Summary
Células de tronco neural/progenitor apresentam várias dinâmicas de expressão de componentes de sinalização notch que levam a diferentes resultados de eventos celulares. Essa expressão dinâmica pode ser revelada pelo monitoramento em tempo real, não pela análise estática, usando um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível que permite a visualização de mudanças rápidas nas expressões gênicas.
Abstract
A sinalização de notch regula a manutenção de células-tronco/progenitoras neurais por interações célula-célula. Os componentes da sinalização notch exibem expressão dinâmica. Notch sinalização efetor Hes1 e o Notch ligand Delta-like1 (Dll1) são expressos de forma oscilatória em células de tronco neural / progenitor. Como o período de expressão oscilatória desses genes é muito curto (2 h), é difícil monitorar sua expressão cíclica. Para examinar tais mudanças rápidas na expressão do gene ou na dinâmica da proteína, os repórteres rápidos da resposta são exigidos. Devido à sua rápida maturação cinética e alta sensibilidade, o repórter de bioluminescência luciferase é adequado para monitorar mudanças rápidas de expressão gênica nas células vivas. Usamos um repórter lúciferase desestabilizado para monitorar a atividade do promotor e um repórter luciferase fundido para visualização da dinâmica de proteínas na resolução de célulaúnica. Estes repórteres da bioluminescência mostram o retorno rápido e geram sinais muito fracos; Portanto, desenvolvemos um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível para detectar tais sinais fracos. Esses métodos nos permitem monitorar várias dinâmicas de expressão gênica em células vivas e tecidos, que são informações importantes para ajudar a entender os estados celulares reais.
Introduction
O cérebro de mamíferoé composto por um grande número de vários tipos de neurônios e células gliais. Todas as células são geradas a partir de células de tronco neural /progenitoras (NPCs), que primeiro proliferam para expandir seus números, em seguida, começam a se diferenciar em neurônios e, finalmente, dar origem às células gliais1,2,3,4,5. Uma vez que as células se diferenciaram em neurônios, elas não podem proliferar ou aumentar seus números e, portanto, a manutenção de NPCs até estágios posteriores é importante. Notch sinalização através de interações célula-célula desempenha um papel importante na manutenção npcs6,7. Os ligantes de notch interagem com a proteína da membrana, Notch, na superfície das células vizinhas e ativa mproteína Notch. Após a ativação, ocorre a proteólese da proteína Notch, liberando assim o domínio intracelular de Notch (NICD) da membrana celular para o núcleo8,9,10. No núcleo, nicd liga-se às regiões promotorde Hes1 e Hes5 (Hes1/5)e ativa a expressão desses genes. Hes1/5 reprimir a expressão dos genes proneuris Ascl1 e Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Como os genes neurais induzem a diferenciação neuronal, Hes1/5 desempenha papéis essenciais na manutenção de NPCs. Além disso, como os genes proneuris podem ativar a expressão do Entalhe ligand Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 também reprimir a expressão de Dll1. Portanto, a expressão de Dll1 leva a células vizinhas sendo negativa para Dll1 via sinalização Notch. Desta forma, as células inibem as células adjacentes de seguir seu mesmo destino, um fenômeno conhecido como a inibição lateral8. No cérebro em desenvolvimento, a inibição lateral desempenha um papel na geração de vários tipos de células diferentes.
Imagens em tempo real no nível único celular revela expressões dinâmicas dos componentes da sinalização Notch em NPCs15,16,17. Notch sinalização ativa a expressão de Hes1, mas a proteína Hes1 se liga ao seu próprio promotor e reprime sua própria expressão. Além disso, Hes1 é uma proteína extremamente instável, que é degradada pela via ubiquitina-proteasome; Portanto, a repressão de seu próprio promotor é de curta duração e, em seguida, a transcrição começa novamente. Desta forma, a expressão de Hes1 oscila tanto nos níveis de transcrição quanto translacional em um ciclo18de 2 h. A expressão oscilatória de Hes1, por sua vez, induz a expressão oscilatória dos genes-alvo a jusante, como Ascl1, Neurog2 e Dll1, via repressão periódica15,16,17, 19. Enquanto os genes neurais podem induzir diferenciação neuronal, sua expressão oscilatória não é suficiente para diferenciação neuronal; sim sua expressão sustentada é essencial para a diferenciação neuronal. A expressão oscilatória de genes proneuris é importante para a manutenção de NPCs em vez de induzir diferenciação neuronal14,15,16. A expressão de Dll1 oscila em ambos os níveis de transcrição e translação durante várias morfogêneses, como neurogênese e somitogênese. A expressão dinâmica do Dll1 é importante para a morgênese normal e expressão constante de Dll1 induz defeitos na neurogênese e somitogênese17. Estes resultados demonstram a função importante que a dinâmica da expressão do gene e da cinética da proteína tem no regulamento de vários eventos desenvolventes (isto é, dinâmica diferente da expressão produz saídas diferentes em comportamentos celulares).
