Summary
למרות שהתרבות הצואה של קמוליבקטר אינה מדויקת, היא עדיין נחשבת לסטנדרט הזהב לזיהוי. שיטות לקביעת מגבלת האיתור וההישרדות באמצעי התחבורה של ג. jejuni בצואה אנושית מתוארים ומושווים עם שיטת החיסונית חדשה עם דיוק טוב יותר.
Abstract
תרבות מצואה אנושית לאבחון מחלות המעי המבוססות על קמפילובקטראורכת מספר ימים, המתנה הממיסים את הגבורה של הרופא והמטופל. תרבות היא גם נוטה לתוצאות שליליות שווא מאובדן אקראי של הכדאיות במהלך טיפול בדגימה, גידול יתר של צמחייה בצואה אחרים, ואת הצמיחה המסכנה של כמה מינים מסוג קמולילוקטר הפתוגניים על התקשורת המסורתית. בעיות אלה יכולים לבלבל את ההחלטות הקליניות על טיפול במטופלים והגבילה את השדה מפני המענה לשאלות הבסיסיות על הצמיחה והדלקות של קמפילובקטר . אנו מתארים הליך זה מעריך את הגבול התחתון של מספרים חיידקיים שניתן לזהות על ידי תרבות ושיטה לכמת את ההישרדות של C. jejuni במדיה המשמש להובלת האורגניזם השברירי הזה. ביודעי את המידע הזה, זה הופך להיות אפשרי להגדיר את הנתונים הרלוונטיים קלינית זיהוי עבור בדיקות אבחון וכתובת בעיות שאינן למדו אם מושבת לא סימפטומטי הוא נפוץ, אם שיתוף הזיהום עם פתוגנים בידור אחרים הוא נפוץ, או אם עומס חיידקי במקביל עם סימפטומים או מערכת סקוויה רצינית. המחקר כולל גם בדיקות של 1,552 שנאסף החולה אסף באופן מdiarrheal דגימות צואה שהיו מסווגים בתחילה על ידי התרבות המקובלת נבדק נוספת על-ידי שיטת האנזים החדש של האנזימים. דגימות חיוביות ודיסקרטיות הוקרן לאחר מכן על ידי ארבע שיטות מולקולריות כדי להקצות מעמד אמיתי-חיובי או אמיתי-שלילי. 5 שיטות שאינן תרבות הראו הסכמה מלאה על כל 48 חיוביות ודיסקרטיות דגימות, בעוד התרבות לא מזוהה 14 (28%). הדגימות שזוהו באופן שגוי על-ידי התרבות כללו 13 דגימות שליליות וחיוביות מזויפות. פרוטוקול בסיסי זה ניתן להשתמש עם מספר campylobacter spp. ויאפשר את המספרים של חיידקים campylobacter כי לייצר סימפטומים של הדלקת המוח בבני אדם כדי להיקבע ושיעורי שכיחות להתעדכן.
Introduction
ארצות הברית מרכזים לבקרת מחלות (CDC) פורסם לאחרונה כי מחלות מזון פעיל רשת מעקב (מזון) תוכנית מעקב דיווחו 9,723 מקרים של מעבדה מאובחנים זיהומים קמוליבקטר ב 20181. הדבר מייצג גידול של 12% בדוחות המקרה של קמוליבקטר מעל 2015-20171. ברחבי העולם, קמפילובקטר spp הם בין זיהומים המעי חיידקי הנפוץ ביותר2. למרות זאת, מספרם של מחלות המעי המבוססות על קמפילובקטר, המתרחשות מדי שנה, נחשדים בפני מספרשלוש. שערוך זה הוא צפוי, כי רוב המטופלים יכולים להתאושש עם אי נוחות מתונה ולא טיפול רפואי. עם זאת, עבור חולים עם תסמינים חמורים יותר או אשר נמצאים בסיכון גבוה יותר עבור מחלות חמורות, ומי לאחר מכן לחפש טיפול רפואי, הצואה תרבות היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת אם Campylobacter היא הפתוגן שגורם מצוקה שלהם4.
. תרבות הצואה בעייתית במיוחד אורגניזמים הפתוגניים הנפוצים ביותר, c. jejuni, c. coli, ג. אפסליאנסיס, ו -C. לארי, הם מיקרוארונופילית5. משמעות הדבר היא כי החיידק ימות באקראי, שיעורי לא ידוע נחשף פעם לאוויר. הזמן בין איסוף הדגימה לבין הגדרת התרבות ובכך הופך משתנה בלתי מבוקרת ביכולת לזהות מקאמולילוקטר spp קיימא. על ידי תרבות.
