Summary
Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.
Abstract
Bu makalede, tek bir geçirimli ("derili") kardiyomiyositi izole etmek ve fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir kuvvet ölçme aparatı ve bir motora takmak için gereken adımları açıklıyoruz. Bu çalışmalar kardiyomiyosit sertliği ölçümü (pasif kuvvet) ve farklı kalsiyum (Ca2 +)içeren çözeltiler ile belirlenmesine olanak sağlayacak, diğerleri arasında: maksimum kuvvet gelişimi, myofilament Ca2+duyarlılık (pCa50),cooperativity (nHill) ve kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr). Bu yöntem aynı zamanda doğrudan miyofilamentler üzerinde etkili olan ilaçların etkilerinin belirlenmesini ve eksojen rekombinant proteinlerin kardiyomiyositlerin hem aktif hem de pasif özellikleri üzerine ekspresyonunun belirlenmesini sağlar. Klinik olarak, derili kardiyomiyosit çalışmaları birçok miyokardiyal hastalığın patofizyolojisini vurgulamakta ve miyofilamentleri hedef alan terapötik müdahalelerin etkisinin in vitro değerlendirilmesi ne olanak sağlar. Bu teknik, açık kalp veya nakil cerrahisi sırasında elde edilen hayvan modellerinde in vitro ve in vivo parametreleri ile insan dokusu arasındaki korelasyonları araştırarak kardiyak patofizyolojinin açıklığa kavuşturulmasını sağlar.
Introduction
Geleneksel olarak, miyokardiyal mekanik özelliklerin değerlendirilmesi papiller kaslar ve trabekülae1,2gibi çok hücreli preparatlar, çoğunlukla denenmiştir. Çok hücreli kardiyak kas şeritler hücrelerin heterojen bir nüfus içerir, oryantasyon ve kuvvet üretimi bilinmeyen bir desen ile kontraktil kardiyomiyositler de dahil olmak üzere, elektriksel aktivite ve stres / gerinim dağılımları yanı sıra çevreleyen bağ dokusu matris3,4. Kollajen olmadan bir hazırlık ve tek bir kardiyomiyosit içeren çok hassas ve kontrollü bir şekilde sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü kontraktil özellikleri ölçümü sağlayacak5,6. Bu nedenle, son kırk yılda, çeşitli metodolojiler tek bir kardiyomiyositmekanik,kontraktil ve gevşeme özellikleri incelenmesine izin geliştirilmiştir 6,7. Bu hücrelerin kontraktil fonksiyonu kuvvetle sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü bisiklet kinetikbağlıdır 3. Bu nedenle, sarcomere uzunluğu ve performansının yanı sıra çapraz köprü fonksiyonu ve kontraktil özelliklerinin değerlendirilmesine olanak sağladığı düşünüldüğünde, kas fonksiyonunu doğrudan tek izole kalp hücrelerinde araştırmak istenir. Ancak, μN düzeyinde kuvvet ölçümü kayıt ederken makul bir optik sarcomere çözünürlüğü ile fonksiyonel kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve takılması hala zorlu ve gelişmekte olan3,6. Diğer zorluklar, kardiyomiyositleri yeni toplanan biyopsilerden ayırmak için kurulması gereken lojistiktir. Örneğin, insan biyopsilerinin tahmin edilemezliği deneylerin fizibilitesini tehlikeye atabilir.
Ayrıca, bilimsel prosedürler (3R ilkeleri) için hayvan deneyleri Değiştirme, Azaltma ve Arıtma ile ilgili etik kaygılar hücresel ve doku düzeyinde çalışma değişiklikleri teşvik var, tercihen insan biyopsileri, ya da küçük hayvan örnekleri. Gerçekten de karmaşıklığı daha küçük bir düzeyde in vitro kardiyak fonksiyon değerlendirmek için metodolojilerin ilerici bir arıtma tüm vücuda sonuçların uygun entegrasyonu sağlar ve klinik senaryo7bunları çevirmek . Kardiyomiyosit leri çıkarmak için -80 °C'de saklanan numunelerin kullanılması cazip bir alternatif olabilir.
Miyokardiyal doku küçük parçalar halinde kesilir ve bir havan ve bir havaneli ile homojenize edilir. Bu homojenizasyon sonucu sarkolemal hasar değişen derecelerde derili paketlenmiş ve izole hücrelerin bir süspansiyon, miyoplazm banyo ortamına maruz ve tüm hücresel bileşenlerin yıkanır nerede. Sarkoliden daha uzaktaki miyofibriller gibi yapılar korunur. Böylece, sarcomere kısaltma ve miyofibrillar cihaz ile ilişkili fonksiyonel özellikleri bozulmadan tutulur ve 8kaydedilebilir,9.
Kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sistemi, kardiyomiyosit uzunluğunu ayarlamak için kullanılan bir elektromanyetik motor ve izometrik kardiyomiyosit daralmasını ölçen bir kuvvet dönüştürücüden oluşur. Geçirimli veya derili kardiyomiyosit, rahatlatıcı bir solüsyon ([Ca2+] < 10 nM) içeren deneysel bir odaya yerleştirilir ve biri motora, diğeri de kuvvet transdüserine bağlı silikon lu 2 iğneye yapıştırılır. Kardiyomiyosit morfolojisi ve sarcomere uzunluğunu belirlemek için optik sistem kullanılır. Deneysel protokol genellikle farklı Ca2+ konsantrasyonları içeren tampon çözeltiler üzerine bir dizi kuvvet kaydı, aktin-miyozin çapraz köprü kinetiklerinin belirlenmesi ve önceden tanımlanmış sarcomere uzunluklarında atlı kardiyomiyositlerin pasif geriliminin ölçülmesinden oluşur(Şekil 1). Permeabilize kardiyomiyositlerin sıvı nitrojende dondurulmuş miyokardiyal numunelerden (ve daha sonra -80 °C'de depolanan) izolasyonu, kesit alanı başına maksimum Ca2+aktif (aktif) kuvveti (Taktif, kN-m-2), Ca2+-ölçümü için hücresel mekanik ve protein biyokimyası kullanan bir tekniktir. bağımsız(pasif)gerilim (T pasif , kN¡m-2), miyofilamentler Ca2+duyarlılık (pCa50),miyofilamentler cooperativity (nHill), kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr) yanı sıra Taktifsarcomere uzunluk bağımlılıkları , Tpasif, pCa50, nHill ve ktr.
Bu protokolün amacı, kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sisteminin potansiyelini, farklı türlerden gelen dondurulmuş numunelerden izole edilmiş tek derili kardiyomiyositlerin fonksiyonel mekanik özelliklerini değerlendirmek için güvenilir bir prosedür olarak göstermek ve özetlemektir.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (NIH Yayın no. 85-23, revize 2011) ve Portekiz hayvan refahı yasasına (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Yetkili yerel makamlar bu deneysel protokolü onayladılar (018833).
