Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

Published: December 12, 2019 doi: 10.3791/60455
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

Summary

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

Abstract

איתות מחריץ מווסת את התחזוקה של תאי גזע/מחולל שחור עצביים על-ידי אינטראקציות תא תא. הרכיבים של הביטוי הדינאמי של מוצג איתות. החריץ מדרגה Hes1 ו-Delta-like1 (Dll1) מבוטאים באופן מרוכך בתאי גזע/מחולל מעשה עצבי. מכיוון שתקופת הביטוי הנדנוד של הגנים הללו קצרה מאוד (2 שעות), קשה לעקוב אחר הביטוי המחזורי שלהם. כדי לבחון שינויים מהירים כאלה בביטוי הגנים או בדינמיקה החלבונים, נדרשים כתבים בתגובה מהירה. בגלל ההבשלה שלה מהירה קינטיקה ורגישות גבוהה, הכתב הביולומינסנציה לוציפראז מתאים לעקוב אחר שינויים ביטוי גנים מהיר בתאי החיים. השתמשנו בכתבת לוציפראז של יציבות לניטור פעילות היזם וכתבת התמזגו לוצין להדמיה של דינמיקת חלבון ברזולוציית תא בודדת. כתבים אלה הביולומינציה להראות מחזור מהיר וליצור אותות חלשים מאוד; לכן, פיתחנו מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד כדי לזהות אותות קלושים כאלה. שיטות אלה מאפשרות לנו לנטר הדינמיקה של ביטוי גנים שונים בתאי החיים וברקמות, שהם מידע חשוב כדי לעזור להבין את המדינות הסלולריות בפועל.

Introduction

המוח המיונקים מורכב ממספר רב של סוגים שונים של נוירונים ותאי גליה. כל התאים נוצרים מתאי גזע/מחולל קדמון (npcs), אשר מתרבים הראשון כדי להרחיב את המספרים שלהם, ואז להתחיל להבדיל לנוירונים, ובסופו של דבר להצמיח תאים גליה1,2,3,4,5. לאחר תאים הבדיל לנוירונים, הם לא יכולים להתרבות או להגדיל את המספרים שלהם, ולכן, התחזוקה של NPCs עד שלבים מאוחרים יותר חשוב. איתות מדרגה דרך אינטראקציות תא תא ממלא תפקיד חשוב בשמירה על npcs6,7. החריץ מתקשר עם חלבון הממברנה, חריץ, על פני השטח של תאים שכנים ומפעיל את החלבון חריץ. לאחר ההפעלה, פרוטפוליזיס של חלבון חריץ מתרחשת, ובכך משחררים את התחום התאיים של חריץ (nicd) מן קרום התא לתוך הגרעין8,9,10. בגרעין, NICD נקשר לאזורי היזם של Hes1 ו Hes5 (Hes1/5) ומפעיל את הביטוי של גנים אלה. Hes1/5 לדכא את הביטוי של הגנים הפרניים Ascl1 ו Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. מכיוון גנים proneural לגרום לבידול עצבי, Hes1/5 לשחק תפקידים חיוניים בתחזוקת npcs. יתרה מזאת, כאשר גנים מפרניים יכולים להפעיל את הביטוי של החריץ ו-Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 גם מדחיקים את ביטויו של Dll1. לכן, הביטוי של Dll1 מוביל לתאים שכנים שליליים עבור Dll1 באמצעות איתות מדרגה. בדרך זו, תאים מעכבים תאים סמוכים לאחר אותו גורל, תופעה המכונה עיכוב לרוחב8. במוח המתפתח, הדיכוי הרוחבי ממלא תפקיד ביצירת סוגי תאים שונים.

הדמיה בזמן אמת ברמת תא בודדת מגלה ביטויים דינאמיים של רכיבי איתות מדרגה ב-npcs15,16,17. איתות מחריץ מפעיל את הביטוי של Hes1, אך Hes1 חלבון נקשר ליזם משלו ומחדש את הביטוי שלו. יתר על כן, Hes1 הוא חלבון בלתי יציב מאוד, כי הוא מושפל על ידי אוביקוויב-פרוטאסאט מסלול; לכן, הדיכוי של היזם משלה הוא רק קצר החיים ולאחר מכן התמלול מתחיל שוב. בדרך זו, הביטוי של Hes1 נדנוד בשתי רמות שעתוק וטרנסלtional במחזור 2 h18. הביטוי הנדנוד של Hes1, בתורו, מעורר את הביטוי המסובב של הגנים של המטרה במורד הזרם, כגון Ascl1, Neurog2, וDll1, דרך הדחקה מחזורית15,16,17,19. בעוד הגנים הפראוניים יכולים לגרום לבידול עצבי, הביטוי הנדנוד שלהם אינו מספיק לבידול עצבי; בעצם הביטוי המתמשכת שלהם חיוני לבידול העצבי. הביטוי נדנוד של גנים proneural חשוב לשמירה על npcs במקום לגרימת בידול עצבי14,15,16. הביטוי של Dll1 מרוטים ברמות התמלול והטרנסלאיזם במהלך שונות, כגון נוירוגנזה וסוטוגנזה. הביטוי הדינמי של Dll1 חשוב עבור מורגנזה נורמלי ביטוי קבוע של Dll1 גורם פגמים נוירוגנזה ו somitogenesis17. ממצאים אלה מדגימים את הפונקציה החשובה כי הדינמיקה של ביטוי גנים וקינטיקה חלבונים יש על הרגולציה של אירועים התפתחותיים שונים (כלומר, דינמיקה ביטוי שונה לייצר תפוקות שונות התנהגויות סלולר).

