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Immunology and Infection

मानव मल नमूनों में कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी के परिवहन मीडिया में पता लगाने और अस्तित्व की सीमा निर्धारित करने के लिए संस्कृति के तरीके

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60457
Automatic Translation
1, 1, 1
1TECHLAB, Inc.

Summary

हालांकि Campylobacter के लिए मल संस्कृति गलत है, यह अभी भी पहचान के लिए सोने के मानक माना जाता है । मानव मल में सी जेजुनी के परिवहन मीडिया में पता लगाने और अस्तित्व की सीमा निर्धारित करने के तरीकों का वर्णन किया जाता है और बेहतर सटीकता के साथ एक नए इम्यूनोसे के साथ तुलना की जाती है।

Abstract

Campylobacterके निदान के लिए मानव मल से एक संस्कृति आधारित आंतों की बीमारी कई दिन लगते हैं, एक प्रतीक्षा है कि चिकित्सक और रोगी के धैर्य करों । एक संस्कृति नमूना हैंडलिंग के दौरान व्यवहार्यता के यादृच्छिक नुकसान, अन्य मल वनस्पतियों के अतिविकास और पारंपरिक मीडिया पर कई रोगजनक कैम्पिलोबैक्टर प्रजातियों के खराब विकास से झूठे नकारात्मक परिणामों से भी ग्रस्त है। इन समस्याओं रोगी उपचार पर नैदानिक निर्णयचकित कर सकते है और Campylobacter विकास और संक्रमण पर बुनियादी सवालों का जवाब देने से क्षेत्र सीमित है । हम एक ऐसी प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो जीवाणु संख्याओं की निचली सीमा का अनुमान लगाती है जिसे संस्कृति द्वारा पता लगाया जा सकता है और इस नाजुक जीव के परिवहन के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया में सी जेजुनी के अस्तित्व की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि है। इस जानकारी को जानते हुए, नैदानिक परीक्षणों के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक पता लगाने की सीमा निर्धारित करना और गैर-रोगसूचक उपनिवेशीकरण प्रचलित है, यदि अन्य आंत्र रोगजनकों के साथ सह-संक्रमण आम है, या यदि बैक्टीरियल लोड लक्षणों या गंभीर अगली कड़ी से संबंधित है, तो इसका अध्ययन नहीं करना संभव हो जाता है। अध्ययन में १,५५२ संभावित रूप से एकत्र किए गए रोगी दस्त मल नमूनों का परीक्षण भी शामिल है जिन्हें शुरू में पारंपरिक संस्कृति द्वारा वर्गीकृत किया गया था और आगे एक नए एंजाइम इम्यूनोसे द्वारा परीक्षण किया गया था । सकारात्मक और विवेकी नमूनों को फिर सच्चे-सकारात्मक या सच्चे-नकारात्मक स्थिति को आवंटित करने के लिए चार आणविक तरीकों से जांच की गई । 5 गैर संस्कृति तरीकों सभी ४८ सकारात्मक और विचारशील नमूनों पर पूरा समझौता दिखाया, जबकि संस्कृति गलत पहचान 14 (28%) संस्कृति द्वारा गलत तरीके से पहचाने गए नमूनों में 13 झूठे नकारात्मक और 1 झूठे सकारात्मक नमूना शामिल थे । इस बुनियादी प्रोटोकॉल का उपयोग कई कैम्पिलोबैक्टर spp के साथ किया जा सकता है और कैम्पिलोबैक्टर बैक्टीरिया की संख्या की अनुमति देगा जो मनुष्यों में आंत्रशोथ के लक्षणों का उत्पादन करते हैं और व्यापकता दरों को अपडेट करने के लिए।

Introduction

संयुक्त राज्य अमेरिका रोग नियंत्रण केंद्र (सीडीसी) ने हाल ही में प्रकाशित किया है कि खाद्य जनित रोग सक्रिय निगरानी नेटवर्क (FoodNet) निगरानी कार्यक्रम २०१८१में प्रयोगशाला का निदान Campylobacter संक्रमण के ९,७२३ मामलों की सूचना दी । यह 2015−20171में कैम्पिलोबैक्टर मामले की रिपोर्ट में 12% की वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है। दुनिया भर में, Campylobacter spp. सबसे आम जीवाणु आंतों संक्रमण2में से एक हैं । फिर भी, हर साल होने वाली कैम्पिलोबैक्टरआधारित आंतों की बीमारियों की संख्या3को कम रिपोर्ट किए जाने की आशंका है । यह कम अनुमान अनुमान के रूप में उम्मीद के मुताबिक है क्योंकि ज्यादातर रोगियों को केवल मध्यम असुविधा और कोई चिकित्सा उपचार के साथ ठीक कर सकते हैं । हालांकि, अधिक गंभीर लक्षणों वाले रोगियों के लिए या जो गंभीर बीमारी के लिए उच्च जोखिम में हैं, और जो तब चिकित्सा देखभाल की तलाश करते हैं, मल संस्कृति यह आकलन करने के लिए सबसे आम तरीका है कि क्या कैम्पिलोबैक्टर रोगजनक है जो उनके संकट का कारण बन रहा है4।