1. Stok çözeltisi hazırlama (Tablo 1)
- Tablo 2'dekitalimatları izleyerek kardiyomiyositlerin izolasyonu (RELAX-ISO) için 1.000 mL rahatlatıcı çözelti hazırlayın. Yukarıdaki reaktifi ≈500 mL olarak eritin ve koh ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Son hacmi 1000 mL'ye ayarlayın.
- RELAX-ISO'yi 50 mL tüplerhalinde dağıtın. -20 °C'de saklayın.
- Tablo 3'tekiyönergeleri izleyerek 250 mL etkinleştirme çözeltisi hazırlayın. Yukarıdaki reaktifleri 100 mL ≈ ultra saf suda çözün. 15 °C'de 5 M KOH ile pH'ı 7,1'e ayarlayın.
NOT: Genellikle istenilen pH'a ulaşmak için önemli miktarda KOH eklemek gerekir. Çözeltiyi 15 °C'ye kadar soğutmak için hacimbaliyi buzlu bir kutuya koyun.- Son hacmi 250 mL'ye ayarlayın. Bu çözeltiyi rahatlatıcı çözeltiile karıştırma anına kadar manyetik karıştırıcı ile sürekli olarak karıştırın.
- Tablo 4'tekitalimatları izleyerek 100 mL rahatlatıcı çözelti hazırlayın. Yukarıdaki reaktifleri 50 mL ≈ ultra saf suda çözün. 15 °C'de KOH 5 M ile pH'ı 7,1'e ayarlayın.
NOT: Genellikle, 7.1 bir pH ulaşmak için KOH önemli miktarda eklemek için gereklidir. Çözeltiyi 15 °C'ye kadar soğutmak için hacimbaliyi buz dolu bir kutuya yerleştirin. Ölçümler sırasında kullanılan çözeltilerin iyonik mukavemeti 180 mM olarak hesaplandı.- Son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. Bu çözeltiyi aktive solüsyonu yla karıştırma anına kadar manyetik karıştırıcı ile sürekli olarak karıştırın.
- 5.0 ile 6.0 arasında pCa çözeltisi elde etmek için Tablo 5'te sunulan oranlarda etkinleştirme ve rahatlatıcı çözümleri karıştırın.
- Her ikisini de karıştırırken her zaman rahatlatıcı ve aktive edici çözümler tutun.
- Aliquot her karışımı 2 mL mikrotüpler için. Tüm mikrotüpleri -20 °C'de saklayın.
- Her protokol için farklı bir pCa çözeltisi (4,5 ila 6,0) hazırlayın.
2. Kuvvet transdüserinin kalibrasyonu
NOT: Kuvvet dönüştürücüsünün kalibrasyonu, birkaç ayda bir veya kalibre edilmemiş olduğundan şüphelenilen rutin bir işlemdir. Kuvvet dönüştürücüsi son derece hassastır ve kolayca kırılır. Kalibrasyon, kardiyomiyosit yapıştırma ve temizlik dahil olmak üzere kullanımının her aşamasında nazikçe ele alınmalıdır.
- Kuvvet dönüştürücüsünün diğer cihazdan ayrılması.
- Bir kelepçe yardımıyla, kuvvet transdüserini yatay olarak, iğnenin aşağıya doğru, kardiyomiyositin kuvvet geliştireceği yöne doğru işaret edecek şekilde yerleştirin. Bu bilinen ağırlıkları (elastik bant, dikiş veya pin) ile kitlelerin bir dizi asılı kolaylaştıracaktır.
NOT: Ölçek faktörünün [mg/volt] kontrol etmek ve transdüser üzerinde aşırı ağırlıktan kaçınmak için bu adıma geçmeden önce kuvvet transdüserinin özelliklerini kontrol edin. Kuvvet transdüser modeli için, ölçek faktörü 50 (50 mg 1 volta karşılık gelir) ve biz 12.5 ve 250 mg arasında 5 ağırlıkkullanın. - Kuvvet dönüştürücü açın ve 30 dakika boyunca ısınmaya bırakın.
- Kuvvet transdüserinin üzerine daha hafif kütleyi asarak ve FORCE OUT'ta ölçülen ilgili voltajı kaydederek başlayın.
- Bu yordamı en fazla beş ağırlık için tekrarlayın.
- Kuvvet transdüserine (yük) uygulanan çizim kuvveti gerilime karşı ve doğrusalolup olup olup olduğunu kontrol edin.
- Doğrusallık yoksa, sıfırı ayarlayın ve transdüserin devre kartında potansiyometre kazanın. Daha fazla bilgi için kendi özel yönergesini kontrol edin.
- Çıkış gerilimi 0,0 V okuyana kadar sıfır potansiyometreyi çevirin.
- Transdüser iğneüzerinde orta ağırlık tave ilgili voltajı okumak için kazanç potansiyometresini ayarlayın (örneğin, 50 mg 1 V'e karşılık gelir). Ağırlığı çıkarın ve sıfır potansiyometresini 0,0'a yeniden ayarlayın.
- 2.6.2 adımını ağırlıklı ve ağırlıksız çıkış doğru olana kadar tekrarlayın.
- Kuvvet dönüştürücüsi aparata geri monte edin.
3. Deneysel aparatın ayarlanması
- Aktive edici, 4.5, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 ve rahatlatıcı çözeltilerin her birinin bir şişesini eritin ve buzüzerinde saklayın.
NOT: ATP ve PCr soğuk sıcaklıklarda muhafaza edilmesi gereken labile bileşiklerdir. - Mikroskobu, test cihazlarını ve ilgili bilgisayarı kullanıma hazırlayın (Şekil 1).
- Sıcaklığı, oda içi termometrenin 15 °C'yi okuyuyacak şekilde ayarlayın. Kiaz ve fosfataz kuluçkaları (20 °C) dışında tüm deneyleri bu sıcaklıkta gerçekleştirin.
- Kuvvet dönüştürücüve motoru açın.
4. Derili kardiyomiyositlerin çıkarılması ve permeabilizasyonu
- RELAX-ISO çözeltisinin 50 mL'lik buzunu çözün.
- Santrifüju açın ve 4 °C'ye kadar hızlı bir şekilde soğutun.
- 2,5 mL RELAX-ISO çözeltisi içeren petri kabında 3-5 μg miyokardiyal numunenin çözülmesi.