כדי לנתח את הדינמיקה של איתות מדרגה, הניתוח הסטטי של רקמות ותאים אינו מספיק מכיוון שהם משתנים ללא הרף. בזמן אמת הדמיה של תאים בודדים הוא כלי רב עוצמה כדי לחשוף את הדינמיקה ביטוי גנים. הביטוי הדינמי של מולקולות איתות מהירות עוברות תגובות מחזורית בתקופה של 2-3 h. ביטוי תקופתי מהיר זה מציג שתי בעיות קשות לניטור בזמן אמת: (1) הביטוי של המולקולות מדוכא רמות נמוכות, ו (2) מחזור מהיר דורש כתבים בתגובה מהירה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו בעבר ביולומינציה בזמן אמת שיטה הדמיה20. מכיוון שלעיתונאי הביולומינסנציה יש רגישות גבוהה יותר וזמן התבגרות קצר יותר מאשר כתבים פלורסצנט, אסטרטגיה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר הדינמיקה המהירה בתאי החיים. שימוש בהדמיה בזמן אמת, גילינו כי גנים נוספים הציגו ביטוי דינמי משחשבנו בעבר. בנוסף, מספר הדיווחים המציגים ביטוי ודינמיקה חלבונים בתאי החיים והמשמעות של הדינמיקה הללו באירועים ביולוגיים שונים גדל, מציע תפקיד בסיסי של הדינמיקה ביטויים גנים21,22.

בדוח זה, אנו מתארים דרך להמחיש את הביטוי של החריץ והDll1 ב NPCs בתרבויות המונתק ובתרבויות הפרוסה הקורטיקלית. כדי לנטר את הדינמיקה של תמלול Dll1 ברמות תא בודד, יצרנו תרבויות מופקות של npcs שנגזר מהטלנצאלון העובריים של עכברים טרנסגניים הנושאים את הכתבת PDll1-רוב-fluc, הכתבת לוציפראאז מונחה-מיזם Dll1. כדי לפקח על הדינמיקה Dll1 חלבון ב vivo, הצגנו את הכתב היתוך Dll1-Fluc לתוך NPCs בקליפת המוח ודמיינו את הביטוי של הכתב NPCs בתרבויות פרוסת הקליפה. הדמיה בזמן אמת אפשרה לנו ללכוד את התכונות השונות של ביטוי גנים ודינמיקה חלבונים בתאי החיים ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים, כולל נושאי בעלי חיים, אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים במכון למדעי החיים ומדעי הרפואה, אוניברסיטת קיוטו.

1. כתבים ביולומינסנציה

הערה: הכתב הלוציפראז מתאים למדידת הדינמיקה המהירה של פעילות היזם על ידי החדרת אות השפלה. יתר על כן, כתב היתוך לוציפראז מאפשר ניטור של דינמיקת החלבון בתא בודד. שני סוגי הכתבים זמינים עבור תרבות מונו-layer (תרבות הדיסוציאציה) ותרבות רקמה (תרבות פרוסה) ניסוי.

  1. כתבת ניטור פעילות Dll1 יזם17
    הערה: כדי לעקוב אחר השינויים המהירים בביטוי הגנים, הכתב המהיר והעיתונאי הלא יציב הוא חיוני. גחלילית לוציפראז (Fluc) מראה התבגרות מהירה לעומת fluorescein כתבים. בגלל אוביקוויב התמזגו כתבת לוציפראז (רוב-Fluc) מראה השפלה מהירה מחזור מהיר, זה מאוד שימושי כדי לפקח על הביטוי הגן הדינמי בתאי החיים20.
    1. השתמש Dll1 היזם מונחה יציבות כתבת לוציפראז, לוציפרול (pDll1-ורוב-Fluc, איור 1פאנל עליון) , כדי לעקוב אחר שינויים מהירים בביטוי Dll1 ברמת ההמרה17.
    2. צור קו עכבר טרנסגניים הנושא את pDll1-רוב-Fluc לביטוי היציב של כתב זה.
  2. כתבת ניטור Dll1 חלבון17.
    1. עבור דור של עכברים נוק-אין, הכנס את ה-Dna לוציפראז אל 3 termini של אזור הקידוד Dll1 כך Dll1-לוציפראאז חלבון היתוך מבוטא (Dll1-Fluc כתב, איור 1, פאנלתחתון)17.
    2. נטר את דינמיקת הביטוי של Dll1 ברמות החלבון על-ידי מדידת הפעילות הלוציפרראז.
    3. עבור ניטור הדינמיקה Dll1 חלבון ברמות רקמות, להציג את הכתב Dll1-Fluc לתוך NPCs בטלנצאלון העובריים באמצעות אלקטרופורציה של הרחם.

2. מערכת הדמיה ביולומינסנציה

  1. בניית מערכת הדמיה ביולומינציה לחיות באמצעות מיקרוסקופ הפוך מותקן עם רגישות גבוהה, מים מקורר מצלמה מצלמות. כדי להפחית את הרעש ולקבל רגישות גבוהה, לצנן את המצלמה עם מים צוננים המסופקים על ידי מקצר המים בטמפרטורה ממוטבת של-90 ° c.
  2. עבור הדמיה של תא/רקמה חיה, התקן את מערכת הדגירה, שליטה בטמפרטורה ובגז מעורב, לשלב המיקרוסקופ.
  3. עבור הדמיה של הביטוי של כתבת הלוציפראז ביציבות, השתמש בזווית מספרית גבוהה (NA: 1.30) 40x העדשה היעד טבילה שמן. מרחק העבודה של העדשה הזאת הוא 0.2 מ"מ, הוא זמין עבור לא רק תרבות תא מונו שכבה אלא גם לחתוך תרבות.
  4. עבור ניטור כפול של לוציפראז וביטוי כתבת fluorescein, להתקין את המכשיר תאורה LED לנתיב האור של המיקרוסקופ.
  5. שלוט בדימות הזמן עם תוכנה המשויכת למיקרוסקופ (לדוגמה, תוכנית רכישה רב-מימדית של תוכנת התמרה).
  6. הכן את המערכת כולה בחדר חשוך, מכיוון שהאות של כתב הלוציפראז מאוד חלש, וכדי למנוע מהאור החיצוני למנוע את הרכישה.