Para analisar a dinâmica da sinalização notch, a análise estática de tecidos e células são insuficientes porque eles estão em constante mudança. Imagens em tempo real de células únicas é uma ferramenta poderosa para revelar a dinâmica na expressão gênica. A expressão dinâmica das moléculas de sinalização notch sofre respostas cíclicas rápidas no período de 2-3 h. Esta rápida expressão periódica apresenta dois problemas difíceis para o monitoramento em tempo real: (1) a expressão das moléculas é suprimida a níveis baixos, e (2) a rotatividade rápida requer repórteres de resposta rápida. Para superar esses problemas, anteriormente desenvolvemos um método de imagem em tempo real de bioluminescência20. Como o repórter de bioluminescência tem maior sensibilidade e menor tempo de maturação do que os repórteres fluorescentes, essa estratégia nos permite monitorar a dinâmica rápida nas células vivas. Usando a visualização em tempo real, descobrimos que mais genes exibiam expressão dinâmica do que pensávamos anteriormente. Além disso, o número de relatos que mostram expressão e dinâmica proteica em células vivas e o significado dessas dinâmicas em vários eventos biológicos tem aumentado, sugerindo um papel fundamental da dinâmica nas expressões gênicas21,22.
Neste relatório, descrevemos uma maneira de visualizar a expressão do Notch ligand Dll1 em NPCs em culturas dissociadas e em culturas de fatias corticais. Para monitorar a dinâmica da transcrição Dll1 em níveis de célulaúnica, geramos culturas dissociadas de NPCs derivadas da telencefalon embrionária de camundongos transgênicos carregando repórter pDll1-Ub-Fluc, um repórter lúciferase desestabilizado dirigido por promotor dll1. Para monitorar a dinâmica da proteína Dll1 in vivo, introduzimos o repórter de fusão Dll1-Fluc em NPCs no córtex e visualizamos a expressão do repórter em NPCs em culturas de fatias corticais. Imagens em tempo real nos permitiram capturar as várias características da expressão gênica e da dinâmica proteica em células vivas em alta resolução temporal.
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Protocol
Todo o procedimento, incluindo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee no instituto de Frontier Life and Medical Sciences, Universidade de Kyoto.
1. Repórteres de bioluminescência
NOTA: O repórter luciferase é adequado para medir a dinâmica rápida da atividade promotora, fundindo o sinal de degradação. Além disso, o repórter de fusão luciferase permite o monitoramento da dinâmica proteica na única célula. Ambos os tipos de repórteres estão disponíveis para a cultura mono-camada (cultura da dissociação) e a cultura do tecido (cultura da fatia) experiência.
- Repórter para o monitoramento dll1 promotor atividade17
NOTA: Para monitorar as rápidas mudanças na expressão gênica, a resposta rápida e repórter instável é essencial. Firefly luciferase (Fluc) mostra maturação rápida em comparação com os repórteres de fluoresceina. Como a ubiquitina fundiu o repórter luciferase (Ub-Fluc) mostra rápida degradação e rotatividade rápida, é muito útil monitorar a expressão gênica dinâmica nas células vivas20.- Use Dll1 promotor-driven desestabilizado luciferase repórter, luciferase ubiquitinated (pDll1-Ub-Fluc, Figura 1Um painel superior), para monitorar as rápidas mudanças na expressão Dll1 em um nível transcricional17.
- Gerar uma linha de mouse transgênico carregando pDll1-Ub-Fluc para a expressão estável deste repórter.
- Repórter para o monitoramento dll1 dinâmica da proteína17.
- Para a geração de camundongos knock-in, insira o cDNA luciferase no 3'termini da região codificadora Dll1 para que a proteína de fusão Dll1-luciferase seja expressa (repórter Dll1-Fluc, Figura 1A,painel inferior)17.
- Monitorar a dinâmica de expressão do Dll1 em níveis de proteína, medindo a atividade luciferase.
- Para monitorar a dinâmica da proteína Dll1 nos níveis dos tecidos, introduza o repórter Dll1-Fluc em NPCs na telencefalon embrionária por na eletroporação do útero.
2. Sistema de imagem de bioluminescência
- Construa um sistema de imagem ao vivo de bioluminescência usando um microscópio invertido instalado com uma câmera CCD altamente sensibilidade e refrigerada a água. A fim de reduzir o ruído e obter alta sensibilidade, arrefecer a câmera com água gelada fornecida pelo circulador de água a uma temperatura otimizada de -90 °C.
- Para a imagem de célula/tecido vivo, instale o sistema de incubação, controlando a temperatura e o gás misto, até o estágio do microscópio.
- Para a imagem da imagem da expressão do repórter luciferase desestabilizado, use o ângulo numérico elevado (NA: 1.30) lente objetiva da óleo-imersão de 40x. A distância de trabalho desta lente é de 0,2 mm, ela está disponível não só para a cultura celular monocamada, mas também a cultura de fatia.