לתרבות ישירה של דגימות צואה, הצמיחה האיטית של קמפילובקטר היא גם בעיה. מושבות Campylobacter הם קטנים מאוד גם אחרי 48 h של דגירה והוא יכול בקלות להיות מכוסה על ידי אורגניזמים מתחרים מטריצה צואה. צלחות המכילות אנטיביוטיקה אשר רוב הזנים של c. jejuni ו -C. coli עמידים בשימוש נרחב, כמו אנטיביוטיקה לעכב את הצמיחה של רבים (אבל לא כולם) מתחרה חיידקים בצואה, המאפשר הדמיה טובה יותר של המושבות campylobacter 6. עם זאת, מינים אחרים של קמוליבקטר , כגון c. לארי ו -c. upsaliensis רגישים לחלק מהאנטיביוטיקה הללו, ולצמוח בכלל או לא. הדבר תורם לחוסר הדיווח על זיהומים קמוליבקטר מסוג זה הרגישים לאנטיביוטיקה7.
יש סיבה שלישית מדוע תרבות עבור קמפילובקטר עלולה להיות לא מדויקת. החיידק, כאשר הדגיש, עשוי להישאר בר קיימא, אבל יכול להיות "לא מסוגל"8. משמעות הדבר היא שהתרבות לא תזהה את החיידק הקיים במדגם. באיזו תדירות זה מתרחש לא ידוע8.
בהתחשב בבעיות הפוטנציאליות הללו בתרבות, השתמשנו בשיטות התייחסות מרובות להשוואה, כך שתוצאות התרבות הפגומות לא הופכים שיטת משווה בודד מופיעה כשהיא מדויקת9. שיטות התרבות המשמשות (למשל, Campylobacter-לוחות סלקטיבית, אמצעי תחבורה, מייצר גז שקיות) נבחרו משום שהם משמשים נרחב במעבדות קליניות עבור הדגימה צואה תרבות10.
פרוטוקולי התרבות שתוארו כאן פותחו מכיוון שהמספר הנמוך ביותר של קמוליבקטר jejuni שיכול להתגלות על ידי התרבות בצואה האנושית לא היה ידוע. למרות שהערכות פורסמו עבור מספר היחידות היוצרות מושבה (CFU) המצויים בצואת עופות11, אין אפשרות להשוות בין התוצאות הללו לצואה האנושית, כיוון שהקמולולוקטר spp מקבל הרבה בתרנגולות, ואינם גורמים לשלשול. המידע הבסיסי הזה צריך להקים את המספרים של חיידקים Campylobacter שיפיקו סימפטומים של דלקת במוח בבני אדם להשוות התקפה אלימה בין זנים או מינים.
Protocol
1. מספור של קמולולוקטר בתוך דגימות של צואה של אדם
הערה: כל השלבים מתבצעים באמצעות טכניקה סטרילית וחומרים על דף הגנה חד פעמי בתוך מכסה בטיחות של זרימה מחוטאת.
התראה: מקמפבקטר חיים מדבקים ועלולים לגרום למחלות, כולל שלשול. לבש כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות בכל פעם שמטפלים בחיידקים. . אל תהיה מלוכלך היפטר מכל חומר שיצר קשר עם החיידק במכולות בידוד נאות.
- צמיחה של תרבות המניה של חיידקים
- השג זנים של c. jejuni (atcc-33560) או C. coli (Atcc 33559) (טבלה של חומרים) כמו תרבויות מיובש או קפוא ומייבשים או להפשיר חיידקים על פי הוראות היצרן. הפעל את החיידקים מחדש על צלחת אגר הספציפי של מקמולילוקטרכדי להתחיל את התרבות. מודקת את הצלחת 48 h ב 37 ° צ' בצנצנת אנאירובית המכילה מיקרואירובית אווירה מייצר גז.
- ביום למחרת, להכין 100 mL של מוחי לב אינפוזיה (BHI) ציר גדילה המכיל 0.5% טריטיקרה, 0.5% פרוטאז peptone, 0.0125% נתרן פירובט, ו-0.0125% נתרן bisulfite.