3. בתרבויות הדיסוציאציה של הגזע/הקדמון (NPC)

  1. הכנת מדיה תרבותית, מנות, וריאגנטים לתרבות הדיסוציאציה של NPC
    1. הכינו N2/B27 מדיה לתאי גזע/מחולל עצבי באמצעות ריכוז סופי של 1x N2, 1x B27, 1 מ"מ N-acetylcysteine, 10 ng/mL bFGF ו 50 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב DMEM/F12 מדיה.
    2. להכין פתרון פפאין עבור הדיסוציאציה המכילה 7 U/mL פפאין, 0.006% dnase ו 1 מ"מ N-acetylcysteine ב-ebss מדיה.
    3. הכינו 100 מ"מ של תמיסת נתרן לוציפראב לדימות. לדלל 100 mM לוציב פתרון N2/B27 מדיה לריכוז הסופי של 1 מ"מ.
      הערה: לוציפראב מראה אוטומטי-פלואורואסעין עצמו. במקרה של לluciferase-הדמיה כפולה פלואורסצנטית, במיוחד EGFP, הפחתת הריכוז של לluciferase כדי 0.5 mM הוא טוב יותר.
    4. מעיל 35-mm זכוכית מנות בתחתית (קוטר זכוכית 27 מ"מ) עם 40 μg/mL של פולי-L-ליזין (PLL) פתרון עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף את לוחיות 3x עם PBS ולתת לו להתייבש.
  2. חיתוך העוברים והדיסוציאציה של NPCs
    1. לאחר המתת החסד pDll1 ההרה-ורוב ללוק העכבר (היום העובריים 12.5 (E 12.5)) על ידי שיתוף2 חנק צוואר הרחם, לחתוך דרך הבטן ולהוציא את הרחם.
      הערה: על החוקרים לפעול לפי התקנות וההנחיות של ועדת מחקר בעלי חיים של מוסד. אם נעשה שימוש בהרדמה או בתרופות לשיכוך כאבים, השתמש בהן כראוי.
    2. העבר את הרחם בצלוחית בגודל 10 ס מ המכיל 25 מ ל של הקרח קר PBS. להוציא את העוברים מן הרחם ב-PBS קר קרח, באמצעות מספריים מיקרו מלקחיים עדינים.
    3. חותכים את הראש של כל עובר באמצעות מספריים ולהעביר אותו 10 ס מ מנות פטרי המכילות הקרח קר Dמאמ/F12. הסר את האפידרמיס ואת הסחוס סביב המוח ולהעביר את המוח כדי 35 מ"מ צלחת פטרי המכיל קרח קר 3 מ ל של N2/B27 מדיה.
    4. לנתק את הטלנצאלון הימני והשמאלי מדינצאלון (איור 1בבא-פ, ג, ד). להסיר את קרום הקרומי המכסה את פני השטח של טלנצאלון באמצעות מלקחיים עדינים (איור 1Bi). שימוש מלקחיים עדינים שוב, להוציא את החלק הרוחבי של קליפת המוח של הטלנצאלון (איור 1Bg, h, j-l E).
    5. להעביר את הרקמות לצינורות חדשים 1.5 mL באמצעות P1000, ולהסיר כל מדיום נוסף עם P200. הוסף 0.1 mL של פתרון פפאין לרקמת המוח (זוג של קליפת הקליפה). לאחר 15 דקות של דגירה ב -24 ° c, מצנעת בעדינות את הדגימות 10 פעמים עם P1000 פיפטה. החזר את הדגימות במשך 15 דקות ב-24 ° c.
    6. מצנעת בעדינות את הדגימות 10 פעמים עם P1000 פיפטה. צנטריפוגה את הדגימות עבור 3 דקות ב 400 x g וטמפרטורת החדר (RT). . מחק את הסופרנטאנט
    7. הוסף 1 מ ל של מדיה DMEM/F12 לתוך הגלולה. פיפטה בעדינות 10 פעמים. עם P1000 פיפטה צנטריפוגה את הדגימות עבור 3 דקות ב 400 x ו RT. למחוק את הסופרנטאנט. . חזור על זה לפחות עוד 2 פעמים
    8. לתוך הגלולה, להוסיף 0.5 mL של מדיה N2/B27 המכיל 1 מ"מ לוספרין ולערבב היטב. זרע את התאים (1 x 106 תאים) לצלחת זכוכית מצופה pll. תרבות התאים בחממה CO2 עבור 1 h. לאחר התאים לדבוק התבשיל, להוסיף 2 מ"ל של N2/B27 מדיה, המכיל 1 מ"מ לוציב.
  3. ויזואליזציה של ביטוי הכתב ללוציפראז בתרבות הדיסוציאציה של NPC
    1. הפעל את מערכת הדימות החי לפני ביצוע הניתוח. עבור התרבות NPC, להגדיר את הטמפרטורה של אינקובטור הבמה ב 37 ° c ולקבוע את ההגדרה של תערובת הגז 20% O2, 5% CO2.
    2. הכניסו את שמן הטבילה אל העדשה האובייקטיבית. מניחים את המנה לדוגמה על במת המיקרוסקופ. הצגת השדה באופן ידני ובחירת המיקום הטוב ביותר ומוקד תאי הריבית. לחץ על live כדי לרכוש את תמונת הבדיקה.
    3. הפעל את רכישת הזמן על ידי 2-מימדי (לומינציה שדה בהיר) רכישות 24 שעות עם תוכנית רכישה רב ממדית . בחר תוכנית רכישה רב ממדית והגדר את הגדרת הרכישה כדלקמן (שלב 3.3.6).
    4. עבור רכישת תמונה לאור, השתמש בהגדרות הבאות של המצלמה: קצב העברה נמוכה (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 דקות/5 דקות חשיפה זמן. לרכישת תמונות בשדה בהיר, השתמש בהגדרות הבאות: קצב העברה ביניים (1 מגה-הרץ), 1 x 1 binning ו 100 ms זמן חשיפה.

4. באלקטרופורציה של הרחם

הערה: הדבר מבוצע לצורך הקדמה של כתב Dll1-Fluc לתוך תאי הקדמון העצביים.