- Para o monitoramento duplo da expressão de luciferase e repórter de fluoresceina, instale o dispositivo de iluminação LED no caminho de luz do microscópio.
- Controle a imagem de lapso de tempo com um software associado ao microscópio (por exemplo, programa de aquisição multidimensional do software MetaMorph).
- Prepare todo o sistema em uma sala escura, porque o sinal do repórter lúciferase desestabilizado é muito fraco, e para evitar a luz estranha impedir a aquisição.
3. Culturas de dissociação de células de tronco/progenitor neural (NPC)
- Preparação de mídia cultural, pratos e reagentes para a cultura de dissociação do NPC
- Prepare a mídia N2/B27 para cultivar células de tronco/progenitor neural com uma concentração final de 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetilcysteine, 10 ng/mL bFGF e 50 U/mL Penicilina/Streptomicina na mídia DMEM/F12.
- Prepare a solução de papaína para dissociação contendo 7 U/mL papain, 0,006% DNase e 1 mM N-acetilcisteína na mídia EBSS.
- Prepare 100 mM de solução de sódio luciferinpara imagens de luminescência. Diluir a solução luciferin de 100 mM nos meios N2/B27 para uma concentração final de 1 mM.
NOTA: Luciferin mostra auto-fluorescein em si. No caso da imagem dual luciferase-fluorescência dupla, especialmente EGFP, reduzindo a concentração de luciferino para 0,5 mM é melhor. - Cubra uma solução de fundo de vidro de 35 mm (diâmetro de vidro de 27 mm) com 40 μg/mL de solução poli-L-lisina (PLL) por 1 h à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as placas 3x com PBS e deixe secar.
- Dissecção de embriões e dissociação de NPCs
- Depois de eutanásia de um rato transgênico pDll1-Ub-luc grávida (dia embrionário 12.5 (E12.5)) por asfixia de CO2 e deslocamento cervical, cortado no abdômen e tirar o útero.
NOTA: Os pesquisadores devem seguir os regulamentos e diretrizes do comitê de pesquisa animal de sua instituição. Se a anestesia ou drogas de alívio da dor são usados, usá-los corretamente. - Transfira o útero em uma placa de Petri de 10 cm contendo 25 mL de PBS gelada. Retire os embriões do útero em PBS gelada, usando micro tesouras e fórceps finos.
- Corte a cabeça de cada embrião usando tesoura e transfira-a para 10 cm de placas de Petri contendo DMEM/F12 geladas. Retire a epiderme e cartilagem em torno do cérebro e transferir o cérebro para 35 mm placa de Petri contendo gelo frio 3 mL de mídia N2/B27.
- Cortar o telencefalon direito e esquerdo do diencefalon (Figura 1Ba-f, C,D). Retire as meninges que cobrem a superfície do telencefalon usando fórceps finos (Figura 1Bi). Usando fórceps finos novamente, retire a parte dorso-lateral do córtex do telencefalon (Figura 1Bg,h,j-l E).
- Transfira os tecidos para novos tubos de 1,5 mL usando uma pipeta P1000 e retire qualquer meio extra com uma pipeta P200. Adicione 0,1 mL de solução de papaina por tecido cerebral (um par do córtex). Após 15 min de incubação a 24 °C, delicadamente pipeta as amostras 10 vezes com pipeta P1000. Incubar as amostras novamente por 15 min a 24 °C.
- Delicadamente pipeta as amostras 10 vezes com pipeta P1000. Centrífugas as amostras de 3 min a 400 x g e temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatant.
- Adicione 1 mL de mídia DMEM/F12 à pelota. Delicadamente pipeta 10 vezes com pipeta P1000. Centrífuga as amostras de 3 min a 400 x g e RT. Descarte o supernatant. Repita isso pelo menos mais 2 vezes.
- Para a pelota, adicione 0,5 mL de mídia N2/B27 contendo 1 m luciferin e misture bem. Sementes das células (1 x 106 células) para um prato de fundo de vidro revestido pll. Cultura as células da incubadora de CO2 para 1 h. Uma vez que as células aderem ao prato, adicione 2 mL de mídia N2/B27, contendo 1 mM luciferin.
- Depois de eutanásia de um rato transgênico pDll1-Ub-luc grávida (dia embrionário 12.5 (E12.5)) por asfixia de CO2 e deslocamento cervical, cortado no abdômen e tirar o útero.
- Visualização da expressão de repórter lúciferase na cultura de dissociação do NPC
- Inicie o sistema de imagem ao vivo de luminescência antes de realizar a dissecação. Para a cultura NPC, definir a temperatura da incubadora de palco em 37 °C e definir a configuração da mistura de gás 20% O2, 5% CO2.
- Coloque o óleo de imersão para a lente objetiva. Coloque o prato de amostra no estágio do microscópio. Veja o campo manualmente e escolha a melhor posição e o foco das células de interesse. Clique ao vivo para adquirir a imagem do teste.
