 | 2.95 – 3.36 | 2.99 – 3.10 |
| ktr, s-1 | 4.00 – 8.00 | 1.00 – 3.00 | 0.90 – 2.00 |
Tabell 6: Typiske parametere og indekser avledet fra enkeltpermeabiliserte kardiomyocytter fra gnagere, griser og mennesker. Tilpasset fra12.
| Problem | Mulig grunn | Løsning |
| Kardiomyocyt løsner under maksimal aktivering | Utilstrekkelig limingstid; Limet er gammelt og har tørket | Øk tiden for liming trinn; vurdere å åpne et nytt limrør. |
| Det er Triton® i cellefjæringsløsningen, som ikke lenger kan fjernes | Gjenta ekstraksjonsprosedyren med ett eller to ekstra Triton® vaske ut trinn | |
| Kardiomyocytten har lav kraft under kontrollforhold | Utvinningen gikk galt og leverte celler av lav kvalitet | Øk prøvestørrelsen og gjør en ny ekstraksjon. Hvis problemet vedvarer skyldes sannsynligvis feil prøvesamling - kast denne prøven |
| Cellen er synlig kontrahering, men ingen kraft registreres; Cellen har uvanlige kraftverdier | Krafttransduseren er slått av | Slå den på |
| Krafttransduseren er ikke godt kalibrert | Kalibrer krafttransduseren ved hjelp av et sett med kjente vekter (se produsentens bruksanvisning). | |
| Krafttransdusernålen er løs | Lim nålen igjen ved hjelp av krystallbinding 509 eller gullsmedvoks. | |
| Striation mønsteret er ikke god nok til å bestemme sarcomere lengde | Utilstrekkelig lys | Øk mikroskoplyset eller flytt cellen tilbake til dekkslippen og vurder sarcomere lengde igjen (brønnene har lavere lysintensitet) |
| Utvinningen gikk galt og leverte celler av lav kvalitet | Øk prøvestørrelsen og gjør en ny ekstraksjon | |
| Nåler tips er ikke i samme plan | Bruk mikromanipulatorer til å justere nålespissene opp eller ned til du finner en fokusert sarkomere | |
| Ingen lengde- og/eller kraftvariasjon under oppkjøpet | Motoren eller krafttransduseren er av | Slå dem på |
| Motoren er ødelagt og produserer ikke celleforkortelse | Bytt den ut eller prøv å kalibrere den ved hjelp av en funksjonsgenerator | |
| For mye støy på oppkjøpsopptakene | For mye luftstrøm rundt utstyret | Beskytt utstyret mot direkte luftstrøm |
| For mange vibrasjoner rundt utstyret | En stabiliseringstabell er tilrådelig. Selv da anbefales det å fjerne utstyr som kan ha en kompressor eller avgir vibrasjoner (fryser, kjøleskap) | |
| Ca2+-følsomhetskurve har merkelige verdier, og kraftverdiene øker ikke med [Ca2+]. | Blandingen av aktivering og avslappende løsning ble ikke gjort riktig (sjekk 3,10 til 3,14 av metodedelen, muligens på grunn av utilstrekkelig blanding) | Tin hetteglassene med samme konsentrasjon, samle alt hetteglassets innhold i samme beger, bland med en røre og del dem igjen. Test disse løsningene igjen i en ny celle. Hvis dette løser problemet, klargjør du en ny batch med Ca2+-inneholdende løsninger |
Tabell 7: Feilsøkingstabell.
Discussion
In vitro vurdering av hjertefunksjon ved hjelp av skinned kardiomyocytter representerer en viktig teknikk for å avklare endringene som skjer på kardiomyocyttnivå i fysiologisk (f.eks. strekk) og patologisk kontekst (f.eks. iskemi). Denne metodikken har flere fordeler som å kreve en minimal mengde myokardi for å vurdere funksjon i kardiomyocytter hentet fra tinte prøver; ved hjelp av kardiomyocytter fra et bredt spekter av arter (mus13,rotte1,14,15,kanin 16,gris17,hund18,marsvin19 og menneskelig20)og forskjellige hjertesteder, inkludert atria, venstre og høyre ventrikler eller en bestemt region av det ufarde hjertet. Videre gjør denne teknikken det mulig å levere spesifikke konsentrasjoner av Ca2 + og energi (ATP) mens du måler funksjonen til regulatoriske og kontraktile strukturer i sin opprinnelige konfigurasjon.