Campylobacter spp.के लिए, मल संस्कृति विशेष रूप से परेशानी है । सबसे आम रोगजनक जीव, सी जेजुनी, सी कोलाई, सी अप्सलेन्सिस, और सी लारी, माइक्रोएयरोफिलिक5हैं। इसका मतलब यह है कि बैक्टीरिया यादृच्छिक, अज्ञात दरों पर एक बार हवा के संपर्क में मर जाएगा । नमूना संग्रह और संस्कृति सेटअप के बीच का समय इस प्रकार संस्कृति द्वारा व्यवहार्य कैम्पिलोबैक्टर spp का पता लगाने की क्षमता में एक अनियंत्रित चर बन जाता है ।

मल के नमूनों की प्रत्यक्ष संस्कृति के लिए, कैम्पिलोबैक्टर की धीमी वृद्धि भी एक समस्या है। कैम्पिलोबैक्टर उपनिवेश 48 एच के ऊष्मायन के बाद भी बहुत छोटे हैं और मल मैट्रिक्स में प्रतिस्पर्धी जीवों द्वारा आसानी से कवर किया जा सकता है। प्लेटें जिनमें एंटीबायोटिक्स होते हैं, जिनमें सी जेजुनी और सी कोलाई के अधिकांश उपभेदों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, क्योंकि एंटीबायोटिक्स कई (लेकिन सभी नहीं) के विकास को रोकते हैं, जो मल बैक्टीरिया प्रतिस्पर्धा करते हैं, जिससे कैम्पिलोबैक्टर कॉलोनियों के बेहतर दृश्य की अनुमति होती है6। हालांकि, सी लारी और सी अपसेलियांसिस जैसी अन्य कैम्पिलोबैक्टर प्रजातियां इनमें से कुछ एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशील हैं, और या तो खराब हो जाती हैं या बिल्कुल नहीं। यह इन एंटीबायोटिक-संवेदनशील प्रजातियों7से कैम्पिलोबैक्टर संक्रमणों की कम रिपोर्टिंग में योगदान देता है ।

एक तीसरा कारण है कि कैम्पिलोबैक्टर के लिए एक संस्कृति गलत हो सकती है। बैक्टीरिया, जब जोर दिया, व्यवहार्य रह सकते हैं, लेकिन बन सकता है "गैर culturable"8। परिभाषा के अनुसार इसका मतलब है कि संस्कृति नमूने में मौजूद बैक्टीरिया का पता नहीं लगाएगी। कितनी बार होता है8ज्ञात नहीं है ।

संस्कृति के साथ इन संभावित मुद्दों को देखते हुए, हम कई तुलना संदर्भ तरीकों का इस्तेमाल किया ताकि दोषपूर्ण संस्कृति परिणाम एक भी तुलना परख गलत9दिखाई नहीं दिया । उपयोग की जाने वाली संस्कृति विधियों (उदाहरण के लिए, कैम्पिलोबैक्टर-चयनात्मकप्लेटें, परिवहन माध्यम, गैस पैदा करने वाले पाउच) को चुना गया क्योंकि उनका उपयोग स्टूल नमूना संस्कृति10के लिए नैदानिक प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से किया जाता है।

यहां वर्णित संस्कृति प्रोटोकॉल विकसित किए गए थे क्योंकि कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी की सबसे कम संख्या है कि मानव मल में संस्कृति द्वारा पता लगाया जा सकता है पता नहीं था । हालांकि पोल्ट्री मल11में मौजूद कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की संख्या के लिए अनुमान प्रकाशित किए गए हैं, लेकिन इन परिणामों को मानव मल के बराबर नहीं किया जा सकता है, क्योंकि कैम्पिलोबैक्टर spp मुर्गियों में कॉममेंसल्स हैं, और दस्त का कारण नहीं बनते हैं। इस मौलिक जानकारी के लिए Campylobacter बैक्टीरिया की संख्या है कि मनुष्यों में आंत्रशोथ के लक्षण पैदा करेगा और उपभेदों या प्रजातियों के बीच उग्रता की तुलना स्थापित करने की जरूरत है ।

Protocol

1. काल्पनिक मानव मल नमूनों में कैम्पिलोबैक्टर की गणना

नोट: सभी कदम एक कीटाणुरहित लैमिनार प्रवाह सुरक्षा हुड के भीतर एक डिस्पोजेबल सुरक्षात्मक शीट पर बाँझ तकनीक और सामग्री का उपयोग कर के बाहर किया जाता है ।

सावधानी: लाइव कैम्पिलोबैक्टर संक्रामक हैं और दस्त सहित बीमारी का कारण बन सकते हैं। जब भी बैक्टीरिया को संभालें दस्ताने, लैब कोट और सुरक्षा चश्मा पहनें। मुंह में पिपेट न करें। उचित जैव जोखिम वाले कंटेनरों में बैक्टीरिया से संपर्क करने वाली सभी सामग्री का निपटान करें।