- Executar a aquisição de lapso de tempo por aquisições bidimensionais (luminescência e campo brilhante) por 24 h com o programa de aquisição multidimensional. Escolha o programa de aquisição multidimensional e defina a configuração de aquisição da seguinte forma (passo 3.3.6).
- Para aquisição de imagem de luminescência, use as seguintes configurações da câmera: baixa taxa de transferência (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 min/5 min tempo de exposição. Para aquisição de imagem de campo brilhante, use as seguintes configurações: taxa de transferência intermediária (1 MHz), 1 x 1 binning e 100 ms tempo de exposição.
4. Na eletroporação do útero
NOTA: Isso é realizado para a introdução do repórter Dll1-Fluc nas células progenitoras neurais.
- Preparação de ferramentas e reagentes para eletroporação
- Prepare micro capilares para injeção de DNA no ventrículo da telencefalon embrionária. Estique um capilar de grama com calor e corte e espolie a ponta dele com a máquina de polimento.
- Prepare uma mistura de DNA com tinuismo (por exemplo, trypan azul). A concentração de cada DNA é de 1 μg/μL na PBS e adiciona o tinudeve a uma concentração final de 10%.
NOTA: Use a mistura de DNA para visualização da dinâmica proteica Dll1 da seguinte forma: Dll1-Fluc (repórter de proteína Dll1, Figura 2E superior)e pEF-EGFP (vetor de expressão do EF dirigido eGFP, Figura 2E menor),monitorando a localização e morfologia das células infectadas. - Prepare dois tipos de anestésicos: 3,88 mg/mL de pentobarbital e 0,12% de xilazine, em 1x PBS estéril.
- Use os instrumentos estéreis e luvas cirúrgicas durante a operação.
- Na eletroporação do útero
- Anestésico um rato ICR grávida de tempo (E12.5) pela administração intraperitoneal de anestésicos com 500 μL de 3,88 mg/mL pentobarbital e 500 μL de 0,12% xilazine.
NOTA: Os investigadores devem seguir a regulação de experimentos com animais. Se é preciso usar anestesia ou drogas para alívio da dor, usá-los corretamente. - Clip o cabelo e desinfetar a pele com esfoliação cirúrgica.
- Verifique se há falta de resposta pitada do dedo do dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo do lado. Uma vez que o reflexo do pedal não é observado, faça um corte de 2-3 cm através do abdômen ao longo da linha média. Coloque gazes em torno da parte dissecada e molhar as gazes com PBS quente para não secar a incisão. Retire o chifre uterino direito suavemente com fórceps em forma de anel e conte o número de embriões.
- Injetar 1-2 μL do DNA misto no ventrículo do telencefalon de embriões suavemente com micro capilar.
NOTA: Quando a injeção é bem sucedida, pode-se ver a cor azul do corante sobre a superfície do útero. - Molhe o útero e o eletrodo antes de fornecer os pulsos de tensão, e, em seguida, segure a cabeça de um embrião suavemente. Definir o eletrodo carregado positivamente para o lado do hemisfério, em que o DNA foi injetado. Certifique-se de que a condição do pulso de eletroporação é 30-50 V para 50 ms, o intervalo dos pulsos é de 1 s (50 ms carga e 950 ms não-carga). Fornecer 5 pulsos para um embrião e verificar se as bolhas são geradas a partir do eletrodo carregado negativamente.
NOTA: Certifique-se de que a direção do eletrodo: o DNA é incorporado em células do lado do eletrodo positivo. Durante este procedimento, não mova a posição do eletrodo. - Repita os passos 4.2.3-4.2.4 para outros embriões e retorne o chifre uterino à cavidade abdominal. Realize o mesmo procedimento para os embriões no chifre uterino esquerdo.
- Depois de colocar de volta o lado esquerdo, sutura da incisão por uma sutura de seda (4-0) com uma agulha (17 mm). Antes de fechar a incisão completamente, coloque PBS quente na cavidade abdominal
NOTA: O intervalo entre as suturas é de cerca de 2 mm. - Depois de terminar a cirurgia, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para recuperação pós-anestesia. Abrigar o mouse individualmente.
NOTA: Os investigadores devem seguir a sua regulação instiutional local de experimentos com animais. Se é preciso usar drogas de alívio da dor, usá-los corretamente.
- Anestésico um rato ICR grávida de tempo (E12.5) pela administração intraperitoneal de anestésicos com 500 μL de 3,88 mg/mL pentobarbital e 500 μL de 0,12% xilazine.
5. Preparação de culturas de fatia do córtex em desenvolvimento e visualização da expressão repórter lúciferase nas fatias corticais
- Preparação de mídia cultural e reagentes para fatia culturas do córtex
- Prepare meios enriquecidos para cultivar fatias corticais contendo 5% de soro bovino fetal e 5% de soro de cavalo na mídia N2/B27.
- Bolha 100% O2 gás através dmem/ f12 mídia para dissecação e fazer fatias cortical.