- מוקלטות מחודש את ציר BHI על-ידי כיסוי הבקבוקון באופן רופף והצבת אותו בצנצנת אנאירובית עם סצ'ה שיפיק סביבה מיקרואארופילית. הניחו לציר להיות מוקלטות לילה ב-37 ° c. באופן דומה, לוחיות הרישוי המיוחדות של קמפילובקטר-מוקלטות כדי לשמש לספירות מושבה בשלבים 1.1.10 ו-1.2.2.
- כמו Campylobacter הם רגישים לאוויר, לאסוף את כל החומרים לפני הימנעות מרק לא להתבטל בזמן הטיפול בתרבויות. כאשר מוכנים לחסן, להוסיף סרום העוברי העובר (FBS) כדי ציר מראש מראש ל 4% של נפח הכולל. שמור על 1 מ ל של ציר מראש לשמש כריק במידות של צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600).
- הסירו 3 מ ל של ציר מראש המכיל FBS והשתמש בציר כדי לגרד את צלחת המתנע המכילה את התרבות הקמפילובקטר . מגרדים בעדינות את הצלחת עם הלולאה, ולאחר מכן להעביר את החיטוי חיידקי לצינור סטרילי.
- איחסן 100 mL של ציר מראש מראש עם כ 3 מ ל של מתינות חיידקי ו דגירה עם טלטול מתון ב 115 סל ד ב 37 ° c בצנצנת אנאירובית המכילה sachet הפקת גז.
- הצמיחה של החיידקים spectrophotometrically על ידי עכירות ב OD600. השתמש בציר השמור כריק. אם הצנצנת האנאירובית נפתחת, החליפו את הספשה המייצרת את הגז.
- להפסיק את הדגירה לאחר 48 עד 72 שעות או לפני OD600 ערך מגיע ~ 0.4.
הערה: זה OD600 בדרך כלל משווה ל 107 עד 108 cfu/mL. ראה טבלה 1 עבור תוצאות טיפוסיות. - כדי לקבוע את מספר החיידקים בתרבות המניה טהור, לבצע סדרת דילול 8 10-קיפול של 100 μL של ציר ב 900 μL של מאגר דילול (טבלת חומרים). לאחר 100 μL של ציר הוסר לדילול הראשון, להחזיר בקבוקון לצנצנת אנאירובית עם מחולל גז טרי, כדי לחכות להשתמש בבריכת צואה הקופצים.
- השתמש חרוזי ציפוי סטרילית כדי להפיץ 100 μL של 10-5 כדי 10-7 שעות על לוחיות מוקלטות מראש של campylobacterלוחות ספציפיים משלב 1.1.3. לוחיות התווית משמשות לדילול, מניחים אותן בצנצנת אנאירובית שנייה עם שימוש בדלק ובעזרת מיכל האנטי-גז, ומודגרות ב-37 ° c עבור 48 עד 72 שעות.
הערה: ראה איור 1 ואיור 2 עבור מערכת דילול ותצלומים של מושבות. - לאחר הצמיחה, לבחור את הצלחת עם בין 30 ל-300 מושבות לספור. לנצל את הספירות כדי לקבוע את CFU/mL של התרבות ציר המניה באמצעות משוואה 1:
CFU/mL במלאי = ממוצע של מושבות על בחירה (כפילות) לוחות אנליטיים ÷ (מצופה mL x דילול צלחת) [משוואה 1]
- הכנה וספירת דגימות של צואה קלינית
- מיד לאחר הצלחות עבור ספירות אנליטי מוכנים בשלב 1.1.10, לעשות סט שני של מניות מרק המניה על ידי הכנת 10 מדלל סדרתי 2-לקפל מתוך ציר המניה ואת בריכת הצואה שלילי Campylobacter(nfp). לדוגמה, להכין את הדילול הראשון על ידי ערבוב של כרכים שווים של ציר ו NFP (למשל, 0.1 mL כל אחד) ולהפוך את הדילול הבאים על ידי העברת נפח ייעודי של מרק ו-NFP תערובת לתוך צינור עם שווה ערך ייעודי NFP. הוסף צלחת שליטה עם ציר המכיל את המאגר לא הוסיף מקמוליבקטר לבריכה כדי לעזור לזהות מושבות שאינןמקמפולולוקטר .
- להפוך את NFP מתוך מזוהה, diarrheal החולה דגימות מעקב או כיסאות תורמים בריאים שנבדקו בעבר ומצאו להיות campylobacter-שלילי על ידי שיטות כגון שיטת האנזים campylobacter אנזימים על ידי ה -16 rrna qpcr.