  1. बैक्टीरिया की स्टॉक संस्कृति का विकास
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सूखे या जमे हुए संस्कृतियों और रिहाहाइड्रेट या गल बैक्टीरिया के रूप में सी जेजुनी (एटीसीसी-33560) या सी कोलाई (एटीसीसी 33559)(सामग्री की तालिका)के उपभेदों को प्राप्त करें। संस्कृति शुरू करने के लिए कैम्पिलोबैक्टर-विशिष्टआगर प्लेट पर रिहाइड्रेटेड बैक्टीरिया को लकीर दें। एक एनारोबिक वातावरण गैस पैदा करने वाले सैशे वाले एनारोबिक जार में प्लेट 48 एच को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. अगले दिन, मस्तिष्क-हृदय जलसेक (बीएचआई) विकास शोरबा के 100 मीटर तैयार करें जिसमें 0.5% ट्राइपितकेस, 0.5% प्रोटीज़ पेप्टोन, 0.0125% सोडियम पायरुवेट, और 0.0125% सोडियम बाइसुल्फेट शामिल हैं।
    3. भी शोरबा को फ्लास्क को ढीला ढककर और इसे एक सैशे के साथ एनारोबिक जार में रखकर पहले से कम करें जो माइक्रोएयरोफिलिक वातावरण का उत्पादन करेगा। शोरबा को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रीकम करने की अनुमति दें। इसी प्रकार, 1.1.10 और 1.2.2 चरणों में कॉलोनी की गिनती के लिए प्रीकम कैम्पिलोबैक्टर-विशिष्टप्लेटों का उपयोग किया जाएगा।
    4. चूंकि कैम्पिलोबैक्टर हवा के प्रति संवेदनशील होते हैं, शोरबा को इकट्ठा करने से पहले सभी सामग्रियों को इकट्ठा करते हैं और संस्कृतियों को संभालते समय नहीं करते हैं। टीका लगाने के लिए तैयार होने पर, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को कुल मात्रा के 4% तक पूर्वापित शोरबा में जोड़ें। 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व के माप में खाली के रूप में सेवा करने के लिए प्रीकम शोरबा के 1 एमएल को बनाए रखें।
    5. एफबीएस युक्त प्रीकम शोरबा के 3 mL निकालें और कैम्पिलोबैक्टर संस्कृति युक्त स्टार्टर प्लेट को कुरेदने के लिए शोरबा का उपयोग करें। धीरे-धीरे प्लेट को एक इनोकुल्टिंग लूप के साथ कुरेदलें, और फिर बैक्टीरियल स्लरी को बाँझ ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    6. बैक्टीरियल घोल के लगभग 3 मिलील के साथ पूर्वकम शोरबा के 100 मिलीएल को इनोक्यूलेट करें और गैस पैदा करने वाले सैशे वाले एनारोबिक जार में 37 डिग्री सेल्सियस पर 115 आरपीएम पर मध्यम मिलाते हुए मध्यम मिलाते हुए।
    7. ओडी600पर टर्बिडिटी द्वारा बैक्टीरिया स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिकल रूप से बैक्टीरिया के विकास की निगरानी करें। आरक्षित शोरबा को खाली के रूप में इस्तेमाल करें। यदि एनारोबिक जार खोला जाता है, तो गैस पैदा करने वाले सैशे को बदलें।
    8. 48−72 घंटे के बाद या ओडी600 मूल्य ~ 0.4 तक पहुंचने से पहले शोरबा ऊष्मायन बंद करो।
      नोट: यह OD६०० आम तौर पर १०७ से १०८ CFU/mL के बराबर है । विशिष्ट परिणामों के लिए तालिका 1 देखें।
    9. शुद्ध स्टॉक संस्कृति में बैक्टीरिया की संख्या स्थापित करने के लिए, कमजोर पड़ने बफर(सामग्री की तालिका)के 900 माइक्रोन में शोरबा के 100 माइक्रोन की आठ 10 गुना कमजोर पड़ने की श्रृंखला करें। शोरबा के 100 माइक्रोन के बाद पहले कमजोर पड़ने के लिए हटा दिया गया है, ताजा गैस पैदा करने वाले सैशे के साथ एनारोबिक जार में फ्लास्क वापसी के लिए मल पूल स्पाइकिंग में उपयोग का इंतजार है।
    10. स्टेप 1.1.3 से डुप्लिकेट प्रीकम कैम्पिलोबैक्टर- विशिष्ट प्लेटों पर 10-5 से 10-7 कमजोरियों के 100 माइक्रोन फैलाने के लिए बाँझ चढ़ाना मोतियों का उपयोग करें। उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने वाली लेबल प्लेटें, उन्हें गैस पैदा करने वाले सैशे के साथ एक दूसरे एनारोबिक जार में रखें, और 48−72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: कमजोर पड़ने की योजना और कॉलोनियों की तस्वीरों के लिए चित्रा 1 और चित्रा 2 देखें।
    11. विकास के बाद, गिनती करने के लिए 30−300 उपनिवेशों के बीच प्लेट चुनें। समीकरण 1 का उपयोग कर शेयर शोरबा संस्कृति के CFU/mL निर्धारित करने के लिए मायने रखता है का उपयोग करें:

      स्टॉक में CFU/mL = चुना (डुप्लिकेट) विश्लेषणात्मक प्लेटों पर कालोनियों के औसत # ─ (प्लेट के एमसीएल चढ़ाया एक्स कमजोर पड़ने) [समीकरण 1]
  2. काल्पनिक नैदानिक मल नमूनों की तैयारी और गणना
    1. विश्लेषणात्मक गिनती के लिए प्लेटों के तुरंत बाद चरण 1.1.10 में तैयार कर रहे हैं, स्टॉक शोरबा और एक Campylobacter-नकारात्मकमल पूल (एनएफपी) से 10 धारावाहिक 2 गुना कमजोर पड़ने की तैयारी करके शेयर शोरबा कमजोरपड़ का एक दूसरा सेट बनाते हैं। उदाहरण के लिए, शोरबा और एनएफपी (जैसे, 0.1 मिलील प्रत्येक) के समान मात्रा को मिलाकर पहले कमजोर पड़ने की तैयारी करें और एक समान नामित मात्रा एनएफपी के साथ शोरबा और एनएफपी मिश्रण की एक निर्धारित मात्रा को एक ट्यूब में स्थानांतरित करके बाद के कमजोर पड़ने का काम करें। शोरबा के साथ एक नियंत्रण प्लेट जोड़ें जिसमेंगैर-कैम्पिलोबैक्टर उपनिवेशों की पहचान करने में मदद करने के लिए मल पूल में कोई कैम्पिलोबैक्टर जोड़ा गया नहीं है।
      1. डी-पहचान, दस्त रोगी निगरानी नमूनों या स्वस्थ दाता मल से एनएफपी बनाएं जिनका पहले परीक्षण किया गया है और कैम्पिलोबैक्टर-नकारात्मकपाया गया है जैसे कि कैम्पिलोबैक्टर एंजाइम इम्यूनोसे और 16S आरआरएनए क्यूपीसीआर द्वारा।
    2. डुप्लिकेट प्रीकम कैम्पिलोबैक्टर-विशिष्टआगर प्लेटों पर प्रत्येक कैम्पिलोबैक्टर/स्टूलकमजोर पड़ने का टी-स्ट्रीक 10 माइक्रोन। एनारोबिक जार में गैस पैदा करने वाले सैशे के साथ प्लेटें रखें और 48 ± 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. शुद्ध कैम्पिलोबैक्टर संस्कृतियों से समान कॉलोनियों के लिए नेत्रहीन लकीर प्लेटों की जांच करें।
      नोट: तीसरा चक्र आम तौर पर है जहां ये पाया जाएगा । कमजोर पड़ने की योजना और कॉलोनी आकार, रंग और आकृति विज्ञान की छवियों के लिए चित्र 1 और चित्र 2 देखें।
    4. कई कैम्पिलोबैक्टर-जैसेकॉलोनियों और चने के दाग का चयन करें। तेल विसर्जन लेंस के साथ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, ग्राम-नकारात्मक घुमावदार, सर्पिल, या सिगार के आकार के छोटे बैक्टीरिया के लिए एक बारीकी से लकीर वाले क्षेत्र की जांच करें।
      नोट: Campylobacter ग्राम नकारात्मक हैं और एक प्रतिदाग के रूप में बुनियादी fuchsin की आवश्यकता होती है (ठेठ safranin के बजाय) सही कल्पना की जानी है । क्लासिक गल पंखों वाले बैक्टीरिया देखा जा सकता है लेकिन एक आवश्यकता नहीं हैं । प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ के लिए चित्रा 2 देखें।
    5. यदि किसी विशिष्ट कमजोर पड़ने पर डुप्लिकेट प्लेटों में से कोई भी 1 या उससे अधिक कैम्पिलोबैक्टर उपनिवेश मौजूद है, तो उस कमजोर पड़ने वाली मल-संस्कृति को सकारात्मक मानते हैं।
    6. पिछले कमजोर पड़ने पर विचार करें जिसमें एक दृश्यमान कैम्पिलोबैक्टर-जैसेग्राम-नकारात्मक कॉलोनी संस्कृति का पता लगाने की सीमा शामिल है। काल्पनिक नैदानिक मल नमूना में सकारात्मक कमजोर पड़ने के CFU/mL की गणना करने के लिए समीकरण 2 का उपयोग करें:

      Fecal नमूना में CFU/mL = विश्लेषणात्मक CFU/mL ─ पिछले सकारात्मक कॉलोनी के साथ कमजोर पड़ने [समीकरण 2]

      नोट: विशिष्ट परिणामों के लिए तालिका 2 देखें।

2. परिवहन मीडिया में संग्रहीत कैम्पिलोबैक्टर का व्यवहार्यता निर्धारण

  1. कैम्पिलोबैक्टर शोरबा संस्कृति (चरण 1.1.8) का मिक्स 1 एल एनएफपी के 1 एमएल के साथ और एनएफपी में 10 डुप्लिकेट दो गुना धारावाहिक कमजोरियां तैयार करें। इसके अलावा एक कमजोर पड़ने के प्रत्येक कमजोर पड़ने Cary-ब्लेयर मीडिया में एक अतिरिक्त 1:4 पतला, बस के रूप में एक नैदानिक परिवहन मीडिया में तैयार नमूना इलाज किया जाता है ।
  2. 20 कमजोर पड़ने वाली ट्यूबों और 96 एच के लिए 2−8 डिग्री सेल्सियस पर छाया हुआ ट्यूबों में कैरी-ब्लेयर माध्यम में नकारात्मक नियंत्रण स्टोर करें और शून्य और हर 24 घंटे में होने वाले प्रत्येक कमजोर पड़ने से कालोनियों की गणना करें। कॉलोनी गिनती के लिए, डुप्लिकेट में प्रत्येक कमजोर पड़ने की कॉलोनी गिनती के लिए शोरबा: मल ट्यूब और सेटअप मल संस्कृति का नमूना करें।
  3. प्रत्येक दिन प्लेट कैम्पिलोबैक्टर-चयनात्मकआगर पर मल कमजोर होने के 10 माइक्रोन भागों और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, जैसा कि चरण 1.1.9−1.2.7 में वर्णित है।
  4. ऊपर वर्णित मूल बैक्टीरियल स्टॉक (चरण 1.1.8 या एक हौसले से उगाए गए शोरबा स्टॉक से) की एक साथ विश्लेषणात्मक प्लेट गिनती करें( चरण 1.1.9−1.1.1.1.1)। परिवहन मीडिया मल नमूना और उसके कमजोर होने(समीकरण 2)में बैक्टीरिया की एकाग्रता की गणना करने के लिए मूल जीवाणु स्टॉक(समीकरण 1)के सीएफयू/एमएल की गणना करें ।