NOTA: Para usar gás oxigênio com segurança, armazenar o cilindro O2 no armário do cilindro e monitorar a concentração de oxigênio no ar por um medidor de concentração de oxigênio. - Diluir a solução de sódio luciferin de 100 mM em mídia enriquecida para uma concentração final de 1 mM.
NOTA: Luciferin mostra auto-fluorescein em si. No caso da imagem dual luciferase-fluorescência dupla, especialmente EGFP, menor concentração de luciferin (0,5 mM) é melhor. - Defina a incubadora multigás a 37 °C em 40% O2 e 5% CO2.
- Dissecção de embriões e exame da expressão do repórter fluorescente
- Depois de eutanásia do rato grávida para que os repórteres (E13.5) são introduzidos pela eletroporação no útero (passo 4.2), cortar o abdômen e tirar o útero.
NOTA: Os investigadores devem seguir a regulação de experimentos com animais. Se usar anestesia ou drogas para alívio da dor, use-as corretamente. - Transfira o útero para uma placa de Petri de 10 cm contendo PBS. Retire os embriões do útero em PBS, usando micro tesouras e fórceps finos. Corte a cabeça de cada embrião e transfira para uma placa de Petri de 10 cm contendo mídia DMEM/F12 borbulhada com gás 100% O2. Remover epiderme e cartilagem em torno do cérebro na mídia DMEM/ F12.
- Coloque o cérebro na tampa da placa de Petri com fórceps em forma de anel e coloque a tampa no estágio de microscópio estereoscópico de fluorescência. Verifique a região do córtex expressando proteína fluorescente a luz de excitação(Figura 2A,B).
- Transfira o cérebro para uma placa de corte de borracha de silicone cheia de 30 mL de mídia DMEM/F12 borbulhada com gás 100% O2. Retire meninges cobrindo a superfície da telencefalon por fórceps finos.
- Corte a fronteira entre parte medial e lateral do telencefalon dorsal e separe em dois hemisférios usando micro faca cirúrgica ou fórceps finos. Usando uma micro faca cirúrgica, corte o córtex como listras e faça fatias corticais(Figura 2C,D). Fatias de pipeta com meio usando pipeta e transferi-las para a mídia enriquecida em um prato de 35 mm.
- Coloque as fatias nas inserções culturais nos pratos de fundo de vidro com mídia enriquecida. Corrija a direção das fatias usando fórceps finos. Configure a superfície cortada das fatias na superfície da inserção da cultura. Retire a mídia extra por uma pipeta. Incubar as fatias na incubadora multi-gás definida por 40% O2 e 5% CO2 a 37 °C por 30 min.
- Adicione 300 μL de mídia enriquecida contendo 1 mm luciferin para o exterior da cultura inserir no prato de fundo de vidro.
- Depois de eutanásia do rato grávida para que os repórteres (E13.5) são introduzidos pela eletroporação no útero (passo 4.2), cortar o abdômen e tirar o útero.
- Visualização da expressão de repórter lúciferase em culturas fatia
- Comece o sistema de imagem ao vivo de luminescência antes de iniciar a dissecação. Use a seguinte condição de culturas de fatias corticais: 40% O2,5% CO2 e 37 °C.
- Coloque o óleo de imersão para lente 40x objetivo. Coloque o prato de amostra para o estágio do microscópio. Adquirir a imagem de teste de fluorescente e definir a posição eo plano de foco para a região de interesse a iluminação da luz de excitação.
- Executar a aquisição de lapso de tempo por 3-dimentional (luminescência, fluorescência e campo brilhante) aquisições para 24 h(Figura 2F-H). Para aquisição de imagem de luminescência, use as seguintes configurações da câmera: baixa taxa de transferência (50 kHz), 2x2/4x4 binning, tempo de exposição de 10 min/5 min. Para a fluorescência e a aquisição de imagem de campo brilhante, use as seguintes configurações: taxa de transferência intermediária (1 MHz), 1x1 binning e 100 ms tempo de exposição.
6. Processamento e análise de imagem
- Conecte cada imagem e faça as imagens da pilha. Clique na sequência de imagens de importação do menu de arquivos (Arquivo | Importação | Sequência de Imagem)e escolha a pasta, onde as imagens adquiridas são salvas. Coloque algumas palavras contidas no nome do arquivo para a coluna de nome File contém.
- Para remover o ruído do raio cósmico nas imagens de bioluminescência, aplique o plug-in do Filtro SpikeNoise do ImageJ/Fiji. Abra as imagens da pilha e clique no Filtro SpikeNoise.
- Aplique savitzky golay filtro temporal plug-in para obter uma clara dinâmica de expressão repórter. Abra as imagens da pilha e clique em Savitzky Golay Filtro Temporal.
- Para medir a intensidade da expressão do repórter, aplique o plug-in Z Axis Profile Plus a cada célula. Selecione as células e defina ROIs, região de interesse e clique no Z Axis Profile Plus.