- T-פס 10 μL של כל מקמולולוקטר/שרפרף דילול על כפולים מוקלטת מראש של קמפילובקטר-לוחות אגר ספציפיים. מניחים את הצלחות בצנצנת אנאירובית עם sachet הפקת גז ו-דגירה ב 37 ° c עבור 48 ± 2 h.
- בחנו את הצלחות הרושעות באופן חזותי עבור מושבות הנראות כאלה מתרבויות קאמפילובקטר טהורות.
הערה: הרביע השלישי הוא בדרך כלל שם אלה ימצאו. ראו איור 1 ואיור 2 עבור מערכת דילול ותמונות של גודל המושבה, צבע ומורפולוגיה. - בחרו מספרמושבות מרובות כמו... שימוש במיקרוסקופיה עם עדשה לטבילה בשמן, לבחון שטח בלתי מעוגל בצורה מעוגלת של גראם שליליים, ספירלה, או סיגר בצורת בקטריה קטנה.
הערה: Campylobacter הם גראם שליליים ודורשים fuchsin בסיסי ככתם נגדי (במקום safranin אופייני) להיות דמיינו במדויק. חיידקים שחף כנפיים קלאסי ניתן לראות אבל הם לא דרישה. ראה איור 2 עבור מיקרוגרף מייצג. - אם אחד הצלחות הכפולות בדילול מסוים יש מושבות Campylobacter 1 או יותר, לשקול את הדילול התרבות בצואה חיובית.
- קחו בחשבון את הדילול האחרון המכיל מושבת גראם שלילית בדומה לעין מקמוליבקטר, הגבול של גילוי התרבות. השתמש במשוואה 2 כדי לחשב את cfu/mL של דילול חיובי הדגימה בצואה קלינית לגמרי:
CFU/mL במדגם צואה = CFU/mL אנליטיים דילול עם המושבה החיובית האחרונה [משוואה 2]
הערה: ראה טבלה 2 עבור תוצאות טיפוסיות.
- מיד לאחר הצלחות עבור ספירות אנליטי מוכנים בשלב 1.1.10, לעשות סט שני של מניות מרק המניה על ידי הכנת 10 מדלל סדרתי 2-לקפל מתוך ציר המניה ואת בריכת הצואה שלילי Campylobacter(nfp). לדוגמה, להכין את הדילול הראשון על ידי ערבוב של כרכים שווים של ציר ו NFP (למשל, 0.1 mL כל אחד) ולהפוך את הדילול הבאים על ידי העברת נפח ייעודי של מרק ו-NFP תערובת לתוך צינור עם שווה ערך ייעודי NFP. הוסף צלחת שליטה עם ציר המכיל את המאגר לא הוסיף מקמוליבקטר לבריכה כדי לעזור לזהות מושבות שאינןמקמפולולוקטר .
2. הכדאיות לקביעת היכולת של קמפילובקטר מאוחסן באמצעי תחבורה
- מערבבים 1 מ ל של תרבות ציר Campylobacter (שלב 1.1.8) עם 1 מ ל של nfp ולהכין 10 מדלל סדרתי two-קיפול שכפול ב nfp. עוד לדלל כל דילול 1:4 נוספים בתקשורת קארי-בלייר, בדיוק כמו דגימה קלינית הכין באמצעי התחבורה מטופלים.
- לאחסן את 20 שפופרות דילול ושליטה שלילית במדיום קארי-בלייר בצינורות הכתיר ב 2 על 8 ° צ' עבור 96 h ומושבות לספור מכל דילול המתרחשים בזמן אפס כל 24 h. לספירת המושבה, מדגם הציר: צינורות צואה והגדרת תרבות צואה לספירת מושבה של כל דילול, בשכפול.
- כל לוח יום 10 μL חלקים של מדלל צואה על Campylobacter-אגר סלקטיבי הדגירה ב 37 ° c עבור 48 h, כמתואר לעיל בשלבים 1.1.9-1.2.7.
- לבצע ספירת לוחית אנליטית בו של מלאי חיידקי המקורי (משלב 1.1.8 או מניות מרק טרי) כפי שמתואר לעיל (שלבים 1.1.9-1.1.11). לחשב את CFU/mL של מלאי בקטריאלי המקורי (משוואה 1) כדי לחשב את הריכוז של חיידקים במדגם מדיה הובלה בדיקת צואה שלה (משוואה 2).
3. מוסר שאינו תרבותי לאימות תוצאות התרבות
- השתמש בשיטת חיסוני אנזימים המספקת תוצאות חיוביות שגויות מינימליות12 ומתבצע בהתאם להוראות הוספת החבילה כדי לאמת את תוצאות התרבות.