- Bir neşter bıçak(Şekil 2)ile küçük parçalar halinde doku kesin. Gereksiz hücre hasarını önlemek için numuneyi kesin bir şekilde kesin olarak kesin olarak kesin.
- Relax-ISO çözeltisinin 2,5 mL'lik kısmını, kesilmiş pipet ucu kullanarak bir Potter-Elvehjem camına aktarın.
- Mekanik 30-40 rpm bir dönüş hızında bir öğütücü ile doku bozabilir. Iyi bir hücre süspansiyonu elde etmek için 2'şer s'lik için 3 kez dokuya basın.
- RELAX-ISO çözeltisinde %10 Triton (250 μL Triton, 2,25 mL RELAX-ISO) 15 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve bu çözümü hücre süspansiyonuna ekleyin.
- Tüpü 3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- 1 dk ve buz üzerinde 4 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- 15 mL'lik tüpün tepesine RELAX-ISO ekleyerek Triton'u yıkayın; yavaşça karıştırma (tüpün 3 katı ters çevirme) ve son olarak hücreleri açılı bir santrifüjde (348 x g'de1 dk) aşağı doğru döndürür. Hücre peletinin üzerinde 3 mL'ye kadar süpernatantı çıkarın.
NOT: Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatant'ı hafifçe çıkarın. Yine de, supernatant bazı hücreler kaçınılmaz olarak kaybolur. - Adım 4.10'u en az 4 kez veya Triton artıkları tarafından üretilen kabarcıklar gözlenenekadar tekrarlayın.
NOT: Daha fazla yıkama adımları yapılır, daha fazla hücre atılır supernatant ile kaybolur. - Son yıkamada, 5-10 mL hücre süspansiyonuna kadar süpernatantı çıkarın.
5. Derili kardiyomiyositseçimi ve yapıştırma
- Mikroskop kaydırağı tutucusundaki cam bir kaydıranın üzerine bir kapak kapağına hücre süspansiyonu damlası koyun (Şekil 1).
- İyi bir striation desen ve boyutu ile tek bir çubuk şeklinde kardiyomiyosit seçin(Şekil 2).
- Ters mikroskobun en düşük büyütmesini kullanarak kuvvet dönüştürücünün ve motorun iğne uçlarını bulun.
- Kapak kaymasını seçili kardiyomiyositi yatay olarak konumlandıracak şekilde döndürün, böylece uçları kuvvet transdüserinin ve motorun iğnesiyle hizalanır(Şekil 2).
- Bir bez ucu yardımı ile kapak kapağının yan tarafına ince bir tutkal hattı yerleştirin(Şekil 2).
- Her iki uç etrafında bir tutkal hale oluşturmak için kuvvet transdüser ve motor tutkal hattı içine iğne uçları batırın.
NOT: 5.6 - 5.10 adımları motorlu mikropozisyonerlerin dikkatli kullanımı ile gerçekleştirilir. - İğne uçlarını kardiyomiyositin odak düzlemine yakın bir şekilde hareket ettirin.
- Kuvvet transdüserinin iğne ucunu aşağı doğru hareket ettirin, böylece kardiyomiyositin bir kenarına yapıştırın.
- Motorucu ucu ve hücrenin diğer ekstremite ile bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Tutkal çok hızlı kür başlar gibi bu işlem az 2-3 dakika sürmelidir. - 5-8 dk sonra, hücreyi kapak kaymasına yapıştırmaktan kaçınmak için iğneleri ≈ 15 μm kaldırın. Bu aynı anda her iki mikromanipülörler yukarı hareket ederek yapılır.
- Tutkal tedavi etsin. Bu işlem tutkal türüne bağlı olarak 15 ila 45 dakika sürebilir. Bizim durumumuzda, kardiyomiyosit yeterli 15 dakika ≈ sonra yapıştırılmış.
6. Aktif, pasif ve Ca2+ hassasiyetinin kayıt kuvveti ölçümleri
- İlk deneysel kuyuyu rahatlatıcı solüsyon (deneysel cihazda 55-100 μL) ve ikinci deneysel kuyuyu da etkinleştirme solüsyonu ile doldurun.
- Kamera yazılımını kullanarak, ilgi alanını (ROI) kardiyomiyositin açık bir striasyon deseni ile bir alana yerleştirin.
NOT: Kardiyak miyositlerde ameliyat sarcomere uzunluğu 1,8 ile 2,2 μm arasında değişir ve optimal sarcomere uzunluğu 2,15 μm civarındadır. - Optimal sarcomere uzunluğu ayarlandıktan sonra kardiyomiyositin iki uç noktası arasındaki mesafeyi (motordan transdüser tutkal halesine, Şekil 3)ölçün (2,2 μm). Değeri yazılımdaki miyosit uzunluğu olarak kaydedin.
- Ölçü kardiyomiyosit genişliği ve derinliği, hücreye dik yerleştirilen bir prizma ayna yardımı ile ikinci.
NOT: Prizma yoluyla hücreyi görselleştirmek için güçlü, harici bir ışık kaynağı gerekir. Prizma olmaması ve kardiyak hücrelerin eliptik bir şekle sahip olduğu varsayılsa kardiyomiyosit derinliği kardiyomiyosit genişliğinin %70'i olarak çıkarılabilir. - Kardiyomiyositin eliptik bir şeklini varsayarak kesit alanını (CSA, mm2)hesaplayın.
- Mikroskop aşamasını yavaşça hareket ettirin, böylece hücre kapak kaymasından sahne nin arkasında rahatlatıcı bir çözüm içeren kuyuya hareket eder.
NOT: Bu yordam hücreye kolayca zarar verebilir. Hücreyi hareket ettirmeden önce iğneleri hafifçe biraz daha yukarı doğru hareket ettirin. Hücreyi çözeltiden çıkarmaktan kaçının. - Hücre Ca2+ çözeltisinde ve rahatlatıcı çözeltide ortaya çıktığında ortaya çıkacak olan iki hücre kısaltması (başlangıç uzunluğunun %80'i) içeren yazılımdaki protokolü seçin (Şekil 1, Ek Dosya).
NOT: Hücrenin ilk "Bolluk" aktive çözeltisi içinde, ikinci "Bolluk" rahatlatıcı çözelti içinde yapılacaktır. Bunu yaparak, kullanıcı hücrenin toplam kuvvetini (Ftoplamı)1'inci sinden ve pasif kuvvetini (Fpasif)2'den hesaplayabilecektir. Aktif kuvveti hesaplamak için formülü kullanın, Faktif = Ftoplamı - Fpasif. Hücre, tüm çapraz köprülerkayıt kuvvetini ayırmak için %80 kısaltılmış. - Mikroskop evresini hareket ettirerek isometrik daralmayı önbelirterek kardiyomiyositin rahatlatıcı çözeltiden aktive solüsyonuna doğru hareket etmesini sağlar (pCa=4.5(1)).