  1. הכנת כלים וריאגנטים לאלקטרופורציה
    1. הכנת נימים מיקרו להזרקה של ה-DNA לתוך החדר של טלנצאלון עובריים. מתחו את העשב בחום וחתכו את קצהו במכונת הליטוש.
    2. הכינו תערובת של דנ א עם צבע (למשל, טרילון כחול). הריכוז של כל דנ א הוא 1 μg/μL ב-PBS ולהוסיף את הצבע לריכוז הסופי של 10%.
      הערה: השתמש בתערובת של ה-DNA עבור ויזואליזציה של דינמיקה Dll1 חלבון כדלקמן: Dll1-Fluc (Dll1 כתבת חלבון, איור 2e העליון) ו PEF-egfp (EF יזם מונחה ביטוי Egfp וקטור, איור 2E נמוך), ניטור המיקום ומורפולוגיה של תאים מזוהמים.
    3. הכינו שני סוגים של הרדמה: 3.88 מ"ג/mL של פנטוברביטל ו 0.12% של xylazine, ב-1x מעוקר.
    4. השתמש בכלים הסטריליים ובכפפות הניתוח במהלך הפעולה.
  2. באלקטרופורציה של הרחם
    1. מורדם בפעם ההרה העכבר ICR (E 12.5) על ידי מינהל הצפק הרדמה עם 500 μL של 3.88 mg/mL פנטוברביטל ו 500 μL של 0.12% xylazine.
      הערה: על החוקרים לפעול לפי התקנה של ניסויים בבעלי חיים. אם אדם צריך להשתמש בהרדמה או בתרופות לשיכוך כאבים, השתמש בהם כראוי.
    2. הצמד את השיער וחטא את העור בקרצוף כירורגי.
    3. בדוק אם העדר. תגובה לצביטה בבוהן לאחר רפלקס הדוושה לא נצפתה, לעשות 2-3 ס מ לחתוך דרך הבטן לאורך קו האמצע. לשים את החלקים סביב לגזור ולהרטיב את הגאוזים עם PBS חם לא לייבש את החתך. להוציא את קרן הרחם הנכון בעדינות עם מלקחיים בצורת טבעת ולספור את מספר העוברים.
    4. הכנס 1-2 μL של ה-DNA המעורב לחדר של טלנצאלון של עוברים בעדינות עם מיקרו נימי.
      הערה: כאשר ההזרקה מוצלחת, ניתן לראות את צבעו הכחול של הצבע על פני הרחם.
    5. הרטב את הרחם והאלקטרודה לפני מתן פעימות המתח, ולאחר מכן החזיקו את ראש העובר בעדינות. הגדר את האלקטרודה טעונה חיובית בצד של החצי הכדור, שבו ה-DNA הוזרק. ודא כי המצב של הדופק של אלקטרופורציה הוא 30-50 V עבור 50 ms, המרווח של הפולסים הוא 1 s (50 ms תשלום ו950 ms ללא תשלום). לספק 5 פולסים לעובר אחד ולבדוק כי בועות נוצרות מן האלקטרודה טעונה שלילית.
      הערה: ודא כי הכיוון של האלקטרודה: ה-DNA משולבים בתאים בצד של אלקטרודה חיובית. במהלך הליך זה, אל תזיז את המיקום של האלקטרודה.
    6. חזור על הצעדים 4.2.3-4.2.4 עבור עוברים אחרים ולהחזיר את קרן הרחם אל חלל הבטן. בצע את אותו ההליך לעוברים בקרן הרחם השמאלית.
    7. לאחר לשים בחזרה את הצד השמאלי, תפר את החתך על ידי תפר משי (4-0) עם מחט (17 מ"מ). לפני סגירת החתך לחלוטין, הכניסו PBS חם לתוך חלל הבטן
      הערה: המרווח בין התפרים הוא בסביבות 2 מ"מ.
    8. לאחר סיום הניתוח, למקם את העכבר על משטח חימום לאחר התאוששות הרדמה. הבית העכבר בנפרד.
      הערה: על החוקרים לבצע את הרגולציה המקומית של ניסויים בבעלי חיים. אם מישהו צריך להשתמש בסמים. הקלת כאבים, השתמש בהם כראוי

5. הכנת תרבויות הפרוסה של קליפת המוח המתפתחת והדמיה של ביטוי כתב לוציפראז בפרוסות קליפת המוח

