Summary
Den præsenterede protokol bruger flow cytometri til at kvantificere antallet af prolifererende og døde celler i dyrkede mus enteroids. Denne metode er nyttig til at vurdere virkningerne af narkotikabehandling på organoid spredning og overlevelse.
Abstract
Tarmepitel fungerer som en barriere, der forhindrer luminal indhold, såsom patogene mikrobiota og toksiner, i at komme ind i resten af kroppen. Epitelbarrierefunktion kræver integriteten af epitelceller i tarmen. Mens epitelcelleproliferation opretholder et kontinuerligt lag af celler, der danner en barriere, fører epitelskader til barrieredysfunktion. Som et resultat, luminal indhold kan på tværs af tarmbarrieren via en ubegrænset vej. Dysfunktion af tarmbarriere har været forbundet med mange tarmsygdomme, såsom inflammatorisk tarmsygdom. Isolerede mus tarm krypter kan dyrkes og vedligeholdes som krypt-villus-lignende strukturer, som kaldes tarm organoids eller "enteroids". Enteroids er ideelle til at studere spredning og celledød af tarm epitelceller in vitro. I denne protokol beskriver vi en simpel metode til at kvantificere antallet af proliferative og døde celler i dyrkede enteroids. 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) og propidiumodid bruges til at mærke proliferating og døde celler i enteroids, og andelen af prolifererende og døde celler analyseres derefter ved flow cytometri. Dette er et nyttigt værktøj til at teste virkningerne af narkotikabehandling på intestinal epitelcelleproliferation og celleoverlevelse.
Introduction
En grundlæggende funktion af tarmepitelceller er at beskytte indførsevnen af luminale indhold såsom patogene bakterier og toksiner1,2. For at udføre en sådan funktion, tarm stamceller løbende formere sig og differentiere ind i en række epitelceller, herunder enterocytter og sekretoriske celler, som danner en barriere ved at danne stramme forbindelser3. Den hurtige fornyelse af tarmepitelceller kræver streng koordinering af cellespredning, celledifferentiering og celledød4,5. Reduceret cellespredning eller overdreven celledød fører til epitelskader og kompromitteret barrierefunktion1,6. Dysfunktion af tarmbarriere har været forbundet med inflammatoriske tarmsygdomme7,8.
En metode til at kultur tarm krypter er tidligere blevet udviklet. Ved hjælp af denne teknik, isolerede musekrypter vokse ind i intestinal organoids (enteroids), som har krypt-villus lignende strukturer og indeholder alle intestinale epitelcelle afstamning9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) er en thymidin analog, der er i stand til at erstatte thymin (T) i DNA, der er ved at blive replikeret under celleproliferation. De proliferative celler kan hurtigt og præcist mærket af EdU farvning. Propidiumiodid (PI) er en analog af ethidiumbromid, der frigiver rød fluorescens ved indsættelse i dobbeltstrenget DNA. PI registrerer specifikt døde celler, da den kun passerer gennem den beskadigede cellemembran.
I denne protokol beskriver vi først, hvordan man isolerer krypter fra murine tyndtarmen og derefter kultur dem som enteroids in vitro. Vi beskriver derefter, hvordan man analyserer de proliferative og døde celler i enteroids af EdU og PI inkorporering og flow cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af Animal Care and Use Committee of Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) på Soochow University.
1. Intestinal organoid isolation og kultur
- Isolering af tarmkrypter og enteroidkultur
- Euthanize en 8 uger gammel vild-type mus med CO2 indånding. Brug vævspincet og fine irissaks til at dissekere ca. 8 cm ileum.
- Skyl ud med en sprøjte med sondefodringsnål med ca. 40 ml iskold Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS), og skær derefter langs med en saks, og åbn ileum.
- Skær ileum i små (0,5−1,0 cm) stykker. Placer stykkerne i 5 ml steriliskold DPBS i et 15 ml konisk rør, derefter klippes i 5 min på is.