- השתמש בבחינה מולקולרית שיכול לזהות את הגן rRNA 16 או גן אחר של מגוון רחב של מיני קמוליבקטר 13. ודא שהקונפיגורציה המולקולרית מגיבה עם מינים כגון C. upsaliensis או c. לארי כי לצמוח גרוע על התקן אנטיביוטי המכיל אגר14. בצע את הוראות היצרן להפקת דנ א מתוך דגימות צואה וביצוע הבדיקה.
הערה: רצפי דנ א דו-כיווניים של ה-16 אמפליקון יכול לשמש כדי לאשר את מינים של campylobacter בדגימה חיובית. ה-PCR הספציפי למינים (ראה טבלה 3 עבור גנים היעד) יכול לשמש גם כדי לזהות מינים הנמצאים בתוך מצפצף או דגימות חיוביות15.
Representative Results
לזהות את המושבות. של הקמולובקטר בקרב על מושבות של שוונית מתחרה מחייבת ראייה חדה ושיפוט משמעותי. המספר הנמוך ביותר של מושבות שניתן לאתרם על ידי התרבות לא נחקרו, למרות דגימות מהחולים המשוער לנמל 106על 109 cfu/mL16,17. עם זאת, לא ניתן להשתמש בדגימות מטופלים כקוונ, משום שאין שיטה עצמאית ליצירת מספרים בקטריאליים מדויקים. כדי להתגבר על מגבלה זו, שתי מדידות בו מורכב עם מניה בקטריאלי אחד. בדיקה אחת משמשת לאיתור חזותי של מושבות Campylobacter מן הדילול הסדרתי של החיידק במניות במטריצה צואה, הדמיית דגימות קליניות; השני משמש באופן אנליסטי כדי לכמת את CFU/mL הנוכחי בתרבות מניות בקטריאלי המשמש העולה (איור 2א).
ספי הזיהוי עבור Campylobacter לא יוגדרו כערכים. זה צפוי כי כל מטריצה צואה מורכבת וייחודית, צמיחה של חיידקים הוא משתנה. פרמטר מפתח להצלחה הוא לזהות את מושבות הגודל המדויק בין הפלורה המתחרה בצואה. לוחית מייצגת של תרבות הצואה מוצג באיור 2ג ואיור 2ד. לוחית שליטה שלילית מבלי Campylobacter הוסיף חשוב לעזור לזהות פלורה אחרים בצואה. גראם מכתים מועמדים רבים גם הרכבת את העין כדי להבדיל את המושבות מבריק הנכון ואת הצבע הורוד ביניים של חיידקים גראם שליליים fuchsin מוכתם ומאשרת את המבנה של החיידקים במושבות שנבחרו (איור 2ב). שבעה ניסויים עצמאיים בוצעו, באמצעות 5 c. jejuni ו 2 c. coli broths, ונתן סף החופף והורחב מ 0.3 למעלה 5 x 106 cfu/mL. ראה טבלה 2 עבור נתונים טיפוסיים. מגבלת הזיהוי הממוצע 2 x 106 עבור c. jejuni ו 1.2 x 106 cfu/mL עבור c. coli. הדבר מצביע על כך שהתרבות יכולה לזהות ~ 1 – 2 x 106C. jejuni או C. coli לגרם של הדגימה צואה על תקן אנטיביוטי מכיל campylobacterספציפי אגר בשימוש על ידי מעבדות קליניות רבות. ישנם agars מיוחדים מרובים עם אנטיביוטיקה שונים שעשויים לתת ספי שונים עבור זיהוי המושבה. השיטות המתוארות כאן אמורות לעודד מחקרים כמותיים והשוואתיים יותר כדי לשפר את הדיוק של התרבות ולהרחיב את רב-תכליתיות המדיה החדשה. לדוגמה, 152 המושבות נספרו על לוח 10-5 הראשון ו 144 המושבות על הלוח השני 10-5 . הממוצע בין שתי הלוחיות. הוא 148 מושבות הצלחות חוסנו עם 0.1 mL (100 μL) של 10-5 דילול, אשר על ידי משוואה 1 משווה 148 x 106 (14.8 x 107) cfu/mL במלאי התרבות טהור. כאשר נעשו מדלל הצואה, התרבות הייתה מפועלת לתוך בריכת צואה שלילית ביחס 1:1. לכן, לפי משוואה 2, הנקודה הראשונה (צלחת "a") על עקומת צואה מתאים 14.8 x 107 מחולק על ידי 2 ושווה 7.4 x 107 cfu/mL. שפופרת "a" זה משמש כדי להפוך 9 מדלל נוספים. באיור 1, הדילול האחרון עם מושבה אחת נראית לעין שלילית עם המבנה הדומה של קמפילובקטרהוא על צלחת "g". זה משווה ל 1.1 x 106 Cfu/mL עבור סף התרבות צואה של זיהוי בדוגמה זו.