  1. הכנת מדיית תרבות וריאגנטים לתרביות פרוסות של קליפת המוח
    1. להכין מדיה מועשר עבור פרוסות קורטיקלית המכיל 5% סרום העובר העוברי ו 5% סרום סוסים ב N2/B27 מדיה.
    2. בועה 100% O2 גז באמצעות dmem דיה/F12 התקשורת לניתוח ועשיית פרוסות קורטיקלית.
      הערה: כדי להשתמש בגז חמצן בבטחה, לאחסן את הצילינדר O2 בארונית גליל ולפקח על ריכוז החמצן באוויר על ידי מד ריכוז חמצן.
    3. לדלל 100 mM לוציפרב תמיסת נתרן במדיה מועשר לריכוז הסופי של 1 מ"מ.
      הערה: לוציפראב מראה אוטומטי-פלואורואסעין עצמו. במקרה של לluciferase-הדמיה כפולה פלואורסצנטית, במיוחד EGFP, ריכוז נמוך יותר של לluciferase (0.5 mM) הוא טוב יותר.
    4. הגדר את החממה רב-גזי ב 37 ° c על ידי 40% O2 ו 5% CO2.
  2. ניתוח עוברים ובחינת ביטוי של כתב פלורסנט
    1. לאחר המתת החסד העכבר ההרה שאליו הכתבים (E 13.5) מוצגים על ידי אלקטרופורציה הרחם (שלב 4.2), לחתוך דרך הבטן ולהוציא את הרחם.
      הערה: על החוקרים לפעול לפי התקנה של ניסויים בבעלי חיים. אם משתמשים בהרדמה או בתרופות לשיכוך כאבים, השתמשו בהם כיאות.
    2. העבר את הרחם ל 10 ס מ צלחת פטרי המכילה PBS. להוציא את העוברים מהרחם ב-PBS, באמצעות מספריים מיקרו מלקחיים עדינים. לחתוך את הראש של כל עובר ולהעביר ל 10 ס מ צלחת פטרי המכיל מדיה DMEM F12/לצמצם עם 100% O2 גז. להסיר את האפידרמיס ואת הסחוס סביב המוח בתקשורת Dמאמ/F12.
    3. שים את המוח על המכסה של צלחת פטרי עם מלקחיים בצורת טבעת ולהגדיר את המכסה על הבמה הזריחה סטריאוסקופי מיקרוסקופ. בדוק את האזור של הקליפה המבטא חלבון פלורסנט תחת אור עירור (איור 2א, ב).
    4. להעביר את המוח ללוח גומי סיליקון ממולא 30 מ ל של DMEM דיה/F12 התקשורת בודימם עם 100% O2 גז. מסירים את הקרום על המשטח של הטלנצאלון על ידי מלקחיים עדינים.
    5. חותכים את הגבול בין האמצעי לרוחב של החלק הרוחבי של הטלנצאלון ונפרד לשתי אונות באמצעות סכין מיקרו מנתחים או מלקחיים עדינים. באמצעות סכין מיקרו כירורגית, חותכים את קליפת המוח כמו פסים לעשות פרוסות קורטיקלית (איור 2ג, ד). הפיפטה פרוסות באמצעות פיפטה ומעבירים אותן למדיה מועשרת בצלחת 35 מ"מ.
    6. שימו את הפרוסות על מוסיף התרבות במנות התחתונות בזכוכית עם מדיה מועשרת. תקן את כיוון הפרוסות בעזרת מלקחיים עדינים. הגדר את משטח החיתוך של הפרוסות על פני השטח של הוספת התרבות. הסירו את המדיה הנוספת באמצעות פיפטה. מודיית את הפרוסות בחממה רב-גזי שנקבעו על ידי 40% O2 ו 5% CO2 ב 37 ° c עבור 30 דקות.
    7. הוסף 300 μL של מדיה מועשרת המכיל 1 מ"מ לוצין מחוץ לכנס התרבות בצלחת הזכוכית התחתונה.
  3. ויזואליזציה של ביטוי כתב לוציפרראז בתרביות פרוסות
    1. התחילו את מערכת הדימות החי לפני שמתחילים בניתוח. השתמש בתנאי הבא של תרבויות הפרוסה הקורטיקלית: 40% O2, 5% CO2 ו-37 ° c.
    2. לשים את השמן טבילה כדי 40x עדשה אובייקטיבית. לשים את המנה לדוגמה לשלב של מיקרוסקופ. לרכוש את תמונת המבחן של פלורסנט ולהגדיר את המיקום ואת מישור המוקד לאזור העניין תחת התאורה של אור עירור.
    3. הפעל את רכישת הזמן על ידי 3-מימדי (לומינציה, זריחה ובהיר שדה) רכישות עבור 24 שעות (איור 2F-h). עבור רכישת תמונה לאור, השתמש בהגדרות הבאות של המצלמה: קצב העברה נמוכה (50 kHz), 2x2/4x4 binning, 10 דקות/5 דקות חשיפה. עבור הרכישה והחשיפה של תמונת שדה בהיר, השתמש בהגדרות הבאות: קצב העברה ביניים (1 מגה-הרץ), 1x1 binning ו 100 ms זמן חשיפה.

6. עיבוד תמונה וניתוח

  1. חבר כל תמונה והפוך את תמונות המחסנית. לחץ על יבא רצף תמונות מתפריט קובץ (קובץ | יבא | רצף תמונות) ובחר את התיקייה, שבה נשמרים התמונות שנרכשו. שים מילים מסוימות הכלולות בשם הקובץ לעמודה של File name מכיל.
  2. כדי להסיר את הרעש של הקרן הקוסמית על התמונות הביולומינסטיות, החל את התוסף לסינון Spikenoise של imagej/פיג'י. פתח את תמונות המחסנית ולחץ על מסנן Spikenoise.
  3. החל Savitzky Golay מסנן זמני plug-in כדי לקבל דינמיקה ברורה של הביטוי כתב. פתח את תמונות מחסנית ולחץ על Savitzky Golay מסנן זמני.
  4. כדי למדוד את עוצמת ביטוי הכתב, החל את היישום ' פרופיל ציר Z פלוס ' על כל תא בודד. בחר את התאים והגדר ROIs, אזור של עניין ולחץ על ציר Z פרופיל פלוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביטויים של הגנים Hes1/7 מחזור תנודות 2 המחזור בקווי התא השונים במהלך somitogenesis. יתרה מזאת, תקופת התנודה היא קצרה מאוד והן ה-mRNAs והחלבונים שלהם מאוד לא יציבים עם מחצית החיים של כ -20 דקות. אם נעשה שימוש בכתבת תגובה איטית, לא נוכל לעקוב אחר דינמיקה מהירה כזו, ואם נשתמש בכתב יציב, הדבר מצטבר בהדרגה בזמן שביטוי הגנים מואץ. לפיכך, העיתונאי חייב להיות מושפל במהירות כדי לעקוב אחר המחזור המהיר של גנים כאלה ביטא מחזוריות. כדי להתגבר על בעיות אלה, השתמשנו בכתב הלוציפראז כדי לעקוב אחר הביטוי הדינאמי של נדנוד. בגלל שלעיתונאי הביולומינסנציה יש זמן התבגרות קצר ורגישות גבוהה, הוא מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה המהירה של המאיירים. כמו כתב פלורסנט, העיתונאי לוציפראז יכול לפקח על הביטוי הדינמיקה של חלבון על ידי היותו מחובר לרצף קידוד גנים (איור 1a, איור 2E ואיור 3ד). לוציפראז-מוצרי גן מותמזגו התערוכה ביטוי זהה, תחלופת ו טרנסלוקציה בתאים כמו לעשות חלבונים אנדוגני. יתר על כן, כדי לפקח על פעילות היזם של הנדנוד הDll1גן, השתמשנו לוציפראז אוביפרותי, כתבת הלוציפראז לוציפראז (איור 1a ואיור 3א)23, שחצי החייםשלהם הוא כ -10 דקות. באמצעות סוגים שונים של כתבים לוציפראז, יצרנו עכברים טרנסגניים או עכברים שדפקו כדי להשיג ביטוי יציב של הכתב NPCs במהלך נוירוגנזה17. כדי להמחיש את הביטוי העיתונאי ברמות של תאים בודדים בתרבות הרקמה, עדיף הקדמה מפוזרת של כתב. לפיכך, השתמשנו בהעברה ארעית של גן העיתונאי לתוך NPCs באמצעות אלקטרופורציה של הרחם (איור 2F-H). מערכת העיתונאי לוציפראז שימש בתחום מקצבים אחראי לפקח על הביטויים הדינמיים של גנים שעון במשך תקופה ארוכה (למשל, 1 שבוע), הרומז כי ללוציפראז (D-ללוציפראז), המצע של האנזים לוציז גחלילית, הוא יציב מאוד אין רעילות עבור תאים חיים24,25. אנחנו בדרך כלל משתמשים לוציפראב בריכוזים של 1 מ"מ בתקשורת, אשר מספיקה עבור הדמיה של לילה-תא לחיות. יתר על כן, מערכת הדמיה מבוססי מיקרוסקופ מאפשר לנו לרכוש את התמונות רב מימדי, תמונות שדה בהיר, תמונות פלואורסצנטית ותמונות כימובסנס (איור 2F-H ואיור 3E).