- Brug en pipettecontroller til at aspirere DPBS og udskifte den med 10 ml kold buffer 1 (2 mM EDTA i DPBS). Rock i 30 min på is.
- Brug pipettecontrolleren til at aspirere buffer 1 og erstatte med 10 ml kold buffer 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM saccharose i DPBS). Ryst i 2−3 min i hånden (~80 shakes/min).
- Tag en 20 μL dråbe buffer 2 indhold efter rysten og inspicere under et mikroskop.
- Filter buffer 2 indhold med en 70 μm steril celle si, derefter indsamle den filtrerede buffer med en 50 ml konisk rør.
- Pipette 20 μL filtrat på diaset for at tælle krypterne. Overfør en tilstrækkelig mængde buffer 2 fra trin 1.1.7 for at sikre, at der er ~ 500 krypter / godt.
- Drej ned ved 150 x g i 10 min ved 4 °C. Når spinning er færdig, omhyggeligt aspirere supernatant.
- Suspendere krypter i 50 μL af kælderen membran matrix (f.eks Matrigel) pr 500 krypter, pipette op og ned (være omhyggelig med at undgå bobler), derefter placere en 50 μL dråbe kælder membran matrix / krypt mix i midten af en brønd i en 24 brønd plade. Inkuber e30 min ved 37 °C for at polymerisere kældermembranmatrix.
- Efter 30 min polymerisering, omhyggeligt tilføje 600 μL minigut medier (avanceret Dulbecco's modificerede Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mM L-alanin-L-glutamin, pen / strep [100 enheder / ml], 10 mM Hepes, N2 supplement [1:100], B27 supplement [1:50] med epidermal vækstfaktor [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL] og Y27632 [10 μM]) til hver brønd, og derefter returnere pladen til 37 °C-inkubatoren. Overhold under et mikroskop hver dag, og skift mediet hver 2-3.
- Enteroid passaging
BEMÆRK: For lange kulturer, enteroids bør opdeles ca hver uge.- For at passage enteroids, placere væv kultur plade på is. Aspirer medierne og tilføje 1 ml kold DPBS til hver brønd. Brug en P1000 spids til pipette op og ned, indtil der ikke er nogen solid kældermembranmatrixstykker tilbage.
- Gå op og ned én gang gennem en 1 ml insulinsprøjte (27 G) og ind i et konisk rør på 15 ml. Drej ned i 5 min ved 150 x g ved 4 °C.
- Brug pipette til at fjerne DPBS. Resuspendering i 50 μL af kælderen membran matrix / godt.
- Pladen anbringes i en 37 °C-inkubator i 30 minutter for at tillade, at kældermembranmatrixen polymeriseres. Overlay hver brønd med 600 μL AF ENR medier (minigut medier, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), og derefter returnere pladen til rugemaskine.
2. Flow cytometri Analyse af EdU-positive celler i Enteroids
BEMÆRK: Figur 1 viser arbejdsgangen for flowcytometrianalyse af EdU-positive celler i enteroids.
- Inkubation af enteroids med EdU
- Grow enteroids fra trin 1.2.4 i 5-7 dage. Passage enteroids i en ny 24 godt plade i et opdelingsforhold på 1:2. Der tilsættes 600 μL ENR-medium til hver brønd. Inkubatorier i 4−5 dage i en 37 °C-inkubator.
- Indstil kontrolgruppen (ubehandlede enteroider) og forsøgsgruppen (enteroids behandlet med 5 ng/mL interleukin 22 [IL-22]). Forbered mindst tre replikater for hver gruppe.
- Tilføj EdU til ENR-mediet for at forberede EdU-mediet med en koncentration på 50 μM. Der tilsættes 600 μL EdU-medium til hver brønd og inkuberes i 2 timer i en 37 °C-inkubator. Indstil en brønd af enteroids uden EdU behandling som en negativ kontrol for baggrunden subtraktion.
- Høst af enteroids fra kældermembranmatrix
- Brug en pipettecontroller til at aspirere EdU-mediet og vaske 1x med DPBS. Tilføj 1 ml DPBS.