למרות הכדאיות המתמשכת היא המפתח לדיוק של התרבות, שמירה על הכדאיות של Campylobacter spp. במהלך טיפול ומשלוח של דגימות מהחולים למרפאות להפנות מעבדות הוא בעייתי. אחסון אופייני הוא להכניס דגימות מקרר בצינורות רגילים עם חשיפה לאוויר וללא אווירה מיוחדת. דגימות באמצעי התחבורה (הידועות גם כדגימות שנשמרו) נחשבים להישרדות טובה יותר, אך ישנם מספר דיווחים המספקים נתונים כמותיים18.
שילוב של שיטות אנליטיות ומדגימות שתוארו לעיל שימש שוב להשגת הערכות הכדאיות וההישרדות של C. jejuni באמצעי התחבורה. מרק בקטריאלי מניות שימש להכנת 10-קיפול 2 לקפל ל 1024-לדגום מדגם מטריצה בצואה. המרק הראשוני נמצא על ידי ספירות אנליטי יש ריכוז של 4.8 x 107 cfu/mL. על צלחות שנעשו ביום 0, C. jejuni זוהה (2 ימים לאחר מכן) על הצלחת מלאה עם דילול 32-קיפול, שווה ל 1.5 x 106 cfu/mL. עם זאת, על לוחיות שנעשו לאחר קירור בדיקת צואה קארי בלייר עבור 24 שעות, רק הדילול 2-קיפול (שווה ערך ל 2.4 x 107 Cfu/mL) גדל המושבות גלוי. לא הפסד נוסף של יכולת הקיום התגלה עד 96 שעות, כאשר המחקר הופסק. זה אובדן של קיום משווה ל 16-קיפול (94%) אובדן של אורגניזמים להתרבות בתוך פחות מ -24 שעות ומציין כי, גם עם קירור, שרפרף בינונית קארי בלייר עם פחות מ 107 cfu/mL ג. jejuni יכול להיות מחמיץ על ידי התרבות.
בניגוד לתוצאות התרבות, זיהה החברה את נוכחותו של ג. jejuni בדילול ה256 בנקודת הזמן ההתחלתית ובמשך 4 הימים הראשונים בתקופת הבדיקה. סף האיתור של ה -C. jejuni לצורך זה באמצעות דגימות צואה מחודדים הוא 8.4 x 104 cfu/mL. הסף הזה הוא מתחת לתרבות צואה ומאפשר זיהוי רגיש ויציב יותר של ג. jejuni.
כדי לבדוק את היכולת של התרבות כדי לזהות את Campylobacter spp. בהגדרה קלינית בפועל, 1,552 דגימות שרפרף קליני האופיינים על ידי 6 הליכים: תרבות צואה, שיטת חיסוני חדשה עבור campylobacter spp., ו 4 שיטות מולקולריות. כל הדגימות נאספו וסווגו בתחילה על ידי התרבות המקובלת ב -3 מעבדות בארצות הברית, ולאחר מכן נבדקו על ידי החברה. לאחר מכן הוקרן על ידי השיטות המולקולריות באמצעות שיטות מולקולרית12. לדגימות הוקצו מעמד אמת-חיובי או אמת-שלילי המבוסס על תוצאות 5 שיטות שאינן תרבות. 5 שיטות שאינן תרבות הראו הסכמה מלאה על כל 48 חיוביות ודיסקרטיות כל הדגימות, בעוד התרבות לא מזוהה 14 (28%). הדגימות שזוהו באופן שגוי על-ידי התרבות כללו 13 דגימות שליליות וחיוביות מזויפות.