בתנאים אלה דמיינו את הביטויים של גנים שונים בעלי מחלות שונות, כולל Hes1, Ascl1, Neurog2 וDll1 (דמויות 2 ואיור 3). תוצאות הנציג מוצגות באיור 3. העיתונאי של פעילות Dll1 יזם הציג מנדנוד ביטוי NPCs נגזר הטלנצאלון של Dll1-ורוב-Fluc עכברים הכתב. הכתבת לוציפראז (איור 3א) הצביעו על רגולציה חדה למעלה ולמטה של הביטוי של פעילות היזם (איור 3ב, ג). במקרה זה, תאים מחולל שלישי בודד הציגו בערך מחזור תנודות של 2.5 מחזורי עם הגברה שונות במהלך 13 שעות (איור 3ג). התגובה המהירה לוציפרראז הכתב מאפשר לנו ללכוד את הדינמיקה של השידור של איתות חריץ בין שני תאים חיים (איור 3D-F ומשלימה סרט S1). הכנו שני סוגים של תערובות DNA: (1) הכתבת Hes1 יזם (pHes1-רוב-לוק) ו-EGFP ביטוי וקטור, ו (2) Dll1 כתב חלבון (Dll1-לוק) ו מבטא mCherry וקטור והעביר אותם NPCs בנפרד. לאחר מכן אספנו את שני סוגי התאים ושיתוף התרבותי כדי למדוד את הביטוי של כתבים בתאים החיים. תוצאות הנציג מוצגות באיור 3E, F. בסמוך EGFP תאים חיוביים נושאים כתב Hes1 ו mCherry תאים חיוביים המבטא Dll1 כתב החלבון יצר קשר אחד עם השני במהלך התבוננות. Hes1 הביטוי עיתונאי בתא ירוק נראה להתחיל כ 60 דקות לאחר שני תאים מגע (איור 3E, F). זה הציע כי עיכוב הזמן עבור שידור של איתות חריץ בין תאים סמוכים היה כ 1 h. יתר על כן, במהלך שידור האות, ביטוי חלבון Dll1 הראה טרנסלוקציה דינמית בתא אדום (איור 3E).