3. संस्कृति परिणामों की पुष्टि के लिए गैर संस्कृति परख

  1. एक एंजाइम इम्यूनोसे (ईआईए) का उपयोग करें जो न्यूनतम झूठे सकारात्मक परिणाम देता है12 और संस्कृति परिणामों को सत्यापित करने के लिए पैकेज डालने के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन करता है।
  2. एक आणविक परख का प्रयोग करें जो 16S rRNA जीन या कैम्पिलोबैक्टर प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के अन्य जीन का पता लगा सकता है13। पुष्टि करें कि आणविक परख सी अपसेलियांसिस या सी लारी जैसी प्रजातियों के साथ प्रतिक्रिया करता है जो मानक एंटीबायोटिक युक्त आगर14पर खराब हो जाते हैं। मल के नमूनों से डीएनए निकालने और परीक्षण करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    नोट: 16S एम्प्लिकेट के द्विदिशात्मक डीएनए अनुक्रमण का उपयोग सकारात्मक नमूने में कैम्पिलोबैक्टर की प्रजातियों की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। प्रजातियों के विशिष्ट पीसीआर (लक्ष्य जीन के लिए तालिका 3 देखें) का उपयोग15को असतत या सकारात्मक नमूनों में मौजूद प्रजातियों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।

Representative Results

प्रतिस्पर्धी मल वनस्पतियों के बीच Campylobacter spp. कालोनियों की पहचान गहरी दृष्टि और काफी निर्णय की आवश्यकता है । संस्कृति द्वारा पता लगाया जा सकता है कि कालोनियों की सबसे कम संख्या का अध्ययन नहीं किया गया है, हालांकि रोगियों से नमूनों १०६−109 CFU/mL16,17बंदरगाह का अनुमान लगाया गया है । हालांकि, रोगी के नमूनों का उपयोग मात्रात्मक रूप से नहीं किया जा सकता है क्योंकि सटीक बैक्टीरियल नंबर स्थापित करने के लिए कोई स्वतंत्र तरीका नहीं है। इस सीमा को दूर करने के लिए, एक जीवाणु स्टॉक के साथ दो एक साथ माप बनाए जाते हैं। एक परीक्षण का उपयोग एक मल मैट्रिक्स में स्टॉक बैक्टीरिया के धारावाहिक कमजोर होने से कैम्पिलोबैक्टर उपनिवेशों के दृश्य का पता लगाने के लिए किया जाता है, नैदानिक नमूनों का अनुकरण करता है; दूसरे का उपयोग स्पाइकिंग(चित्रा 2ए)के लिए उपयोग की जाने वाली बैक्टीरियल स्टॉक संस्कृति में मौजूद सीएफयू/एमएल की मात्रा निर्धारित करने के लिए विश्लेषणात्मक रूप से किया जाता है ।

कैम्पिलोबैक्टर के लिए पता लगाने की सीमाओं को परिभाषित मूल्य नहीं किया जाएगा । यह उम्मीद की जानी चाहिए क्योंकि प्रत्येक मल मैट्रिक्स जटिल और अद्वितीय है, और बैक्टीरिया का विकास परिवर्तनीय है। सफलता के लिए एक प्रमुख पैरामीटर प्रतिस्पर्धी मल वनस्पतियों के बीच तुच्छ आकार कालोनियों की पहचान कर रहा है । नुकीला मल संस्कृति की एक प्रतिनिधि थाली चित्रा 2सी और चित्रा 2डीमें दिखाया गया है । अन्य मल वनस्पतियों की पहचान करने में मदद करने के लिए जोड़ा कैम्पिलोबैक्टर के बिना नकारात्मक नियंत्रण प्लेट महत्वपूर्ण है। चना धुंधला कई उम्मीदवार ों को भी आंख गाड़ियों सही चमकदार कालोनियों और fuchsin-दाग ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के मध्यवर्ती गुलाबी रंग भेद और चयनित कालोनियों में बैक्टीरिया की आकृति विज्ञान की पुष्टि करता है(चित्रा 2बी)। 5 सी जेजुनी और 2 सी कोलाई शोरबा का उपयोग करते हुए सात स्वतंत्र प्रयोग किए गए, और 0.3−5 x 106 CFU/mL से छा गए और फैले थ्रेसहोल्ड दिए गए। विशिष्ट डेटा के लिए तालिका 2 देखें। पता लगाने की सीमा सी जेजुनी के लिए औसतन 2 x 106 और सी कोलाईके लिए 1.2 x 106 सीएफयू/एमएल थी। यह इंगित करता है कि संस्कृति की संभावना मानक एंटीबायोटिक युक्त Campylobacter-विशिष्टआगर कई नैदानिक प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल पर मल नमूना के प्रति ग्राम ~ 1−2 x 106सी jejuni या सी कोलाई का पता लगा सकते हैं । विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं के साथ कई विशेष एगर हैं जो कॉलोनी का पता लगाने के लिए अलग-अलग थ्रेसहोल्ड दे सकते हैं। यहां वर्णित तरीकों को संस्कृति की सटीकता में सुधार करने और नए मीडिया की बहुमुखी प्रतिभा को व्यापक बनाने के लिए अधिक मात्रात्मक और तुलनात्मक अध्ययनों को प्रोत्साहित करना चाहिए । उदाहरण के लिए, 152 कॉलोनियों को पहले 10-5 प्लेट और दूसरी 10-5 प्लेट पर 144 कॉलोनियों पर गिना गया था। दो प्लेटों के बीच औसत 148 कॉलोनियां हैं। प्लेटों को10-5 कमजोर पड़ने के 0.1 mL (100 माइक्रोन) के साथ टीका लगाया गया था, जो समीकरण 1 द्वारा शुद्ध संस्कृति स्टॉक में 148 x 106 (14.8 x 107)CFU/mL के बराबर है। जब मल कमजोर किया गया, संस्कृति एक 1:1 अनुपात में नकारात्मक मल पूल में नुकीला था । इसलिए, समीकरण 2द्वारा, मल वक्र पर पहला बिंदु (प्लेट "ए") 2 से विभाजित 14.8 x 107 से मेल खाती है और 7.4 x 107 सीएफयू/mL के बराबर होती है। इस "एक" ट्यूब का उपयोग 9 अतिरिक्त कमजोर बनाने के लिए किया जाता है। चित्रा 1में, कैम्पिलोबैक्टर-जैसेआकृति विज्ञान के साथ एक दृश्यमान ग्राम-नकारात्मक उपनिवेश के साथ अंतिम कमजोर पड़ना प्लेट "जी" पर है। यह इस उदाहरण में पता लगाने की मल संस्कृति दहलीज के लिए १.१ x १०६ CFU/mL के बराबर है ।