NOT: Hücre işlevselse, hemen daralan. - Kuvvet platosu'na ulaştıktan sonra, kuvvet verilerini kaydetmeye başlayın.
NOT: Testler ayrı ayrı yapılabilir. Yazılıma bağlı olarak, Ca2+duyarlılık protokolü içinde farklı Ca2+ çözümlerine karşılık gelecek bir dizi test oluşturma imkanı vardır (Şekil 1, Ek Dosya). - ~10 s bekleyin ve sonra etkinleştirme çözeltisi batırılmış hücre değiştirin.
NOT: Hücreyi rahatlatıcı bir solüsyona batırmadan önce 10 s beklemek önemlidir. Hücre çok erken hareket ettirilirse, hücrenin yeniden geliştirme kuvvetini hesaplamak için önemli veriler (ktr değeri) kaybolabilir. - Kardiyomiyositin rahatlatıcı solüsyonun içine dalmasını sağlayacak şekilde sahneyi hızlıca hareket ettirin.
- Test durana kadar bekleyin.
- 6.8 - 6.12 adımlarını tekrarlayın, böylece hücre etkinleştirme çözeltisinde iki kez etkinleştirilir (pCa=4.5(2)).
NOT: Tipik olarak, ilk aktivasyondan sonra, kardiyomiyosit uçları iğne uçlarından biraz ayrılabilir, kardiyomiyosit uzunluğu, CSA ve/veya sarcomere uzunluğu değiştirilebilir. İstediğiniz sarcomere uzunluğuna yeniden ayarlayın ve yazılımda düzeltilmiş boyutları tanıtın.- Ca2+ duyarlılık protokolü için 6.13.2 adımını almaya devam edin veya hücrenin pasif ve aktif kuvvet değerleri gerekli olan tek parametreyse ve hücreyi iğnelerden ayırıp yapıştırıcıyı çıkarmak için asetonla temizliyorsa, verileri kaydedin.
- Gerekirse hücrenin sarcomere uzunluğunu tekrar hafifçe gererek 2,2 μm'ye ayarlayın.
- Etkinleştirme çözeltisini bir sonraki Ca2+ çözeltisi (burada 55-100 μL) değiştirin. Adımları 6,8 - 6,12'yi tekrarlayın.
- Etkinleştirme çözümlerini bir sonraki Ca2+ çözeltisi (burada 55-100 μL) değiştirin ve tüm çözümler test edilene kadar (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) 6.8 - 6.12 adımlarını tekrarlayın.
- Son olarak, etkinleştirme çözeltisi (pCa4.5(3)) ile hücreyi yeniden etkinleştirin. Adımları 6.8- 6.12'yi tekrarlayın.
7. Kinaz ve fosfatazlarla kuluçka
- Seçilen temel protokolü uyguladıktan sonra, kizaz/fosfataz'ı önerilen konsantrasyonda gevşetin çözeltisinde seyreltin.
NOT: Deneyden önce bir doz-yanıt eğrisi nin kullanılması önerilir. - Deneysel kuyuların sıcaklığını 20 °C'ye ayarlayın.
- Deneysel kuyuları kiaz/fosfataz, rahatlatıcı çözelti ve aktive solüsyonu (55-100 μL) ile doldurun.
- Mikroskop aşamasını yavaşça hareket ettirin, böylece hücre kiaz/fosfataz içeren kuyuya daldırılır.
- Kardiyomiyositi en az 30 dakika veya üreticilerin talimatlarına göre kizaz/fosfataz ile kuluçkaya yatırın.
- Seçili taban çizgisi protokolünü yineleyin.
8. Deneyin sonuçlandırılması
- Hücreyi gererek güç transdüserve motor uçlarından kardiyomiyositun yapıştırın.
- Aseton batırılmış pamuklu bir bez kullanarak iğne uçlarından tutkal halesini dikkatlice çıkarın.
- Ekipmanları kapatın.
9. Verilerin analizi
- Test edilen her kardiyomiyosit tüm dosyaları toplamak.
NOT: Her test bir dosyaya karşılık gelecektir. Bu, her Ca2+ çözümü veya sarcomere uzunluğu için karşılık gelen bir dosya olacağı anlamına gelir. - Tek bir kardiyomiyositin aktif ve pasif kuvvetlerini hesaplayın.
- İlk etkinleştirmeye karşılık gelen dosyayı (pCa=4.5(1)) elektronik tablo kullanarak açın(Şekil 3A, Ek A Ek Dosya).
NOT: Analizi gerçekleştirmek için özel yapım bir program kullandık. Lütfen Ek Dosyadaki Ek A'ya bakın. - Ortalama ≈60 değer önce ve ortalama ≈60 değerleri hücrenin 1st bolluk sonra (hücre Ca2 + çözeltisi batırılmış zaman). Bu 2 değer sırasıyla a ve b'ye karşılık gelir.
- Hücrenin2.bolluk için aynı analizi tekrarlayın (hücre rahatlatıcı çözeltiye daldırıldığında). Bu 2 değer sırasıyla c ve d'ye karşılık gelir.
- a ve b arasındaki farkı hesaplayın (toplam kuvvet, Ftoplamı).
- c ve d (pasif kuvvet, Fpasif)arasındaki farkı hesaplayın.
- Aktif kuvveti hesapla, Faktif = Ftoplamı - Fpasif.
- Toplam gerilim (Ttoplamı),pasif gerilim (Tpasif)ve aktif gerilim (Taktif)elde etmek için tüm kuvvet değerlerini CSA'ya normalleştirin (yukarıdaki formüle bakın).
- 2. aktivasyon için 9.2.1 ile 9.2.5 adımını tekrarlayın (pCa=4.5(2)).
- Bu değerleri, analiz altında kardiyomiyositin Ttotal, Taktif ve Tpasifini temsil eden değerler olarak düşünün.
NOT: PCa4.5(1) ile hücrenin ilk aktivasyonu genellikle hücre boyutlarındaki değişikliklerle ilişkilidir. Bu nedenle pCa4.5 ile 2. - Her dosya/pCa test edilmiş çözümler için 9,2.1 ile 9.2.5 adımlarını tekrarlayın (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- İlk etkinleştirmeye karşılık gelen dosyayı (pCa=4.5(1)) elektronik tablo kullanarak açın(Şekil 3A, Ek A Ek Dosya).
- Tek bir kardiyomiyositin pCa50 ve nHill'ini hesaplayın.