Figure 1
איור 1: חיתוך של מוח העכבר העובריים. (א) מבנה של כתבים לוציפראז, כתב Dll1 יזם וכתבת חלבון Dll1. (ב) נוהל חיתוך. (א) ההשקפה הצדדית של עובר העכבר. (ב) לחתוך את הראש יחד עם קו מנוקד. (ג) להסיר את האפידרמיס ואת הסחוס מן הפער בין הטלנצלון לבין המוח האמצע. (ד) חתך את הרקמה המקיפה לאורך קו האמצע בין האונה הימנית לשמאלית. (ה) הסירו את הרקמה ממרכז הפריצה לשני הצדדים. (ו) הטלנצאלון ומוח האמצע לאחר הסרת הרקמה הסובבת. (ז) להפריד את הטלנצאלון (תל), אמצע המוח (בינוני) ונורת הריח (OB). (ח) חתך רוחב של הטלנצאלון, המוצג בקו מנוקד (גר'). (i) להסיר את הקרום מסביב לפני השטח של הטלנצאלון. (י) הפרד את הטלנצאלון לשני חלקים: האמצעי האמצעי והחלק הצדדי. (k) לחתוך את הגבול של קליפת המוח ו גנגלייוני (GE). (l) dorso-חלק רוחבי של קליפת המוח משמש לתרבות הדיסוציאציה. (ג) המוח ביום העובריים 14 (E14), המורכב מהמיאונות השמאליים (a) והימנית (b) של הטלנצאלון והמוח המימדי (C). (ד) האונות הtelencephalic הופרדו מהמוח האמצע. (ה) אחד גזור חצי הכדור של הטלנצאלון: החלק הרוחבי של הטלנצאלון כולל את ההאליסות (d), החלק החצי-שולי של הטלנצאלון המשמש לתרביות ולתרביות פרוסות (E), החלק האמצעי של הטלנצאלון (f) ומקרום המוח המכסים את המשטח (g). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הפיכת פרוסות קליפת הראש של הטלנצאלון העובריים והמחשה Dll1 חלבון בתרביות הפרוסה הקורטיקלית. (א) בודק את הביטוי של egfp באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי הזריחה. החץ האדום מראה את האזור של קליפת המוח המבטא EGFP. האונה השמאלית (א), האונה הימנית (ב) והמוח האמצע (ג). (ב) קווים מנוקדים מציינים את קווי המתאר של אזורי המוח המוצגים ב-(א). (ג) לגזור את קליפת הקליפה הצלעות. ראשי חץ לבנים מצביעים על הקצוות החתוכים. (ד) הפרוסות הקורטידיים של הטלנצאל הרוחבי. (ה) גנים מבנים של כתבים עבור המחשה הדינמיקה של חלבון Dll1 ב npcs. כתב החלבון Dll1, Dll1-Fluc (העליון) הוכנסו NPCs עם וקטור ביטוי EGFP (נמוך) כדי לפקח על מורפולוגיה והגירה של תאים בפרוסות הקורטיקלית. (F-H) תמונות תלת ממדיות של שדה בהיר (F), ביטוי Gfp (G) וביולומינסנציה (H) בפרוסת קליפת הראש. מערכת הדימות הביולומינציה מאפשרת לעקוב אחר הביטויים של לוציפראז וכתבת פלואורסצנטית בו זמנית. סרגלי קנה מידה: 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: נתוני הנציג להדמיה וניתוח של הביטוי הדינאמי של הגן Dll1 בתרבות NPC. (א) העיתונאי מונה לDll1 ביטוי ברמה הטרנסספית, תוך שימוש בכתב שהיה לוציפראז שאינו מעשה הערעור (רוב-לוציפראז). (ב) ויזואליזציה של הביטוי של Dll1 ב NPC יחיד עם כתב ביולומינסנציה. המספרים בלוח להראות את נקודות שיא של ביטוי מנדנוד של Dll1 המתאים למספרים בלוח C. (ג) מגרש קורס זמן של הביולומינציה NPC המונתק המוצג ב (ב), המציגות את הביטוי הדינמי של Dll1. (D-F) ויזואליזציה של הביטוי של כתב Hes1 יזם וכתבת חלבון Dll1 הביע בתאים הסמוכים. (ד) המבנה של כתב הHes1 של הפעילות היזם (PHes1-רוב-לוק) וכתבת החלבון Dll1 (Dll1-לוק). (E ו-F) התא החיובי EGFP הנושא כתבת Hes1 (Cell1) והתא החיובי mCherry הנושא את כתב החלבון Dll1 (Cell2) היו שותפים לתרבות והאור משני סוגי הכתבים נמדדו. הביטוי של כתב Hes1 בתא הירוק (cell1) נראה כאילו התחיל בערך 60 דקות לאחר ששני התאים יצרו קשר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

משלים סרט S1: ויזואליזציה של הביטוי של עיתונאי Hes1 יזם וכתבת חלבון Dll1 הביע בתאים הסמוכים, הקשורים לאיור 3ד-3f. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מרכיבי האיתות החריץ מציגים ביטויים מרוטים ב-סנכרון במהלך התקופה האחרונה, אלא מתוך סנכרון במהלך נוירוגנזה, המובילה לקשיים בלכידת דינמיקת הביטוי באמצעות ניתוח סטטי במקרה האחרון. לפיכך, ניטור זמן אמת נדרש כדי לחשוף את דינמיקת הביטוי של רכיבי איתות מדרגה, כגון Hes1 ו- Dll1. מכיוון שתקופות הביטויים של Hes1 ו- Dll1 תנודות קצרות ביותר, כ-2-3 h, תגובה מהירה וכתבים לא יציבים נדרשים לניטור דינמיקת הביטוי שלהם. למטרה זו פיתחנו את הכתב הביולומינסאלי ומערכת ההדמיה. הכתב הביולומינסאלי לוציפראז מראה קינטיקה התבגרות מהירה ורגישות גבוהה להתחקות אחר תחלופת מהירה של ביטויים כגון גנים מחזורית. מחזור מהיר של כתבים מוביל אותות קלוש מאוד שנוצרו. כדי לזהות אותות קלושים כאלה המיוצרים על ידי כתבים ביולומינסנציה, אנו משתמשים מערכת הדמיה ביולומינסנציה ממוטבת, כולל רגישות גבוהה, המצלמה CCD מקורר מים עם מהירות בדיקה נמוכה במיוחד (50 kHz), אשר מפחית את הרעש למינימום. יתר על כן, צמצם מספרי גבוה (N.A.) העדשה האובייקטיבית מאפשר לנו לאסוף את האור שוחרר מכתב לוציפראז הערעור במלואם. כדי לקבל רגישות גבוהה אנחנו בדרך כלל משתמשים binning גבוה יותר (g., 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) ולשמור על הצמצם לפתוח זמן רב (למשל, 5-20 דקות). מכיוון שהאות של הכתבים הלוציפרראז הוא קלוש מאוד, הפרעה של אור מהסביבה מהווה גם בעיה בזיהוי האות הקלוש: ולכן החדר המיקרוסקופ חייב להיות חשוך לחלוטין. מערכת זו מאפשרת לנו למדוד את הביטויים הדינמיים של Hes1 ו Dll1 גנים ב NPCs ברמות והחלבון הן טרנססקריפט וחלבונים (איור 3). בנוסף, אנחנו יכולים לדמיין את הדינמיקה חלבון של טרנסלוקציה תאיים עם כתבים התמזגו חלבון לוציפראז. יתר על כן, באמצעות התגובה המהירה לוציפראז הכתב, אנחנו יכולים ללכוד את הדינמיקה של השידור של איתות חריץ ולמדוד את העיכוב זמן עבור שידור האות בין שני תאים חיים (איור 3D-F ומשלימה סרט S1). יתר על כן, השילוב של כתב היזם (רוב-לוצין כתב) וכתבת חלבונים (לוציפראז פיוז'ן) של גן אחד מאפשר לנו למדוד את הזמן ההשהיה בין תמלול ותרגום של הגן. בדרך זו הדמיה מרובה של סוגים שונים של כתבים האור האור האור זמין כדי למדוד את הזמן עיכוב/קצב לתגובות ביוכימיים.