हालांकि निरंतर व्यवहार्यता संस्कृति की सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है, Campylobacter spp की व्यवहार्यता की अवधारण हैंडलिंग और रोगियों से संदर्भ प्रयोगशालाओं के लिए क्लीनिक के लिए नमूनों की शिपमेंट के दौरान समस्याग्रस्त है । विशिष्ट भंडारण हवा के संपर्क के साथ साधारण छाया हुआ ट्यूबों में नमूनों को ठंडा करने के लिए और कोई विशेष वातावरण के साथ है। परिवहन मीडिया में नमूनों (भी संरक्षित नमूनों के रूप में जाना जाता है) बेहतर अस्तित्व के लिए सोचा जाता है, लेकिन वहां कुछ रिपोर्ट है कि मात्रात्मक डेटा18प्रदान कर रहे हैं ।

ऊपर दिखाए गए विश्लेषणात्मक और काल्पनिक नमूना विधियों के संयोजन का उपयोग परिवहन मीडिया में सी जेजुनी की व्यवहार्यता और अस्तित्व के समय अनुमान प्राप्त करने के लिए फिर से किया गया था। मल मैट्रिक्स में दस डुप्लिकेट 2-गुना से 1024 गुना नमूना कमजोरकरने के लिए एक बैक्टीरियल स्टॉक शोरबा का उपयोग किया गया था। प्रारंभिक शोरबा विश्लेषणात्मक गिनती द्वारा पाया गया था ४.८ x १०७ CFU/mL की एकाग्रता है । 0 दिन पर बनाई गई प्लेटों पर, सी जेजुनी का पता चला (2 दिन बाद) प्लेट पर ३२ गुना कमजोर पड़ने के साथ लकीर, १.५ x १०६ CFU/mL के बराबर । हालांकि, 24 घंटे के लिए Cary ब्लेयर मल नमूना ठंडा करने के बाद बनाई गई प्लेटों पर, केवल 2 गुना कमजोर पड़ने (२.४ x १०७ CFU/mL के बराबर) दिखाई कालोनियों बढ़ी । ९६ घंटे के लिए व्यवहार्यता का कोई और नुकसान नहीं देखा गया था, जब अध्ययन बंद कर दिया गया था । व्यवहार्यता का यह नुकसान 16 गुना (94%) 24 घंटे से भी कम समय में सक्सेसल जीवों की हानि और इंगित करता है कि, यहां तक कि प्रशीतन के साथ, कैरी ब्लेयर माध्यम में मल १०७ CFU/mL सी jejuni से कम संस्कृति द्वारा याद किया जा सकता है।

संस्कृति के परिणामों के विपरीत, ईआईए ने प्रारंभिक समय बिंदु पर और 4 दिन की परीक्षण अवधि के दौरान 256 गुना कमजोर पड़ने पर सी जेजुनी की उपस्थिति का पता लगाया। नुकीला मल नमूनों का उपयोग कर इस ईआईए के लिए सी जेजुनी डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड 8.4 x 104 CFU/mL है। यह सीमा मल संस्कृति से नीचे है और सी जेजुनीका अधिक संवेदनशील और स्थिर पता लगाने की अनुमति देती है।