NOT: Bu çözümleme için, 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 ve 4.5(3) dosyalarındaki normalleştirilmeyen Fetkin değerlerini kullanın.- Test edilen her Ca2+ çözümü (4,5(2),5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)) için fetkinin normalleştirilmeyen tüm değerlerini elektronik tablo dosyasına yerleştirin.
- Düzeltme faktörlerini hesaplayın = Fetkin [4.5(2)] - Fetkin [4.5(3)] / 7.
- Her Ca2+ çözümü (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) için Düzeltilmiş Fetkin değerlerini, Fetkin - düzeltme faktörlerini çıkararak hesaplayın.
- Her Ca2+ çözeltisi için göreli kuvveti (Fgöreli)her Fetkin değerlerini ilgili düzeltilmiş değere göre normalleştirerek hesaplayın.
NOT: F bağı [4.5(3)] 1'e eşit olmalıdır. Her deneysel protokol, Ca2+ konsantrasyonu (pCa 4.5(2) ve 4.5(3)) ile başlayan ve kontrol aktivasyonu ile sona erer. Bu kuvvet normalleştirme ve maksimal Ca2 +aktif kuvvet (Fmax)değişikliklerin karşılaştırılması yoluyla preparatların özetinin değerlendirilmesi sağlar. Deneysel protokolün sonunda kardiyomiyosit ilk kasılmanın maksimum kuvvetinin en az %70'inden daha azını üretirse, bu hücre/ölçüm analizdışı edilmelidir. - Aşağıdaki denklem F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill)ile sigmoidal eğrisığacak şekilde Fbağıl ve ilgili pCa değerlerini kullanın.
- Yukarıda bahsedilen denklemden pCa ve nHill değerlerini tahmin edin.
- Tek bir kardiyomiyositin kuvvet yeniden geliştirme (ktr) oranını hesaplayın.
- 1hücre bolluğundan hemen sonra değerlere karşılık gelen eğriye bir uyum gerçekleştirin.
- Eğrinin eğimini hesaplayın ve bu değer kuvvet yeniden geliştirme hızına karşılık gelecektir.
- Her Ca2+ çözümü için adım 9.4.1 ve 9.4.2'yi tekrarlayın.
NOT: En düşük Ca-çözümleri için zayıf bir eğri uyumu elde edilecektir (R kare≤0.90).
Representative Results
Fonksiyonel permeabilize kardiyomiyositler tüm deney boyunca düzgün ve tutarlı bir striation desen ile görünmelidir. Uzun süren deneylerden sonra belli bir derecede bozulma ve kuvvet azalması beklenmese de, aktif gerilim değerleri nispeten sabit olmalıdır. Belirgin striasyon kaybı veya önemli kuvvet azalması belirtileri gösteren hücreler (< 15 kN-m-2 veya başlangıç aktif kuvvetinin %80'i) dışlanmalıdır. Tablo 6, kemirgenlerden, domuzlardan ve insan örneklerinden elde edilen en önemli parametreler için beklenen normal değerleri gösterir.
Elde edilen parametreler esas olarak seçilen protokole bağlıdır. Şekil 5 temsili kuvvet izlerini gösterir 3, üzerinden 8, miyofilamentler Ca2 +-duyarlılık bir protokol yürütmek için gerekli kuvvet kayıtları. Hücreyi aktive edici solüsyonu içeren bir kuyuya aktararak, kardiyomiyosit bir platoya ulaşana kadar kuvvet geliştirmeye başlar. Kardiyomiyositin uzunluğunun %80'ine kadar kısaldığı hızlı bir bolluk testinden (1 ms' lik süre) sonra sıfır kuvvetin temel değerlerini elde ediyoruz. Bolluk testinden sonra, hücre aktive çözeltisine daldırıladığı için kuvvet geliştirmeye devam eder. Toplam kuvvet (Ftoplamı),plato değerinin en düşük değerden çıkarılarak hesaplanır. Bu eğrinin son bölümünün eğimi bize kuvvet yeniden geliştirme oranının değerini verir (ktr) (Şekil 6), çapraz köprü eki ve kopma belirgin oranının bir ölçüsüdür (fapp ve gaap)10. Ktr R2 değeri <0.90 olduğunda ktr değeri dışlanmalıdır ve genellikle bu düşük Ca2+ konsantrasyonlarında (pCa 5.6, 5.8 ve 6.0) gerçekleşir. Hücreyi rahatlatıcı solüsyon içeren bir kuyuya geri aktardıktan sonra hücre rahatlatır ve kuvveti düşer. Pasif kuvvet (Fpasif)bu yeni kuvvet değerine minimum değer (uzun süreli hücre kısalması sonrasında elde edilen) çıkarılarak hesaplanır. Aktif kuvvet, Ftoplamı ile Fpasifiarasındaki farktan kaynaklanır.
Kardiyomiyositi karakterize eden maksimal aktif ve pasif kuvvet, ikinci hücre aktivasyonundan doymak için Ca2+-solüsyonu (pCa = 4.5) ile elde edilen kuvvettir. Sarcomere uzunluğu genellikle yeniden yapılması gerektiğinden ilk aktivasyon genellikle atılır.
Miyofilament Ca2+duyarlılık protokolünü gerçekleştirmek için en az 9 aktivasyon testi (4.5; 4.5; 5.2; 5.6; 6.0; 5.0; 5.4; 5.8 ve 4.5) yapmak gerekir. Bu sıra sadece örnek tir, ancak her zaman 4,5 (iki kez) ile başlayıp 4,5 ile bitmelidir. Bir miyofilament Ca2+duyarlılık protokolü için veri toplama yazılımının programlaması Ek Dosyanın Şekil 1'inde gösterilmiştir.
Tüm bu aktivasyon çözümleri için aktif kuvvet hesaplandıktan sonra, son aktivasyonun ilk maksimal kuvvetin %80'inden fazlasını getirip getirmedini kontrol edin (aksi takdirde bu hücre sonuçları yukarıda belirtildiği gibi atılmalıdır). Deneysel seri sırasında Fmax'teki düşüşü düzeltmek için, veri noktalarını normalleştirmek için enterpolasyonlu Fmax değerleri kullanılabilir. Normalleştirilmiş veriler aşağıdaki denklem F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill)ile sigmoidal eğriye sığabilir. Elde edilen parametre değerleri kalsiyum hassasiyetini (Ca50, pCa50'ye dönüştürülebilir) ve cooperativity (nHill) temsil eder. Tüm kuvvet değerleri, kesit alanına normalleştirildikten sonra gerilim değerlerine dönüştürülebilir. Miyofilament Ca2+-duyarlılık ve uzunluğa bağlı aktivasyon protokollerinin yanı sıra başka testler de yapılabilir. Taktifsarcomere uzunluk bağımlılıkları böyledir , Tpasif (Şekil 7), ve kardiyomiyosit kalıntı kuvvet. Hücrenin uzunluk değişiminden sonra ulaşılan ilk kuvvet geri kazanımından (pCa 4.5) artık kuvvet kayıtları hesaplanır (%80) ve uzunluk değişikliği11'denönce ulaşılan her toplam sabit durum kuvvetine normalleştirilmiştir. Kalıntı kuvvetteki artış genellikle yavaş kopukluk kinetiği ve daha yüksek sertlikli çapraz köprülerin göstergesidir.