איור 1: הערכה להכנה בו של דגימות בצואה אנליטית ומחודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי מושבות ג. jejuni מתרבויות טהורות וצואה. (א) צילום של מושבות ג. jejuni מתרבות חיידקית טהורה לאחר 72 שעות הדגירה. (ב) כתמים של ג. jejuni מן התרבות החיידקית הטהורה, שמן טבילה 400 x הגדלה. (ג) צילום של c. jejuni-חיובי בצואה תרבות אחרי 48 h הדגירה. (ד) אזור מוגדל בתיבה (ג), הגדלה בגודל 10x. חיצים לבנים מציינים את גודל הפין- שלילי C. jejuni המושבות. ראש החץ השחור מציין מושבה שהיא קצת יותר גדולה, גראם חיובית ולא מג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| תרבויות | OD600 @ T0 | OD600 @ T גמר1 | הסופי CFU/mL |
| ג. ג'ג'וני | 0.146 | 0.321 | 1.28 x 107 |
| ס. קולי | 0.245 | 0.508 | 4.50 x 108 |
טבלה 1: צמיחה אופיינית CFU/mL של c. jejuni ו -c. קולי מניות. 1ג. התרבות של jejuni נעצרה לאחר 48 h של דגירה. C. coli התרבות נעצרה לאחר 54 h של דגירה.
| שפופרת דילול לדגימת צואה מחודדים | מספר המושבות של קמפילובקטר | מספר מושבות גראם שליליות1 | ? תרבות חיובית | CFU/mL מחושבים של דגימת מחודדים | |
| ג. jejuni (1.28 x 108 מניות cfu/mL) | (קיפול לשניים) מ | צפוף | nd2 | כן | 6.40 x 107 |
| (4-קיפול) b | 20 + | nd | כן | 3.20 x 107 | |
| (8-קיפול) c | 4-10 | nd | כן | 1.60 x 107 | |
| (16-קיפול) d | nd | כן | 8.00 x 106 | ||
| (32-קיפול) e | nd | כן | 4.00 x 106 | ||
| (64-קיפול) f | 1-3 | 1 מתוך 2 | כן | 2.00 x 106 | |
| (128-קיפול) g | 2 מתוך 3 | כן | 1.00 x 106 | ||
| 3(256-קיפול) h | 1 מתוך 2 | כן | 5.00 x 105 | ||
| (512-קיפול) | 0 מתוך 1 | לא | 2.50 x 105 | ||
| (1024-קיפול) j | 0 | nd | לא | הוראות מאוד NFP | |
| C. coli (4.50 x 108 cfu/mL מניות) | (קיפול לשניים) מ | צפוף | nd | כן | 2.25 x 108 |
| (4-קיפול) b | nd | כן | 1.13 x 108 | ||
| (8-קיפול) c | 50 + | nd | כן | 5.63 x 107 | |
| (16-קיפול) d | 30 + | nd | כן | 2.81 x 107 | |
| (32-קיפול) e | 10 + | nd | כן | 1.41 x 107 | |
| (64-קיפול) f | 3-8 | nd | כן | 7.03 x 106 | |
| (128-קיפול) g | nd | כן | 3.52 x 106 | ||
| 3(256-קיפול) h | 1-3 | 1 מתוך 3 | כן | 1.76 x 106 | |
| (512-קיפול) | 0 מתוך 1 | לא | 8.79 x 105 | ||
| (1024-קיפול) j | 0 | nd | לא | הוראות מאוד NFP |
טבלה 2: מספר אופייני של מושבות על צלחות של דגימות צואה מחודדים. 1 מושבות גראם שליליות בקרב מושבות מסוג Campylobacter, 2nd = לא נקבע, 3נתונים בגופן מודגש מציין דילול חיובי אחרון.
| ינים | מטרת הגן |
| ג. ג'ג'וני | היפופו |
| ס. קולי | קאף |
| ג. אופסליאנסיס | cpn60 |
| ג. לארי | cpn60 |
| ג. הלפטיקוס | cpn60 |
| ג. עובר | cpn60 |
| ג. היפרנטאליס | cpn60 |
| ג. מדבר | cpn60 |
שולחן 3: גנים שימושיים לגילוי מיני קמוליבקטר בודדים qpcr.
Discussion
שיטות התרבות המתוארות כאן בנויות על טכניקות פשוטות ונפוצות בשימוש בחומרים הזמינים ברוב המעבדות10. זהו שילוב של דגימות אנליטיות ומעשית המספקים מידע חדש של סף איתור קליני רלוונטי לתרבויות צואה. בנוסף, השיפוט של תוצאות התרבות עם 5 מוסר נפרד מחזק את המסקנות כי התרבות בצואה מקמוליבקטר מזהה חלק משמעותי של דגימות המטופלים. השוק המולקולארי והמולקולרי הם שימושיים כיוון שהם כל אחד מבוסס על עיקרון שונה (אנטיגן אינטראקציה עם נוגדן vs. DNA הגברה), וחשוב מכך, לא להסתמך על הכדאיות של חיידקים. שימו לב, שיטת ה-, המשמשת למחקרים אלה, מאומתת היטב והוצגה כהסכמה מלאה עם 4 בדיקות מולקולריות12.