- Brug P1000 pipettespids og pipette op og ned, indtil der ikke er nogen fast kældermembranmatrixstykker tilbage. Overfør til et 15 ml rør, og drej ned med 300 x g i 5 min. Kassér supernatantet.
- Der tilsættes 500 μL celledissociationsenzymer (materialetabel) og inkuberes i 15 min ved 37 °C. Brug P200 pipettespids og pipette op og ned for at bryde enteroids i enkelte celler.
- Der tilsættes 3 ml DMEM-medium indeholdende 10% føtal kvægserum (FBS) og pipette med p1000 pipettespids.
- Spin ned på 300 x g i 5 minutter og aspirer supernatantmediet. Ophæng cellerne igen med 1 ml DPBS.
- Fiksering og permeabilisering af celler
- Overfør celleaffjedringen til et 1,5 ml rør, drej ned med 300 x g i 5 minutter, og kassér supernatantet.
- Resuspendering celler med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA), fix i 15 min ved stuetemperatur (RT), og spin ned på 300 x g i 5 min. Aspiresupernatant med en pipette spids, vask 1x med DPBS, og drej ned for at fjerne supernatant.
- Resuspendering celler med 1 ml 0,5% nonionic overfladeaktive middelstof. Inkubere i 10 min på RT.
- Spin ned på 300 x g i 5 minutter og aspirer supernatanten. Vask 1x med DPBS og drej ned for at fjerne supernatanten.
- Registrering af edu
- Forbered lageropløsninger til hver komponent på forhånd: 1) arbejdsopløsning af Alexa Fluor azid, 2) arbejdsopløsning på 1x EdU-reaktionsbuffer og 3) 10x lageropløsning af EdU-buffertilsætningsstof.
- Forbered 1x EdU buffer tilsætningsstof ved at fortynde 10x opløsning 1:10 i deioniseret vand. Gør denne løsning klar.
- Forbered reaktioncocktail i henhold til tabel 1.
BEMÆRK: Tilsæt ingredienserne i den rækkefølge, der er angivet i tabellen. Brug reaktionscocktailen inden for 15 min forberedelse. - Der tilsættes 100 μL reaktionscocktails på hvert 1,5 ml rør. Resuspendere cellerne, beskytte mod lys, inkubere i 30 min på RT.
- Centrifugeres ved 300 x g i 5 min. og sug reaktionsopløsningen forsigtigt med pipettespids.
- Tilsæt 0,5% nonionic overfladeaktive penetrant til hvert rør til at vaske 1x på RT. Centrifuge ved 300 x g i 5 min, aspirere supernatantmed pipettespids forsigtigt, og resuspendering cellerne i 1 ml DPBS.
- Analyse af celler efter flowcytometri
- De opslælsede celler filtreres med en 40 μm si, og opsaml derefter de filtrerede celler med et konisk rør på 15 ml. Udfør FACS on-machine detektion så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Hvis forholdene er begrænsede, skal cellefarveprøverne opbevares i mørke ved 4 °C og flowtestes inden for 3 dage. - Vælg den relevante kanal (i henhold til typen af Alexa Fluor azide i EdU kit; her, rød kanal) og spænding (her, ~ 150-350 V) for flow cytometri analyse.
- Gating strategi
- Tegn et FSC-A (x-akse) vs. SSC-A -pseudofarveplot (y-akse), og fordel de fleste celler til det synlige område af prikkortet ved at justere spændingen. Markér cellepopulationen (R1), og ekskluder celleresterne i nederste venstre hjørne.
- Fra R1-cellepopulationen skal du oprette en FSC-A (x-akse) vs. FSC-H (y-akse) pseudofarveplot, og indstil porten til at markere enkelte celler (R2) for at udelade celleklumper.