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Representative Results
Expressões dos genes Hes1/7 exibem 2 h ciclo de oscilação em várias linhas celulares e durante a somitogênese. Além disso, o período de oscilação é muito curto e tanto os seus mRNAs como as proteínas são extremamente instáveis, com a meia-vida de cerca de 20 min. Se usar um repórter de resposta lenta, não podemos rastrear uma dinâmica tão rápida, e se usar um repórter estável, ele gradualmente se acumula enquanto a expressão gênica oscila. Assim, o repórter deve ser rapidamente degradado para monitorar a rápida rotatividade de tais genes expressos ciclicamente. Para superar esses problemas, usamos o repórter lúciferase para monitorar a expressão dinâmica dos osciladores. Como o repórter de bioluminescência tem um curto tempo de maturação e alta sensibilidade, isso nos permite monitorar a rápida dinâmica dos osciladores ultradianos. Como um repórter fluorescente, o repórter lúciferase pode monitorar a dinâmica de expressão de uma proteína por ser fundido à seqüência de codificação de genes (Figura 1A, Figura 2E e Figura 3D). Os produtos genéticos fundidos com luciferase exibem a mesma expressão, rotatividade e translocação cinética nas células que fazem as proteínas endógenas. Além disso, para monitorar a atividade promotora do gene oscilante Dll1, usamos luciferase ubiquitinada, um repórter lúciferase desestabilizado (Figura 1A e Figura 3A)23, cuja meia-vida é de cerca de 10 min20. Usando vários tipos de repórteres lúciferase, nós geramos ratos transgênicos ou ratos batidos para obter a expressão estável do repórter em NPCs durante a neurogênese17. Para visualizar a expressão do repórter em níveis unicelulares na cultura do tecido, a introdução dispersa do repórter é preferível. Assim, usamos transfecção transitória do gene repórter em NPCs via eletroporação utero (Figura 2F-H). O sistema de repórter luciferase tem sido usado no campo dos ritmos circadianos para monitorar as expressões dinâmicas dos genes do relógio por um longo período (por exemplo, 1 semana), sugerindo que a luciferin (D-luciferin), o substrato da enzima lúciferase firefly, é muito estável e não tem toxicidade para as células vivas24,25. Nós usamos geralmente o luciferin nas concentrações de 1 mM nos meios, que é suficiente para a imagem latente da vivo-pilha de noite. Além disso, o sistema de imagem baseado em microscópio nos permite adquirir as imagens multidimensionais, imagens de campo brilhante, imagens de fluorescência e imagens de chemiluminescence (Figura 2F-H e Figura 3E).
Usando essas condições, visualizamos as expressões de vários genes do relógio ultradiano, incluindo Hes1, Ascl1, Neurog2 e Dll1 (Figuras 2 e Figura 3). Os resultados representativos são mostrados na Figura 3. O repórter da atividade promotor Dll1 exibiu expressão oscilatória em NPCs derivados da telencefalon de camundongos repórter Dll1-Ub-Fluc. O repórter lúciferase desestabilizado (Figura 3A)indicou regulação acentuada para cima e para baixo da expressão da atividade promotora (Figura 3B,C). Neste caso, as células progenitoras neurais únicas apresentaram um ciclo de oscilação de aproximadamente 2,5 h com várias amplitudes ao longo de 13 h (Figura 3C). O repórter luciferase de resposta rápida nos permite capturar a dinâmica de transmissão de Sinalização notch entre duas células vivas (Figura 3D-F e Filme Suplementar S1). Preparamos dois tipos de misturas de DNA: (1) repórter promotor Hes1 (pHes1-Ub-luc) e vetor de expressão EGFP, e (2) Repórter de proteína Dll1 (Dll1-Luc) e vetores de expressão mCherry e os transfetia em NPCs separadamente. Em seguida, recolhemos os dois tipos de células e co-culto para medir a expressão de repórteres em células vivas. Os resultados representativos são mostrados na Figura 3E,F. Células positivas adjacentes do EGFP carregando células positivas do repórter Hes1 e mCherry expressando o repórter de proteína Dll1 contatados entre si durante a observação. Hes1 expressão repórter em uma célula verde parecia começar cerca de 60 min após o contato de duas células (Figura 3E,F). Isto sugeriu que o atraso de tempo para a transmissão de Notch sinalização entre as células adjacentes foi de cerca de 1 h. Além disso, durante a transmissão de sinal, a expressão proteica Dll1 mostrou translocação dinâmica em uma célula vermelha (Figura 3E).