Son olarak, bu tekniğin dondurulmuş veya taze toplanan numunelerden mekanik olarak çıkarılan derili kardiyomiyositlerde ve membranlarının permeabilizasyonu ile izole edilmiş enzimatik olarak uygulanabileceğini vurgulamalıyız. Kardiyomiyositlerin izole edilmiş olması bu teknikten elde edilen sonuçları önemli ölçüde etkiler. Şekil 8, üç izolasyon işlemi arasında gözlenen farklılıkları göstermektedir.
Şekil 1: Test cihazlarının entegre şeması. Test cihazı mikroskop, mikromanipülatörler ve ilgili bilgisayarı içerir. Figürün alt motor ve kuvvet transdüser arasında yapıştırılmış bir derili kardiyomiyosit gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücre izolasyonu, permeabilizasyon ve yapıştırma protokolünün akış şeması. Sol üst köşe deki görüntü, relax-ISO çözeltisindeki kalp örneğinin parçalarını gösteren 4 görüntüden oluşur(A) bir Petri kabında, (B) bir tüpte dokunun mekanik homojenizasyonu için kullanılır, (C) homogenizer, (D) homojenizasyondan hemen sonra doku ve (E) Triton permeabilizasyonu için bir tüpte yken. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Derili kardiyomiyositin uzunluğu ve sarcomere uzunluğunun belirlenmesi. Hücre uzunluğu ve genişliği ≈2.2 μm. sarcomere uzunluğunda ise bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Uzunluğa bağlı aktivasyon protokolü (Frank-starling mekanizmasını in vitro taklit eder). Miyofilamentlerin Ca2+ duyarlılık protokollerinden elde edilen temsili kuvvet izleri ve parametreleri daha önce(A, 1.8 μm) ve kardiyomiyositi 2.2 μm 'ye(B)kadar gerdikten sonra gerçekleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Miyofilamentler Ca2+duyarlılık protokolü. Temsili kuvvet izleri ve türetilmiş parametreler. Basitlik adına, 8 kuvvet eğrisinden sadece 3'ü tasvir edilmiştir. Yani doyma, orta ve en düşük Ca2+içeren çözelti (sırasıyla 4.5, 5,6 ve 6.0) ile aktive edilen bir kardiyomiyosit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Farklı kalsiyum çözeltilerinde ve ilgili ktr fit eğrisinde aktive olan bir fare kardiyak hücresinden gelen temsili izler. (A) pCa 4.5; (B) pCa 5.0; (C) pCa 5.2; (D) pCa 5.4; (E) pCa 5.6; (F) pCa 6.0 ve E değerleri için toplam, pasif ve aktif gerilim, ktr değeri ve Ktr uyumu için Rsquare. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Tpasif (A) ve Taktif (B) sarcomere uzunluk bağımlılıklarının protokolleri. Pasif gerilim ve aktif gerilim 1,8 μm ila 2,3 m sarcomere uzunluğunda tek bir kardiyomiyosit hesaplandı.
Şekil 8: Taze ("Taze") ve dondurulmuş miyokardiyal örneklerden ("Dondurulmuş") ve Triton ile posterior permeabilizasyon içeren kollajenaz sindirilmiş kalpten (modifiye Langgendorf tekniği) izole edilen kardiyomiyositlerin temsili sonuçları ("Kollaka+Triton"). (A) Toplam gerilim, (B) Aktif Gerilim ve (C) PCa 4.5 çözeltisi ile aktive edilen ≈ 2.2 μm. (D) Kalsiyum duyarlılık eğrisi ve (E) pCa50 ve (F) nHill için ilgili değerler. (G) Maksimum aktivasyon çözeltisi (pCa 4.5)hesaplanırken ktr değerleri ktr değerleri ktr. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Mağaza at | Stok çözümleri | [M] | Son hacim (mL) | Ağırlık / hacim | Notlar |
| 4°C | Potasyum hidroksit (KOH) | 1 | 100 | 5.611 g | pH'ı ayarlamak için |
| 4°C | Potasyum hidroksit (KOH) | 5 | 50 | 14,03 g | pH'ı ayarlamak için |
| 4°C | BES | 1 | 50 | 10,66 g | |
| 4°C | Propiyonik asit | 1 | 100 | 7.483 mL | 5M veya 1M KOH ile pH'ı 7,0'a ayarlayın |
| 4°C | CaEGTA oluşur: | 0.1 | 100 | Çözeltiyi 1 saatten fazla karıştırıp 60°C'ye ısıtın. 1M KOH ile pH'ı 5-6'ya ayarlayın. | |
| - CaCO3 | 0.1 | 1.001 g | |||
| - Titriplex (EGTA) | 0.1 | 3.804 |
Tablo 1: Stok çözeltisi hazırlama talimatları.
| RELAX-ISO (kardiyomiyositlerin izolasyonu için) | [mM] | Ağırlık |
| Na2ATP | 5.95 | 3.28 g |
| MgCl2.6H2O | 6.04 | 1.23 g |
| Tritiplex (EGTA) | 2 | 0,76 g |
| Kartal | 139.6 | 10,41 g |
| İmidazol | 10 | 0,68 g |
Tablo 2: Relax-ISO çözüm hazırlama talimatları.
| Çözeltiyi etkinleştirme (ölçümler için) | [mM] | Ağırlık / hacim |
| Na2ATP | 5.97 | 0,823 g |
| MgCl 1M | 6.28 | 1,57 mL |
| Propiyonik asit | 40.64 | 10,16 mL |
| BES | 100 | 25 mL |
| CaEGTA (daha önce hazırlanmış stok çözümü) | 7 | 17,5 mL |
| Na2PCr | 14.5 | 0,925 g |
Tablo 3: Çözelti hazırlamayı etkinleştirme talimatları.
| Rahatlatıcı çözüm (ölçümler için) | [mM] | Ağırlık / hacim |
| Na2ATP | 5.89 | 0,325 g |
| MgCl 1M | 6.48 | 0,65 mL |
| Propiyonik asit | 40.76 | 4,08 mL |
| BES | 100 | 10 mL |
| Titriplex (EGTA) | 6.97 | 0,265 g |
| Na2PCr | 14.5 | 0.370 g |
Tablo 4: Rahatlatıcı çözüm hazırlama talimatları.