- Fra R2-cellepopulationen skal fluorescensintensiteten (x-akse) bestemmevseri forhold til . cellenummer (y-akse) plot, og brug det negative kontrolelement til at indstille porten. Området for lysstofrør er et positivt celleområde (R3). Sammenlign forholdet mellem EdU-positive celler (R3) mellem forsøgs- og kontrolgrupperne.
- De opslælsede celler filtreres med en 40 μm si, og opsaml derefter de filtrerede celler med et konisk rør på 15 ml. Udfør FACS on-machine detektion så hurtigt som muligt.
3. Flow cytometri Analyse af PI-positive celler i Enteroids
BEMÆRK: Figur 2 viser arbejdsgangen for flowcytometrianalyse af PI-positive celler i enteroids.
- Inkubation af enteroidceller med PI
- Grow enteroids fra trin 1.2.4 i 5-7 dage. Passage enteroids i en ny 24 godt plade i et opdelingsforhold på 1:2. Der tilsættes 600 μL ENR-medium til hver brønd. Inkubatorier i 4−5 dage i en 37 °C-inkubator.
- Indstil kontrolgruppen (ubehandlet) og forsøgsgruppen (IL-22 behandlet), ved hjælp af mindst tre replikater for hver gruppe.
- Pi til ENR-mediet for at forberede PI-mediet med en koncentration på 3 μM.
- Der tilsættes 600 μL PI-medium til hver brønd og inkuberes i 30 minutter i en 37 °C-inkubator. Indstil en brønd af enteroids uden PI behandling som en negativ kontrol for baggrunden subtraktion.
- Høst enteroids fra kældermembranmatrix efter trin 2.2.1−2.2.5.
- Analyse af celler efter flowcytometri
- De ophængte celler filtreres med en 40 μm si, og de filtrerede celler indsamles med et konisk rør på 15 ml.
- Udfør FACS on-machine detektion så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Hvis forholdene er begrænsede, skal cellefarveprøverne opbevares i mørke ved 4 °C og flowtestes inden for 3 dage. - Vælg den relevante kanal (her, rød kanal) og spænding (her, ~ 150-350 V) for flow cytometri analyse.
- Brug den samme gatingstrategi som beskrevet i afsnit 2.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Små tarmkrypter blev isoleret og dyrket som enteroids i kælderen membran matrix. Enteroids begyndte at danne knopper 2 dage efter isolation. På dag 6 havde enteroids mange knopper med masser af snavs (døde celler) i lumen. Enteroids var klar til at blive passage på dette tidspunkt(figur 3).
Talrige undersøgelser har vist, at inflammatoriske cytokiner er afgørende for opretholdelsen af intestinal epitelhostasi. Unormal ekspression af inflammatoriske cytokiner er tæt forbundet med forekomsten af inflammatoriske tarmsygdomme11. For eksempel viste vores tidligere undersøgelse, at IL-22 fremmer spredning af transit-forstærkende celler, men også nedbryder Lgr5+ stamceller12.
Enteroids blev behandlet med IL-22 i 3 dage, hvorefter det syntetiske DNA blev mærket med EdU for at angive celleproliferation. IL-22-behandlede enteroids viste et øget antal EdU+ celler (Figur 4A). IL-22 øget spredning celler fra 40,1% til 83,5% som analyseret ved flow cytometri (Figur 4B). IL-22 behandling også øget celledød i enteroids, angivet ved PI farvning (Figur 5A). IL-22 øgede døde celler fra 4,9% til 16,2% som analyseret af flow cytometri (Figur 5B).