Figura 1: Dissecação do cérebro do rato embrionário. (A)A estrutura dos repórteres lúciferase, repórter promotor Dll1 e repórter de proteína Dll1. (B) Procedimento de dissecação. (a)A visão lateral de um embrião de rato. Cortara cabeça junto com a linha pontilhada. (c)Retire a epiderme e cartilagem da lacuna entre a telencefalon e midbrain. (d)Corte o tecido circundante ao longo da linha média entre os hemisférios direito e esquerdo. (e)Retire o tecido da ruptura central para ambos os lados. (f)A telencefalon e o midbrain após a remoção do tecido circundante. (g)Separe o telencefalon (tel), midbrain (mid) e bulbo olfativo (OB). (h)Seção transversal do telencefalon, mostrada na linha pontilhada em(g). (i)Retire as meninges que cercam a superfície da telencefalon. (j)Separar a telencefalon em duas partes: parte medial e lateral. Cortea fronteira do córtex e da eminência ganglionélica (GE). (l)Dorso-lateral parte do córtex é usado para a cultura de dissociação. (C) O cérebro no dia embrionário 14 (E14), composto pela esquerda(a)e direita (b)hemisférios da telencefalon e do midbrain(c). (D)Os hemisférios telencefálicos separados do midbrain. (E)Um hemisfério dissecado do telencefalon: a parte ventrolateral do telencefalon que inclui as eminências ganglionic(d),a parte dorsolateral do telencephalon usado para culturas dissociadas e culturas da fatia(e),a parte medial do telencephalon(f)e os meninges que cobrem a superfície do cérebro (g). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Fazer as fatias corticais da telencephalon embrionária e visualizar a dinâmica da proteína Dll1 nas culturas corticais da fatia. (A)Verificar a expressão do EGFP usando microscópio estereoscópico de fluorescência. A seta vermelha mostra a região do córtex expressando OGFP. O hemisfério esquerdo (a),o hemisfério direito (b) e o midbrain(c). (B) Linhas pontilhadas indicam os contornos das regiões cerebrais mostradas em (A). (C)Córtex dissecado do telencefalon dorsolateral. As pontas de flechabrancas indicam as bordas cortadas. (D)Fatias corticais do telencephalon dorso-lateral. (E)Estruturas genéticas de repórteres para visualizar a dinâmica proteica Dll1 em NPCs. O repórter de proteína Dll1, Dll1-Fluc (superior) foi introduzido em NPCs com um vetor de expressão do EGFP (inferior) para monitorar a morfologia e migração de células nas fatias corticais. (F-H) (F-H) (F-H) (F Imagens tridimensionais de campo brilhante (F),expressão GFP (G), e bioluminescência (H)na fatia cortical. O sistema de imagem de bioluminescência permitiu traçar as expressões de luciferase e repórter de fluorescência simultaneamente. Barras de escala: 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Dados representativos para visualização e análise da expressão dinâmica do gene Dll1 na cultura npc. (A)O repórter constrói para visualizar a expressão Dll1 no nível transcricional, usando um repórter lúciferase desestabilizado (Ub-luciferase, luciferase ubiquitinada). (B) Visualização da expressão de Dll1 em um único NPC com um repórter de bioluminescência. Os números do painel mostram os pontos de pico da expressão oscilatória do Dll1 correspondenteaos números no painel C. (C)Um traça do curso de tempo da bioluminescência do NPC dissociado mostrado em (B), exibindo a expressão dinâmica do Dll1. (D-F) Visualização da expressão do repórter promotor Hes1 e repórter de proteína Dll1 expressa nas células vizinhas. (D)A estrutura do repórter de atividade promotor Hes1 (pHes1-Ub-luc) e repórter de proteína Dll1 (Dll1-Luc). (E e F) A célula positiva do EGFP carregando o repórter Hes1 (Cell1) e a célula positiva mCherry carregando o repórter de proteína Dll1 (Cell2) foram co-cultivadas e a luminescência de ambos os tipos de repórteres foi medida. A expressão do repórter Hes1 na célula verde (cell1) parecia começar cerca de 60 min após as duas células contactado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Filme Suplementar S1: Visualização da expressão do repórter promotor Hes1 e repórter de proteína Dll1 expressa nas células vizinhas, relacionadas à Figura 3D-3F. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique direito para download.)