התרבות של קמפולובקטר spp. היא בעייתית במיוחד, עם רגישות שדווחו לטווח של 60-76%19,20, וברור מתוך הקצב שלה ~ 30% של אי לאתר דגימות אמת-חיובית כאן. כוח אדם יכול לצפות כי שליטה בדיקות מולקולריות ומולקולרי יפיק לעתים קרובות תוצאות חיוביות כאשר נתוני התרבות הם שליליים.
הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא זיהוי של מושבות של נקודת הסיכה בקרב פלורה מתחרה בצואה. זה לא יוצא דופן, כמו מדלל ליד הסף לזיהוי, יש לסירוגין אפס ושאינו אפס הערכות המושבה מספר (למשל, 2, 0, 1, 0, 0). חשוב להכיר כי סף התרבות יהיה מגוון של ריכוזים, לא CFU/mL ספציפי. למרות זאת, ההערכה של ~ 1 x 106 Cfu/mL צואה כמגבלה נמוכה יותר עבור גילוי התרבות משווה היטב עם דוחות שאנשים נגועים לשפוך 106 כדי 109campylobacter לכל גרם צואה21. שינויים באנטיביוטיקה או לוחות אגר ווריאציות בלתי נמנעת בדגימות של צואה בודדים יהיה ללא ספק לשנות את ערכי הסף. פרוטוקול זה אמור לאפשר שיפורים במדיית הגדילה.
מידע זה הראשון על מגבלה של גילוי התרבות מאפשר להגדיר את הנתונים הרלוונטיים קלינית עבור בדיקות אבחון, ומניח את הקרן מיקרוביולוגית אשר נדרש לטפל בסוגיות שלא נחקרו של הכרכרה לא סימפטומטי22,23 על ידי campylobacter, או אם בקטריאלי עומס במקביל עם סימפטומים או ברצף.
Disclosures
המחברים הם עובדים של TECHLAB, Inc. אשר מייצרת את הערכה QUIK צ'ק™ המשמש כמשווה במאמר זה.
Acknowledgments
מחקרים אלה ממומנים על ידי TECHLAB, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anaerobic 3.5L Jar | Thermo Fisher | HP0031A | |
| AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar | Hardy Diagnostics | AG701 | |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD Biosciences | 237500 | |
| Bacto Protease Peptone | Life Technologies Corp | 211684 | |
| Basic Fuchsin | Fisher Scientific | B12544 | |
| BBL Trypticase Peptone | Life Technologies Corp | 211921 | |
| C. coli Type strain | ATCC | 33559 | |
| C. jejuni Type strain | ATCC | 33560 | |
| CampyGen gas generating system sachet | Thermo Fisher | CN0025A | |
| Campylobacter QUIK CHEK | TechLab, Inc. | T5047 / T31025 | |
| Cary-Blair transport medium | Fisher Scientific | 23-005-47 | |
| Coli Roller Sterile plating beads | Millipore Sigma | 71013 | |
| Dilution Buffer | Anaerobe Systems | AS-908 | |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio, Inc | SFBM30 | |
| Sodium bisulfite | Sigma-Aldrich | 243973 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 |
References
- CDC. Annual Summaries of Foodborne Outbreaks. , Available from: https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html (2018).
- Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).
- Pitkanen, T. a, H, M. L. Global Water Pathogen Project. Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. , UNESCO (2017).
- Fitzgerald, C., et al. Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).
- Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. Update on human Campylobacter jejuni infections. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).
- CDC. Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013. Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).
- Jaime, A. L., et al. Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States. Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).
- Bullman, S., O'Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis. Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).
- Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).
- M'ikanatha, N. M., et al. Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA. Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).
- Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools. Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).
- Buss, J. E., et al. Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).
- Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).
- Allos, B., Blaser, M. J. Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. , Churchill Livingstone. 2793-2802 (2009).
- Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).
- Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. Comparison of preservation media for storage of stool samples. Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).
- Bessède, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., Mégraud, F. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture. Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).
- Bessède, E., et al. Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).
- Shane, A. L., et al. Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea. Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).
- Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fernández, H. Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).
- Lee, G., et al. Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).