| pCa = -Günlük [Ca2+] | Rahatlatıcı (pCa=9.0) Ml |
Ativating (pCa=4.5) Ml |
| 5 | 0.86 | 39.14 |
| 5.1 | 1.2 | 38.80 |
| 5.2 | 1.54 | 38.46 |
| 5.3 | 2 | 38.00 |
| 5.4 | 2.51 | 37.49 |
| 5.5 | 3.14 | 36.86 |
| 5.6 | 3.89 | 36.11 |
| 5.7 | 4.8 | 35.20 |
| 5.8 | 5.89 | 34.11 |
| 5.9 | 7.14 | 32.86 |
| 6 | 8.57 | 31.43 |
Tablo 5: pCa çözeltileri hazırlama talimatları.
| Parametre | Kemirgen | Domuz | Insan |
| Aktif gerilim, kN.m-2 (2,2 m) | 17 – 28 | 19 – 40 | 19 – 36 |
| Pasif gerilim, kN.m-2 (2,2 μm) | 3.6 – 5.5 | 1.9 – 6.8 | 1.8 – 2.3 |
| pCa50 | 5.58 – 5.64 | 5.40 – 5.50 | 5.43 – 5.82 |
| nTepe | 2.60 – 2.76 | 2.95 – 3.36 | 2.99 – 3.10 |
| ktr, s-1 | 4.00 – 8.00 | 1.00 – 3.00 | 0.90 – 2.00 |
Tablo 6: Kemirgenlerden, domuzlardan ve insanlardan tek permeabilize kardiyomiyositlerden elde edilen tipik parametreler ve indeksler. 12'denuyarlanmıştır.
| Sorun | Olası neden | Çözüm |
| Maksimal aktivasyon sırasında kardiyomiyosit detaches | Yetersiz yapıştırma süresi; Tutkal eski ve kurudu | Yapıştırma adımının süresini artırın; yeni bir tutkal tüp açma düşünün. |
| Triton® hücre süspansiyon çözeltisi, artık kaldırılabilir | Çıkarma işlemini bir veya iki ek Triton ile tekrarlayın® adımları yıkayın | |
| Kardiyomiyosit kontrol koşulları altında düşük güç vardır | Çıkarma yanlış gitti ve düşük kaliteli hücreler teslim | Örnek boyutunu artırın ve yeni bir çıkarma yapın. Sorun devam ederse büyük olasılıkla yanlış örnek toplama nedeniyle - bu örnek atın |
| Hücre gözle görülür bir şekilde kasıştıramaz, ancak hiçbir güç kaydedilmez; Hücrenin alışılmadık kuvvet değerleri vardır. | Kuvvet dönüştürücü kapalı | Açın |
| Kuvvet transdüseri iyi kalibre edilmemiştir | Kuvvet dönüştürücüsünün bilinen ağırlıkları kullanarak kalibre edin (üreticinin kullanım kılavuzunu kontrol edin). | |
| Kuvvet transdüser iğne gevşek | Tutkal tekrar kristal bağ 509 veya kuyumcular balmumu kullanarak iğne. | |
| Striation desen sarcomere uzunluğunu belirlemek için yeterince iyi değil | Yetersiz ışık | Mikroskop ışığını artırın veya hücreyi coverslip'e geri taşıyın ve sarcomere uzunluğunu tekrar değerlendirin (kuyular daha düşük ışık yoğunluğuna sahiptir) |
| Çıkarma yanlış gitti ve düşük kaliteli hücreler teslim | Örnek boyutunu artırın ve yeni bir çıkarma yapın | |
| İğneuçları aynı düzlemde değil. | Mikromanipülatörleri kullanarak, odaklanmış bir sarcomeres bulana kadar iğnelerin uçlarını yukarı veya aşağı ayarlayın | |
| Satın alma sırasında uzunluk ve/veya kuvvet değişimi yok | Motor veya kuvvet dönüştürücükapalı | Onları açın |
| Motor bozuk ve hücre kısalması üretmiyor | Değiştirin veya bir fonksiyon jeneratörü kullanarak kalibre etmeye çalışın | |
| Satın alma kayıtlarında çok fazla gürültü | Ekipmanın etrafında çok fazla hava akışı | Ekipmanı doğrudan hava akışından koruyun |
| Ekipmanın etrafında çok fazla titreşim | Bir sabitleme tablosu tavsiye edilir. O zaman bile, bir kompresör veya titreşimler (dondurucu, buzdolabı) yontmak olabilir herhangi bir ekipman kaldırmak için tavsiye edilir | |
| Ca2+-duyarlılık eğrisi garip değerlere sahiptir ve kuvvet değerleri [Ca2+] ile artmaz. | Aktive edici ve rahatlatıcı çözeltinin karışımı doğru şekilde yapılmadı (muhtemelen yetersiz karıştırma nedeniyle yöntemler bölümünün 3.10-3.14'ünün kontrol edin) | Aynı konsantrasyonda şişeleri defrost, aynı kabın tüm şişe içeriğini toplamak, bir karıştırıcı ile karıştırın ve tekrar bölmek. Bu çözümleri yeni bir hücrede yeniden test edin. Bu sorunu çözerse, yeni bir Ca2+içeren çözümler hazırlayın |
Tablo 7: Sorun giderme tablosu.
Discussion
Derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun in vitro değerlendirilmesi, fizyolojik (örn. esneme) ve patolojik bağlamda (örneğin, iskemi) kardiyomiyosit düzeyinde meydana gelen değişiklikleri açıklığa kavuşturmak için önemli bir tekniği temsil eder. Bu metodoloji, çözülmüş numunelerden elde edilen kardiyomiyositlerde fonksiyonu değerlendirmek için az miktarda miyokard igerektirecek gibi çeşitli avantajları vardır; türlerin geniş bir yelpazede kardiyomiyositler kullanarak (fareler13, sıçan1,14,15, tavşan16, domuz17, köpek18, kobay19 ve insan20) ve farklı kardiyak yerler, atria dahil, sol ve sağ ventriküller veya enfarktüs kalp belirli bir bölge. Ayrıca, bu teknik, kendi doğal yapılandırmasında düzenleyici ve kontraktil yapıların işlevini ölçerken Ca2 + ve enerji (ATP) belirli konsantrasyonları teslim sağlar.