एक वास्तविक नैदानिक सेटिंग में कैम्पिलोबैक्टर स्पीपी का पता लगाने के लिए संस्कृति की क्षमता का परीक्षण करने के लिए, 1,552 नैदानिक मल नमूनों को 6 प्रक्रियाओं द्वारा चिह्नित किया गया: मल संस्कृति, कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी के लिए एक नया इम्यूनोसे, और 4 आणविक विधियां। सभी नमूनों को संभावित रूप से एकत्र किया गया और शुरू में संयुक्त राज्य अमेरिका में 3 प्रयोगशालाओं में पारंपरिक संस्कृति द्वारा वर्गीकृत किया गया, और फिर ईआईए द्वारा क्रॉस-चेक किया गया। किसी भी संस्कृति सकारात्मक या ईआईए/संस्कृति-असतत नमूनों की जांच तब आणविक पद्धतियोंद्वारा कीगई थी । नमूनों को 5 गैर-संस्कृति विधियों के परिणामों के आधार पर एक सच्ची सकारात्मक या सच्ची-नकारात्मक स्थिति सौंपी गई थी। 5 गैर संस्कृति तरीकों सभी ४८ सकारात्मक और विचारशील नमूनों पर पूरा समझौता दिखाया, जबकि संस्कृति गलत पहचान 14 (28%) संस्कृति द्वारा गलत तरीके से पहचाने गए नमूनों में 13 झूठे नकारात्मक और 1 झूठे सकारात्मक नमूना शामिल थे ।

Figure 1
चित्रा 1: विश्लेषणात्मक और नुकीला मल के नमूनों की एक साथ तैयारी के लिए योजना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: शुद्ध और मल संस्कृतियों से सी जेजुनी कालोनियों की पहचान। }72 घंटे के इन्विटेशन के बाद शुद्ध बैक्टीरियल कल्चर से सी जेजुनी कॉलोनियों की तस्वीर। }शुद्ध जीवाणु संस्कृति, तेल विसर्जन 400x आवर्धन से सी जेजुनी का चने का दाग । (ग)48 घंटे ऊष्मायन के बाद सी जेजुनी-पॉजिटिव नुकीला मल संस्कृति की तस्वीर। (D)बॉक्स इन(सी),10x आवर्धन में बढ़े हुए क्षेत्र। सफेद तीर पिन-पॉइंट साइज ग्राम-निगेटिव सी जेजुनी कॉलोनियों का संकेत देते हैं। काला तीर सिर एक कॉलोनी को इंगित करता है जो थोड़ा बड़ा, ग्राम-सकारात्मक, और सी जेजुनीनहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

संस्कृतियों ओडी600 @ T0 ओडी600 @ टी फाइनल1 अंतिम सीएफयू/एमसीएल
सी जेजुनी 0.146 0.321 1.28 x 107
C. कोलाई 0.245 0.508 4.50 x 108

तालिका 1: सी जेजुनी और सी कोलाई स्टॉक्स के विशिष्ट विकास और सीएफयू/एमएल । 1सी जेजुनी संस्कृति को 48 घंटे के ऊष्मायन के बाद रोक दिया गया था। सी कोलाई कल्चर को 54 एच के इन्क्यूबेशन के बाद रोक दिया गया था।

नुकीला मल नमूना के लिए कमजोर पड़ने ट्यूब कैम्पिलोबैक्टरकी तरह कॉलोनियों की संख्या ग्राम-नकारात्मक कॉलोनियों की संख्या1 संस्कृति सकारात्मक? नुकीला नमूना की गणना CFU/mL
C. jejuni (१.२८ x १०८ CFU/mL स्टॉक) (2 गुना) एक घना एनडी2 हाँ 6.40 x 107
(4 गुना) बी 20+ एन डी हाँ 3.20 x 107
(8 गुना) सी 4-10 एन डी हाँ 1.60 x 107
(16 गुना) डी एन डी हाँ 8.00 x 106
(32 गुना) ई एन डी हाँ 4.00 x 106
(64 गुना) एफ 1-3 2 में से 1 हाँ 2.00 x 106
(128 गुना) जी 3 में से 2 हाँ 1.00 x 106
3(256 गुना) एच 2 में से 1 हाँ 5.00 x 105
(512 गुना) मैं 1 के 0 नहीं 2.50 x 105
(1024 गुना) जम्मू 0 एन डी नहीं Nfp
सी कोलाई (4.50 x 108 CFU/mL स्टॉक) (2 गुना) एक घना एन डी हाँ 2.25 x 108
(4 गुना) बी एन डी हाँ 1.13 x 108
(8 गुना) सी 50+ एन डी हाँ 5.63 x 107
(16 गुना) डी 30+ एन डी हाँ 2.81 x 107
(32 गुना) ई 10+ एन डी हाँ 1.41 x 107
(64 गुना) एफ 3-8 एन डी हाँ 7.03 x 106
(128 गुना) जी एन डी हाँ 3.52 x 106
3(256 गुना) एच 1-3 3 में से 1 हाँ 1.76 x 106
(512 गुना) मैं 1 के 0 नहीं 8.79 x 105
(1024 गुना) जम्मू 0 एन डी नहीं Nfp

तालिका 2: नुकीला मल नमूनों की प्लेटों पर कालोनियों की विशिष्ट संख्या । 1 कैम्पिलोबैक्टरके बीच 1 ग्राम नकारात्मक उपनिवेश - जैसे उपनिवेश, 2= निर्धारित नहीं, बोल्ड प्रकार के 3डेटा पिछले सकारात्मक कमजोर पड़ने का संकेत देते हैं।