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Discussion
Os componentes da sinalização notch mostram expressões oscilatórias em sincronia durante a somitogênese, mas fora de sincronia durante a neurogênese, levando às dificuldades em capturar a dinâmica de expressão por análise estática neste último caso. Assim, o monitoramento em tempo real é necessário para revelar a dinâmica de expressão dos componentes de sinalização notch, como Hes1 e Dll1. Porque os períodos das expressões das oscilações de Hes1 e Dll1 são extremamente curtos, aproximadamente 2-3 h, a resposta rápida e os repórteres instáveis são exigidos monitorando sua dinâmica da expressão. Para isso, desenvolvemos o repórter de bioluminescência e o sistema de imagem. O luciferase do repórter da bioluminescência mostra a cinética rápida da maturação e a sensibilidade elevada para seguir o retorno rápido de tais expressões cíclicas do gene. A rápida rotatividade de repórteres leva a sinais muito fracos gerados. Para detectar tais sinais fracos produzidos pelos repórteres de bioluminescência, usamos um sistema otimizado de imagem de bioluminescência, incluindo uma câmera CCD de alta sensibilidade e refrigerada à água com uma velocidade de leitura ultra-baixa (50 kHz), o que reduz o ruído ao mínimo. Além disso, uma alta abertura numérica (N.A.) lente objetiva nos permite recolher a luz liberada do repórter lúciferase desestabilizado ao máximo. Para obter uma sensibilidade mais elevada, costumamos usar binning maior (por exemplo, 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) e manter o obturador para abrir por um longo tempo (por exemplo, 5-20 min). Como o sinal dos repórteres lúciferase é extremamente fraco, a interferência da luz do ambiente também apresenta um problema na detecção do sinal fraco: assim, a sala do microscópio deve ser completamente escura. Este sistema permite-nos medir as expressões dinâmicas dos genes Hes1 e Dll1 em NPCs em ambos os níveis de transcrição e proteínas (Figura 3). Além disso, podemos visualizar a dinâmica proteica da translocação intracelular com repórteres de proteína sofridas com luciferase. Além disso, usando o repórter luciferase de resposta rápida, podemos capturar a dinâmica de transmissão da sinalização notch e medir o atraso de tempo para a transmissão de sinal entre duas células vivas (Figura 3D-F e Filme Suplementar S1). Além disso, a combinação do repórter promotor (repórter Ub-luciferase) e repórter de proteínas (fusão luciferase) de um único gene nos permite medir o atraso de tempo entre transcrição e tradução do gene. Desta forma, a imagem múltipla de vários tipos de repórteres de luminescência e repórter de fluorescência está disponível para medir o atraso de tempo / taxa para reações bioquímicas.
O monitoramento em tempo real das expressões gênicas na resolução de células únicas revelou que há variações na dinâmica de expressão do mesmo gene. Algumas células expressam Dll1/Neurog2 de forma oscilatória, mas outras mostram padrões sustentados. Além disso, a dinâmica de expressão diferente (oscilatória versus estável) induzir diferentes saídas no estado das células. O que parece ser claro é que diferentes dinâmicas de expressão influenciam comportamentos celulares de diferentes maneiras, sugerindo que a dinâmica de expressão codifica mais informações21,22,26,28,29,30,31,32. As análises estáticas não podem capturar a dinâmica na expressão gênica, e análises em tempo real são necessárias para a compreensão de fenômenos biológicos para revelar a dinâmica de expressão em eventos celulares. A abordagem que introduzimos aqui pode monitorar a dinâmica dos osciladores ultradianos durante o desenvolvimento neural em alta resolução temporal. Usando este método, nós encontramos que muito mais genes estão expressados dinamicamente do que nós tínhamos pensado previamente, e nós podemos seguir não somente a dinâmica da expressão da proteína mas igualmente a dinâmica na localização da proteína na pilha na definição temporal elevada. Tais padrões de expressão dinâmica podem ter significados biológicos que ainda não foram elucidados.
Os repórteres da bioluminescência têm uma grande vantagem na definição temporal e na baixa toxicidade às pilhas vivas comparadas com os repórteres33da fluorescência. No entanto, em contraste com as variações de cor em repórteres fluorescentes, existem apenas algumas cores em repórteres de bioluminescência, impondo uma limitação ao número de genes que podem ser monitorados simultaneamente. No entanto, um número crescente de luciferase variável estão sendo isolados e clonados de várias criaturas34,35, e usando uma tal variedade de luciferases, seremos capazes de traçar simultaneamente múltiplas dinâmicas de expressão gênica em uma única célula em alta resolução temporal. O tamanho molecular da lúciferase firefly é maior do que os repórteres de fluorescência, o que apresenta algumas dificuldades na construção de proteínas fundidas com repórteres para monitorar a dinâmica da proteína, mas recentemente, uma luciferase nova, menor e mais brilhante foi clonada36, o que nos permitiria visualizar a dinâmica proteica mais fácil do que nunca. Um número crescente de relatórios tem mostrado recentemente diferentes tipos de dinâmica na expressão gênica e translocação de proteínas em vários eventos biológicos21,22,26,27,28,29,30,31,32. Análises de tal dinâmica na regulação espaçotemporal usando um sistema de monitoramento em tempo real seriam cada vez mais importantes para capturar os estados reais das células e revelar a regulação dos sistemas celulares.
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Disclosures
Os autores não têm interesse financeiro conflitante.
Acknowledgments
Agradecemos Yumiko Iwamoto para apoiar a produção do vídeo. Também somos gratos a Akihiro Isomura pela discussão e apoio à análise de imagem, Hitoshi Miyachi por suportetécnico para a geração de animais transgênicos, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) e Ouin Kunitaki (Andor Japan) para o suporte técnico e discussões sobre o sistema de imagem de bioluminescência. Este trabalho foi apoiado pela Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. and MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS) 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. e H.S.) e Platform for Dynamic Approaches to Living System do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
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