Figur 1: Arbejdsgangsdiagram for flowcytometrianalyse af EdU-positive celler i enteroids. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsgangsdiagram for flowcytometrianalyse af PI-positive celler i enteroids. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Brightfield billeder af enteroids på 2, 4 og 6 dage efter krypt isolation. Skalastang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: IL-22 øger enteroids spredning. A) Enteroids blev dyrket i medium uden eller med IL-22 (5 ng/ml) i 3 dage og inkuberet med EdU (rød) for 1 h. Skalabar = 100 μm. (B) Flow cytometridata fra enteroids dyrket uden (venstre) eller med (højre) IL-22. Data er repræsentative for tre separate forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: IL-22 fremmer celledød i enteroids. (A) Enteroids blev dyrket i medium uden eller med IL-22 (5 ng/ml) i 3 dage og plettet med propidiumiodid (rød). Skalastang = 100 μm. (B) Flow cytometridata fra enteroids dyrket uden (venstre) eller med (højre) IL-22. Data er repræsentative for tre separate forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reaktionskomponenter | Antal brønde af 24-brøndsplader | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x reaktionbuffer | 86 μL | 172 μL | 430 μL | 860 μL | 1,72 μL | 4,3 μL |
| CuSO4 delte et år. | 4 μL | 8 μL | 20 μL | 40 μL | 80 μL | 200 μL |
| Alexa Fluor azide | 0,25 μL | 0,5 μL | 1,25 μL | 2,5 μL | 5 μL | 12,5 μL |
| Tilsætningsstof til reaktionsbuffer | 10 μL | 20 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 500 μL |
| Samlet volumen | 100 μL | 200 μL | 500 μL | 1 μL | 2 μL | 5 μL |
| BEMÆRK: Tilsæt ingredienserne i den rækkefølge, der er angivet i tabellen. | ||||||
Tabel 1: EdU reaktion cocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver de trin, der er nødvendige for kulturen i enteroids in vitro og kvantificering af EdU- og PI-positive celler i enteroids ved flow cytometri. Der er flere fordele ved denne strategi. For det første anvendes EdU-mærkning til at detektere spredningsceller i enteroider. Sammenlignet med traditionel BrdU-analyse er EdU-mærkningsmetoden hurtigere, mere følsom og mere præcis. EdU er meget lig thymin (T), som erstatter thymin i DNA-syntese under celledeling. Sammenlignet med BrdU antistof, EdU er lettere at diffuse ind i cellen, og påvisning af EdU kræver ikke DNA denaturering og et antigen-antistof reaktion. For det andet kan flow cytometrianalyse hurtigt og præcist kvantificere proliferating (EdU+) og døde (PI+)celler i enteroids.
For at kunne udføre hele proceduren, er der kritiske aspekter, der skal overvejes. For det første er det vigtigt at kultur enteroids under tilstrækkelige forhold. Velvoksne enteroids bør have masser af knopper, som indeholder proliferative celler. For det andet er det vigtigt at opdele enteroids i tide. Vragdele akkumuleret i lumen indeholder døde celler, som kan farves med PI. Dette er skadeligt for følgende flow cytometri analyse. For det tredje, på grund af de mange trin (dvs. celle farvning, celle fiksering, membran brud, og centrifugering), celler kan let gå tabt under proceduren. Således er det vigtigt at indsamle et tilstrækkeligt antal enteroids. Det er vigtigt at kombinere 2−3 brønde (i en 24 brøndplade) af enteroids før fiksering. Endelig er det afgørende at tilføje ingredienser til bufferen for at opdage EdU, ellers vil reaktionen ikke fortsætte optimalt.
Sammenfattende beskriver protokollen trin for dyrkning af museenteroider in vitro og kvantificering af spredning og døde celler ved flow cytometri. Enteroids er nyttige værktøjer til sygdommodellering og terapeutisk lægemiddelopdagelse. Denne protokol hjælper udforskning af virkningerne af inflammatoriske cytokiner, patogen, og narkotika på celleproliferation og celle overlevelse i enteroid kultur modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af The National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 og 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (BK20190043, BK20180838), Forskningsfond for statens nøglelaboratorium for farmaceutisk bioteknologi, Nanjing Universitet (KF-GN-202004). The Natural Science Foundation af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner i Kina (19KJB320003), Levebrød og Teknologi Program af Suzhou City (SYS2019030), og The Research Innovation Program for College Kandidater i Jiangsu-provinsen (KYCX19-1981) . Dette arbejde er også støttet af Tang Scholar fra Soochow University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