Bu tekniğin basitliğine rağmen, bazı kritik adımlar vardır. Örnek toplama da dahil olmak üzere, başlangıçtan itibaren her adımın kalitesini garanti etmek esastır. Miyofilament proteinleri proteazlara duyarlıdır21. Bu nedenle numuneleri alındıktan hemen sonra sıvı nitrojende depolamak zorunludur. Daha önce dondurulmamış olan taze numuneler önemli ölçüde daha yüksek kuvvetler geliştirecektir, bu nedenle taze ve dondurulmuş numunelerde yapılan ölçümlerin aynı protokolde karıştırılması tavsiye edilmez. İkinci en kritik adım kardiyomiyositlerin çıkarılmasıdır. Bu işlem sırasında, çoğu zaman buz üzerinde örnek tutmak için çok önemlidir. Bir proteaz inhibitör kokteyl ekstraksiyon / permeabilizasyon sırasında protein bozulması riskini azaltmak için kullanılabilir22. Üçüncü olarak, bu adım göz ardı edildiğinde düşük kaliteli kardiyomiyositler belirttiğimiz için, numuneler hassas neşter hareketleri kullanılarak daha küçük parçalar halinde kesilmelidir. Triton yıkama arasında doğru dengeye sahip zor olduğu için başka bir kritik adım kardiyomiyosit yıkama olduğunu (hücre permeabilize ama ungluing teşvik) ve supernatant mümkün olduğunca çok sayıda hücre tutmak. Öncelikle her örnek, tür veya protokol için ekstraksiyon ve yıkama sayısını denemek önemlidir. Örneğin, elimizde, biz ZSF1 obez sıçan dokusu çıkarmalar yapıştırma sırasında bu hücreleri daha kaygan ama ölçmek için daha zor değil yapılan bir "yağlı" yönü olduğunu kaydetti. Bu sorunu aşmanın yolu, hayvan başına makul sayıda hücreye sahip olmak için daha fazla deney yapmaktı. Ayrıca, tutkal için iyi bir hücre seçmek için çok önemlidir, yani iyi bir striation ve makul uzunluğu ile. Kardiyomiyosit bu özelliklere sahip değilse, çoğunlukla iğne uçlarından kopacak veya no/düşük kuvvet geliştirecektir. Ayrıca kardiyomiyosit eki için doğru tutkal kullanmak önemlidir, yapıştırma zamanı ve iğne hücre yapıştırmak için etkinliğini göz önünde bulundurularak. Elimizde, silikon tutkal(Malzeme Tablosu)hızlı (10-15 dk) ve yeterince güçlü tedavileri. Son olarak, son kritik adım dikkatle hücre yapıştırma sonra kardiyomiyosit 5 dk kaldırma ile ilgilidir (coverslip hücre yapıştırma önlemek için) ve kuyulara taşımadan önce (mikroskop aşaması tarafından sürüklenen hücre önlemek için). Tablo 7, bu teknikle ilişkili sorun giderme olayını, altta yatan nedenleri ve sık karşılaşılan sorunların üstesinden gelmek için olası çözümleri özetler.
Bu yöntemin en önemli sınırlaması, miyofilament kontraktürünün ne kadar hızlı aktivhale/devre dışı bırakılamadığı gibi tüm soruları yanıtlayamamasıdır. In vivo ayarında, membran depolarizasyonu, hücre içi Ca2+ artışı ve miyofilamentlere difüzyonunun miyositlerin kasılması için gerçekleşmesi gerekirken, derili kardiyomiyositlerde Ca2+ miyofilamentlere difüzyon hücre Ca2+ çözeltisine batırıldığında hemen gerçekleşir. Ca2 + difüzyon Bu hızlı oranı aktivasyon / deaktivasyon analizi23miyofilamentler önyargı olacaktır.
Bu deneyler sıcaklık, çözelti pH, mekanik pertürbasyon (bolluk-re-stretch vs bolluk) ve hücre eki prosedürleri (pin kravat vs tutkal), tüm bu değişkenlerin ktr vekuvvetsarcomere uzunluğuna bağlı artış açısından literatür farklılıkları için muhasebe dahil olmak üzere farklı faktörler, etkilenir 4,12.
Tekniğin gelecekteki ilerlemesi, permeabilize kardiyomiyositler yerine sağlam fonksiyonel çalışmalar yapmayı içerir. Bu teknik kardiyomiyositler taze izole (daha önce dondurulmuş değil) güvenme dezavantajı vardır. Doğrudan bu metodoloji ile ilgili olmayan bir diğer önemli konu, ancak önemli ölçüde etkileyebilecek örnek dondurulmuş depolama maksimal dönemi ile ilgilidir. Özellikle, depo süresi boyunca miyofilament bozulma derecesini belirlemek zorunludur (yani, çıkarılan kardiyomiyositlerden elde edilen kaliteli fonksiyonel verileri sağlamak için dondurulmuş numunelerin ne kadar süreyle depolanabileceği).
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Yazarlar Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), Avrupa Birliği, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) ve Programa Operacional Factores de Competitividade'ye (COMPETE) UnIC (UID/IC/00051/2013) araştırma birimini finanse ettiği için teşekkür ediyor. Bu proje FEDER tarafından COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), DocNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), Norte Portugal bölgesel operasyonel programı (NORTE 2020) tarafından desteklenen, Portekiz 2020 ortaklık anlaşması kapsamında desteklenmiştir, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF), PROJE NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), Avrupa Yapısal Ve Yatırım Fonları, Lizbon bölgesel operasyonel programı 2020 tarafından desteklenen. Patrícia Rodrigues FCT (SFRH/BD/96026/2013) ve João Almeida-Coelho tarafından finanse edildi Universidade do Porto/FMUP ve FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 34580 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
| Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
| Imidazole | VWR | 24720.157 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
| N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
| Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
| Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
| Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
| Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
| Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
| Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
| Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
| Length Controller (Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
| Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
| Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
| Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
| Inverted Microscope (IX51) | Olympus |
References
- Leite-Moreira, A. M., et al. Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load. Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).
- Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart. Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).
- Cokkinos, D. V. Introduction to Translational Cardiovascular Research. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).
- van der Velden, J., Stienen, G. J. M. Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins. Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).
- Garnier, D. Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge. Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).
- Brady, A. J. Mechanical properties of isolated cardiac myocytes. Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).
- Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. Introduction to Translational Cardiovascular Research. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).
- Liang, W. Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato. Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
- Sequeira, V., et al. Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness. Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).
- Edes, I. F., et al. Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes. American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).
- King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9 (1), 2956 (2019).
- Rodrigues, P. G., et al. Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle. American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).
- van der Velden, J., et al. Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction. Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).
- Wakili, R., et al. Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs. Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).
- Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch. Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).
- Falcao-Pires, I., et al. Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness. Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).
- Lim, C. C., et al. Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes. Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).
- Woulfe, K. C., et al. A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study. Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12 (2019).
- Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P.