प्रजातियां जीन लक्ष्य
सी जेजुनी हिपो
C. कोलाई सीएडीएफ
C. अपसेलियालिस सीपीएन60
कै लारी सीपीएन60
सी हेलवेटिकस सीपीएन60
C. भ्रूण सीपीएन60
C. hyointestinalis सीपीएन60
C. संक्षिप्त सीपीएन60

तालिका 3: व्यक्तिगत कैम्पिलोबैक्टर प्रजातियों क्यूपीसीआर का पता लगाने के लिए उपयोगी जीन।

Discussion

यहां वर्णित संस्कृति विधियों सरल, व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों और अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपलब्ध सामग्रियोंपर 10बनाई गई हैं। यह विश्लेषणात्मक और काल्पनिक नमूनों का संयोजन है जो मल संस्कृतियों के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक पता लगाने की सीमा की नई जानकारी प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, 5 अलग-अलग परखों के साथ संस्कृति परिणामों का न्यायनिर्णयन इस निष्कर्ष को मजबूत करता है कि कैम्पिलोबैक्टर मल संस्कृति रोगी नमूनों के एक महत्वपूर्ण हिस्से को गलत पहचानती है। ईआईए और आणविक परख नियंत्रण के रूप में उपयोगी होते हैं क्योंकि वे प्रत्येक एक अलग सिद्धांत (एंटीबॉडी बनाम डीएनए प्रवर्धन के साथ एंटीजन इंटरैक्शन) पर आधारित होते हैं और महत्वपूर्ण बात यह है कि बैक्टीरिया की व्यवहार्यता पर भरोसा नहीं करते हैं। ध्यान दें कि इन अध्ययनों के लिए उपयोग की जाने वाली ईआईए परख अच्छी तरह से मान्य है और इसे 4 आणविकपरीक्षणों 12के साथ पूरी तरह से सहमत दिखाया गया है।

Campylobacter spp की संस्कृति विशेष रूप से परेशानी है, संवेदनशीलता के साथ 60−76%19,20से सीमा की सूचना दी, और के रूप में यहां सच सकारात्मक नमूनों का पता लगाने में विफलता की अपनी ~30% की दर से स्पष्ट है । कार्मिक उम्मीद कर सकते हैं कि नियंत्रण ईआईए और आणविक परीक्षण अक्सर सकारात्मक परिणाम देंगे जब संस्कृति डेटा नकारात्मक होते हैं।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रतिस्पर्धी मल वनस्पतियों के बीच पिन-पॉइंट कॉलोनियों की पहचान है। यह असामान्य नहीं है, क्योंकि पता लगाने की सीमा के पास कमजोर होना, शून्य और गैर-शून्य कॉलोनी गिनती अनुमान (जैसे, 2, 0, 1, 0, 0, 0) का बारी-बारी से होना। यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि संस्कृति थ्रेसहोल्ड सांद्रता की एक श्रृंखला होगी, न कि एक विशिष्ट सीएफयू/एमएल । फिर भी, संस्कृति का पता लगाने के लिए एक कम सीमा के रूप में ~ 1 x 106 CFU/mL मल का अनुमान अच्छी तरह से रिपोर्ट के साथ तुलना करता है कि संक्रमित मनुष्यों ने प्रति ग्राम मल21106 से 109कैम्पिलोबैक्टर बहाया। एंटीबायोटिक दवाओं या आगर प्लेटों में परिवर्तन और व्यक्तिगत मल नमूनों में अपरिहार्य विविधताओं निस्संदेह दहलीज मूल्यों को बदल देगा । इस प्रोटोकॉल से ग्रोथ मीडिया में सुधार संभव होना चाहिए ।

संस्कृति का पता लगाने के लिए एक सीमा पर यह पहली जानकारी नैदानिक परीक्षणों के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक थ्रेसहोल्ड सेट करना संभव बनाती है, और माइक्रोबायोलॉजिकल फाउंडेशन देती है जिसे कैम्पिलोबैक्टरद्वारा गैर-रोगसूचक गाड़ी22,23 के अअध्ययन मुद्दों का समाधान करने की आवश्यकता होती है, या यदि बैक्टीरियल लोड लक्षणों या गंभीर अगली कड़ी से संबंधित है।

Disclosures

लेखक TECHLAB, इंक के कर्मचारी हैं जो इस लेख में एक तुलनात्मक के रूप में उपयोग की जाने वाली क्विक चेक ™ किट का उत्पादन करते हैं।

Acknowledgments

इन अध्ययनों को टेकलैब, इंक द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaerobic 3.5L Jar Thermo Fisher HP0031A
AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar Hardy Diagnostics AG701
Bacto Brain Heart Infusion BD Biosciences 237500
Bacto Protease Peptone Life Technologies Corp 211684
Basic Fuchsin Fisher Scientific B12544
BBL Trypticase Peptone Life Technologies Corp 211921
C. coli Type strain ATCC 33559
C. jejuni Type strain ATCC 33560
CampyGen gas generating system sachet Thermo Fisher CN0025A
Campylobacter QUIK CHEK TechLab, Inc. T5047 / T31025
Cary-Blair transport medium Fisher Scientific 23-005-47
Coli Roller Sterile plating beads Millipore Sigma 71013
Dilution Buffer Anaerobe Systems AS-908
Fetal bovine serum Equitech-Bio, Inc SFBM30
Sodium bisulfite Sigma-Aldrich 243973
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460

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Buss, J. E., Thacker, E., Santiago, M. Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens. J. Vis. Exp. (157), e60457, doi:10.3791/60457 (2020).

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