Til tross for enkelheten i denne teknikken, er det noen kritiske skritt. Det er viktig å garantere kvaliteten på hvert trinn fra begynnelsen, inkludert prøvesamling. Myofilament proteiner er utsatt for proteaser21. Dermed er det obligatorisk å lagre prøver i flytende nitrogen umiddelbart etter innsamlingen. Ferske prøver, som ikke tidligere var frosset, vil utvikle betydelig høyere krefter, så det er ikke tilrådelig å blande måling gjort i ferske og frosne prøver i samme protokoll. Det nest mest kritiske trinnet er kardiomyocytes utvinning. Under denne prosedyren er det avgjørende å opprettholde prøven på is mesteparten av tiden. En proteasehemmercocktail kan brukes til å redusere risikoen for proteinnedbrytning under ekstraksjon/permeabilisering22. For det tredje bør prøver kuttes i mindre biter ved hjelp av presise skalpellbevegelser siden vi noterte redusert kvalitet kardiomyocytter da dette trinnet ble ignorert. Et annet kritisk skritt er å vaske kardiomyocytter siden det er vanskelig å ha den rette balansen mellom å vaske ut Triton (gjennomsyrer cellen, men fremmer sin ungluing) og holder så mange celler i det supernatante som mulig. Det er viktig å først prøve ekstraksjon og antall utvaskinger for hver prøve, arter eller protokoll. For eksempel, i våre hender, bemerket vi at ZSF1 overvektige rottevevsutvinninger har et "fett" aspekt, noe som gjorde disse cellene mer glatte under limingen, men ikke vanskeligere å måle. Måten vi omgår dette problemet var ved å utføre flere eksperimenter for å ha et rimelig antall celler per dyr. Videre er det avgjørende å velge en god celle å lime, nemlig med god striasjon og rimelig lengde. Hvis kardiomyocytten ikke har disse funksjonene, vil den for det meste løsne fra nålespissene eller utvikle ingen / lav kraft. Det er også viktig å bruke riktig lim for kardiomyocytttilbehør, med tanke på tidspunktet for liming og dens effekt for å lime cellen til nålen. I våre hender, silikon lim (Table of Materials) kurerer raskt (10-15 min) og sterk nok. Til slutt er det siste kritiske trinnet forbundet med forsiktig løfting av kardiomyocytten 5 min etter liming av cellen (for å unngå å lime cellen til dekkslipsen) og før du flytter den til brønnene (for å unngå at cellen dras av mikroskopstadiet). Tabell 7 oppsummerer feilsøkingen knyttet til denne teknikken, dens underliggende årsaker og mulige løsninger for å overvinne hyppige problemer.
Den store begrensningen av denne metoden er at den ikke kan svare på alle spørsmålene knyttet til myofilament kontraktilitet, for eksempel hvor fort myofilaments aktivere / deaktivere. I in vivo-innstillingen må membrandepolarisering, intracellulær Ca2 + økning og dens diffusjon til myofilamenter skje for at myocytter skal trekke seg sammen, mens i skinned kardiomyocytter Ca2 + diffusjon til myofilaments oppstår umiddelbart når cellen er nedsenket i Ca2 + oppløsning. Denne raskere frekvensen av Ca2 + diffusjon vil skjevhet myofilaments aktivering / deaktivering analyse23.
Disse eksperimentene påvirkes av ulike faktorer, inkludert temperatur, løsning pH, mekanisk perturbasjon (slakk-re-stretch vs slakk) og celle vedlegg prosedyrer (pin tie vs lim), alle disse variablene står for litteratur avvik i form av ktr og sarcomere lengdeavhengig økning i kraft4,12.
Fremtidig fremgang av teknikken inkluderer å utføre funksjonelle studier i intakt i stedet for permeabiliserte kardiomyocytter. Denne teknikken har ulempen med å stole på kardiomyocytter nyisolert (ikke tidligere frosset). Et annet viktig problem som ikke er direkte relatert til denne metodikken, men det kan ha betydelig innvirkning på det er relatert til den maksimale perioden med prøvefrosset lagring. Spesielt er det obligatorisk å fastslå graden av myofilament nedbrytning gjennom lagringstiden (det vil si hvor lenge frosne prøver kan lagres for å sikre god kvalitet funksjonelle data avledet fra de ekstraherte kardiomyocytter).
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT), EU, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) og Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) for finansiering av UnIC (UID/IC/00051/2013) forskningsenhet. Dette prosjektet støttes av FEDER gjennom COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), prosjektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), støttet av Norte Portugal regionaloperativprogram (NORTE 2020), under Portugal 2020 partnerskapsavtale, gjennom European Regional Development Fund (ERDF), prosjektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), støttet av European Structural And Investment Funds, Lisboas regionale driftsprogram 2020. Patrícia Rodrigues ble finansiert av FCT (SFRH/BD/96026/2013) og João Almeida-Coelho var av Universidade do Porto/FMUP og FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 34580 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
| Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
| Imidazole | VWR | 24720.157 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
| N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
| Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
| Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
| Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
| Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
| Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
| Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
| Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
| Length Controller (Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
| Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
| Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
| Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
| Inverted Microscope (IX51) | Olympus |
References
- Leite-Moreira, A. M., et al. Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load. Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).
- Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart. Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).
- Cokkinos, D. V. Introduction to Translational Cardiovascular Research. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).
- van der Velden, J., Stienen, G. J. M. Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins. Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).
- Garnier, D. Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge. Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).
- Brady, A. J. Mechanical properties of isolated cardiac myocytes. Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).
- Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. Introduction to Translational Cardiovascular Research. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).
- Liang, W. Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato. Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
- Sequeira, V., et al. Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness. Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).
- Edes, I. F., et al. Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes. American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).
- King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9 (1), 2956 (2019).
- Rodrigues, P. G., et al. Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle. American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).
- van der Velden, J., et al. Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction. Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).
- Wakili, R., et al. Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs. Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).
- Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch. Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).
- Falcao-Pires, I., et al. Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness. Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).
- Lim, C. C., et al. Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes. Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).
- Woulfe, K. C., et al. A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study. Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12 (2019).
- Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P.