ניטור בזמן אמת של ביטויי גנים ברזולוציה תא בודד גילה כי יש וריאציות של דינמיקה ביטוי של אותו גן. תאים מסוימים מביעים Dll1/Neurog2 באופן מנדנוד, אך אחרים מציגים דפוסים מתמשכת. יתר על כן, הדינמיקה ביטויים שונים (מנדנוד לעומת יציב) לגרום לתפוקות שונות במצב של תאים. מה שנראה שהוא ברור הוא שהדינמיקה ביטוי שונה משפיעה על התנהגויות תא בדרכים שונות, ומציעה שהדינמיקה של הביטוי מקודדת מידע נוסף21,22,26,27,28,29,30,31,32. הניתוחים הסטטיים אינם יכולים ללכוד את הדינמיקה בביטוי הגנים, וניתוחים בזמן אמת נדרשים להבנת תופעות ביולוגיות כדי לחשוף את דינמיקת הביטוי באירועים סלולריים. הגישה שאנו מציגים כאן יכולה לנטר את הדינמיקה של מנוכי ההאמיטים במהלך ההתפתחות העצבית ברזולוציה גבוהה. בשיטה זו, גילינו שגנים רבים יותר מבוטאים באופן דינמי משחשבנו בעבר, ואנו יכולים לאתר לא רק את הדינמיקה של ביטוי החלבון אלא גם את הדינמיקה בלוקליזציה של חלבונים בתא ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה. תבניות ביטוי דינאמיות כאלה עשויות להיות בעלי חשיבות ביולוגית שעדיין יש להבהיר.

לכתבים ביולומינסנציה יש יתרון גדול ברזולוציית הזמן ורעילות נמוכה לתאים חיים לעומת כתבים פלואורסצנטית33. עם זאת, בניגוד לווריאציות צבע של כתבים פלורסנט, יש רק כמה צבעים בכתבי ביולומינסנציה, הטלת הגבלה על מספר הגנים שניתן לנטר בו זמנית. עם זאת, מספר גדל והולך של ללוציפראז משתנה מבודדים ומשוכפל מיצורים שונים34,35, ושימוש כזה מגוון של לוציטיות, נוכל לעקוב בו הדינמיקה ביטוי גנים מרובים בתא בודד ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה. הגודל המולקולרי של גחלילית לוציפראז גדול יותר כתבים הזריחה, אשר מציג כמה קשיים בבניית חלבונים התמזגו הכתב כדי לפקח על הדינמיקה חלבון, אבל לאחרונה, חדש, קטן ובהיר ללוציפראז כבר שוכפל36, אשר יאפשר לנו לדמיין את הדינמיקה חלבון קל מתמיד. מספר גדל והולך של דוחות הראו לאחרונה סוגים שונים של דינמיקה ביטוי גנים וטרנסלוקציה חלבון באירועים ביולוגיים שונים21,22,26,27,28,29,30,31,32. ניתוחים של הדינמיקה כגון ברגולציה זמן באמצעות מערכת ניטור בזמן אמת יהיה חשוב יותר ויותר ללכוד את מדינות בפועל של תאים ולחשוף את הרגולציה של מערכות הסלולר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין עניין פיננסי סותר.

Acknowledgments

אנו מודים ליומיקו איוומוטו על התמיכה בייצור וידאו. אנו גם אסירי תודה לאקיהירו איזוטורה לדיון ולתמיכה בניתוח תמונה, היטושי מייניה לתמיכה טכנית עבור דור של בעלי חיים טרנסגניים, Yuji Shinjo (האולימפוס מדע הרפואה), Masatoshi אגאווה (האולימפוס מדע הרפואה), Takuya אישיזו ( האולימפוס מדע הרפואה) ו Ouin Kunitaki (Andor יפן) עבור תמיכה טכנית ודיונים של מערכת הדמיה biלומינסנציה. עבודה זו נתמכת על-ידי מחקר הליבה של המדע האבולוציונית והטכנולוגיה (JPMJCR12W2) (ק), גרנט-עזרה עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים (MEXT 24116705 עבור H.S. ו MEXT 16H06480 עבור ק), גרנט ב-עזרה עבור מחקר מדעי (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), קרן טקדה (ק וH.S.), ופלטפורמה לגישות דינמיות למערכת החיים ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller) Julabo Model: F12-ED
Cooled CCD camera Andor Technology Model: iKon-M 934
Incubator system TOKAI HIT Model: INU-ONICS
Inverted microscope Olympus Model: IX81
Inverted microscope Olympus Model: IX83
LED illumination device CoolLED Model: pE1
MetaMorph MOLECULAR DEVICES Model: 40000
Mix gas controller Tokken Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens Olympus Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope Nikon Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope Leica Model: MZ16FA
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
PBS Nacalai Tesque 14249-24
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement invitrogen 12587-010
bFGF invitrogen 13256-029 Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin Nacalai Tesque 01493-85 Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase Worthington Biochemical Corporation LK003172 Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS Worthington Biochemical Corporation LK003188
Glass bottom dish IWAKI 3910-035
N2 supplement (100x) invitrogen 17502-048
N-acetyl-cystein Sigma A-9165-25G
Papain Worthington Biochemical Corporation LK003178 Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine Nacalai Tesque 09367-34
Poly-L-lysine Sigma P-6281 40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe TERUMO 181228T
Electrode Neppagene 7-mm
Electroporator Neppagene CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes Kawamoto co. 7161
Micro capillary Made in-house
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Pentbarbital Kyoritsuseiyaku Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2
Xylazine Bayer Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
Culture insert Millipore PICM01250
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Fetal Bovine Serum Sigma 172012-500ML
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Forceps
Horse Serum Gibco 16050-122
Micro surgical knife Alcon 19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator Panasonic MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media Made in-house ref. NPC dissociatioin culture
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board Made in-house

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 154 הדמיה בזמן אמת ביולומינסנציה לוציפראז תנודה איתות מדרגה נוירוגנזה
בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time… More

Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (154), e60455, doi:10.3791/60455 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter