Summary
يستخدم البروتوكول المقدم قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد الخلايا المتكاثرة والميتة في مُدخلات الماوس المستزرعة. هذه الطريقة مفيدة لتقييم آثار العلاج بالعقاقير على انتشار الأعضاء والبقاء على قيد الحياة.
Abstract
يعمل ظهارة الأمعاء كحاجز يمنع المحتويات المضيئة ، مثل الميكروبات المسببة للأمراض والسموم ، من دخول بقية الجسم. وظيفة الحاجز الظهاري يتطلب سلامة الخلايا الظهارية المعوية. في حين أن انتشار الخلايا الظهارية يحافظ على طبقة مستمرة من الخلايا التي تشكل حاجزا، يؤدي الضرر الظهاري إلى خلل في الحواجز. ونتيجة لذلك، يمكن للمحتويات المضيئة عبر الحاجز المعوي عبر مسار غير مقيد. وقد ارتبط خلل الحاجز المعوي مع العديد من الأمراض المعوية، مثل مرض التهاب الأمعاء. يمكن استزراع سراديب معوية معزولة للفأرة والحفاظ عليها كهياكل تشبه السرداب ، والتي يطلق عليها الأعضاء المعوية أو "enteroids". Enteroids مثالية لدراسة انتشار وموت الخلايا الظهارية المعوية في المختبر. في هذا البروتوكول، نصف طريقة بسيطة لتحديد عدد الخلايا التكاثرية والميتة في enteroids المستزرعة. وتستخدم 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ويوديد البروبيديوم لتسمية الخلايا المنتشرة والخلايا الميتة في enteroids، ثم يتم تحليل نسبة الخلايا المنتشرة والميتة عن طريق قياس التدفق الخلوي. هذا هو أداة مفيدة لاختبار آثار العلاج بالعقاقير على انتشار الخلايا الظهارية المعوية وبقاء الخلايا.
Introduction
وظيفة أساسية للخلايا الظهارية المعوية هي حماية دخول المحتويات المضيئة مثل البكتيريا المسببة للأمراض والسموم1،2. لأداء مثل هذه الوظيفة ، تتكاثر الخلايا الجذعية المعوية باستمرار وتفرق في مجموعة متنوعة من الخلايا الظهارية ، بما في ذلك الخلايا المعوية والخلايا الإفرازية ، والتي تشكل حاجزًا عن طريق تشكيل اتصالات ضيقة3. التجديد السريع للخلايا الظهارية المعوية يتطلب تنسيقا صارما من انتشار الخلايا، تمايز الخلايا، وموت الخلية4،5. انخفاض انتشار الخلايا أو الموت المفرط للخلايا يؤدي إلى تلف الظهارية ووظيفة الحاجز للخطر1،6. وقد ارتبط خلل في حاجز الأمعاء مع أمراض الأمعاء الالتهابية7،8.
وقد وضعت طريقة لثقافة سراديب المعوية سابقا. باستخدام هذه التقنية ، تنمو سراديب الماوس المعزولة إلى أعضاء معوية (enteroids) ، والتي تحتوي على تشفير villus مثل الهياكل وتحتوي على جميع نسب الخلايا الظهارية المعوية9،10. 5-إيثينل-2'-ديوكسيوريدين (EdU) هو تناظري ثيميدين قادر على استبدال الثيامين (T) في الحمض النووي الذي يخضع للتكرار أثناء انتشار الخلايا. يمكن تسمية الخلايا التكاثرية بسرعة ودقة من قبل تلطيخ EdU. يوديد البروبيديوم (PI) هو تناظري من بروميد الإيتيديوم الذي يطلق الفلورسينالأحمر عند إدخاله في الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. يكشف PI على وجه التحديد الخلايا الميتة ، لأنه يمر فقط من خلال غشاء الخلية التالفة.
في هذا البروتوكول، ونحن أولا وصف كيفية عزل سراديب من الأمعاء الدقيقة المورين ثم ثقافة لهم كما enteroids في المختبر. ثم نصف كيفية تحليل الخلايا التكاثرية والميتة في enteroids من قبل EdU وPI التأسيس والتدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في مركز كامبريدج سودا للموارد الجينومية (CAM-SU) في جامعة سوكو.
1. العزلة الأوروفية المعوية والثقافة
- عزل السراديب المعوية والثقافة المعوية
- القتل الرحيم من العمر 8 أسابيع الماوس البرية من نوع مع استنشاق CO2. استخدام ملقط الأنسجة ومقص القزحية الدقيقة لتشريح ما يقرب من 8 سم من الإيليوم.
- طرد باستخدام حقنة مع إبرة تغذية gavage مع حوالي 40 مل من الجليد البارد ة دولبيكو في الفوسفات العازلة المالحة (DPBS)، ثم قطع بالطول مع مقص وفتح ileum.
- قطع الإيليوم إلى قطع صغيرة (0.5−1.0 سم). ضع القطع في 5 مل من DPBS الثلج البارد المعقم في أنبوب مخروطي 15 مل، ثم صخرة لمدة 5 دقيقة على الجليد.
- استخدم وحدة تحكم ماصة لتنشق DPBS واستبدالها بـ 10 مل من المخزن المؤقت البارد 1 (2 mM EDTA في DPBS). صخرة لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- استخدام وحدة تحكم ماصة لاستنشاق المخزن المؤقت 1 واستبداله اسعة 10 مل من العازلة الباردة 2 (54.9 mM D-sorbitol، 43.4 mM السكروز في DPBS). يهز لمدة 2-3 دقيقة باليد (~ 80 يهز / دقيقة).
- تأخذ 20 ميكرولتر قطرة من محتويات المخزن المؤقت 2 بعد اهتزاز وتفتيش تحت المجهر.
- تصفية العازلة 2 محتويات مع مصفاة خلية معقمة 70 ميكرومتر، ثم جمع المخزن المؤقت المصفى مع أنبوب مخروطي 50 مل.
- ماسيت 20 ميكرولتر من الفيلتر على الشريحة لحساب السراديب. نقل حجم كاف من المخزن المؤقت 2 من الخطوة 1.1.7 للتأكد من وجود ~ 500 سراديب / جيدا.
- تدور أسفل في 150 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. بمجرد الانتهاء من الغزل ، يستنشق بعناية السوبرناستانت.
- تعليق السراديب في 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، Matrigel) لكل 500 سراديب، ماصة صعودا وهبوطا (الحرص على تجنب الفقاعات)، ثم وضع 50 ميكرولتر قطرة من مصفوفة غشاء الطابق السفلي / مزيج سرداب في وسط بئر واحد في لوحة 24 جيدا. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية لبلمرة مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
- بعد 30 دقيقة من البلمرة، إضافة بعناية 600 ميكرولتر من وسائل الإعلام minigut (متقدمة دولبيكو تعديل النسر المتوسطة [DMEM]/F12، 2 mM L-ألانين-L-الجلوتامين، القلم / strep [100 وحدة/مل]، 10 mM Hepes, N2 الملحق [1:100], B27 الملحق [1:50] مع عامل نمو البشرة [EGF; 50 نانوغرام/مل], Noggin [100 نانوغرام/مل], R-spondin [500 نانوغرام/مل], وY27632 [10 ميكرومتر]) إلى كل بئر, ثم إعادة لوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. مراقبة تحت المجهر كل يوم، وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.
- ممر النُهُط
ملاحظة: بالنسبة للثقافات الطويلة، يجب تقسيم enteroids كل أسبوع تقريبًا.- لمرور enteroids، وضع لوحة زراعة الأنسجة على الجليد. استشير وسائل الإعلام وإضافة 1 مل من DPBS الباردة إلى كل بئر. استخدام P1000 تلميح إلى ماصة صعودا وهبوطا حتى لا تبقى قطع مصفوفة غشاء الطابق السفلي الصلبة.
- مرر مرة واحدة من خلال حقنة أنسولين 1 مل (27 G) وإلى أنبوب مخروطي 15 مل. قم بالدوران لأسفل لمدة 5 دقيقة عند 150 × ز عند 4 درجات مئوية.
- استخدام ماصة لإزالة DPBS. إعادة تعليق في 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي / حسنا.
- ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح لمصفوفة غشاء الطابق السفلي بالبلمرة. تراكب كل بئر مع 600 ميكرولتر من وسائل الإعلام ENR (وسائل الإعلام minigut، 50 نانوغرام / مل EGF، 100 نانوغرام / مل نوجين، 500 نانوغرام / مل R-spondin)، ثم العودة لوحة إلى الحاضنة.
2. تدفق تحليل الخلايا من الخلايا EdU إيجابية في Enteroids
ملاحظة: يوضح الشكل 1 سير العمل لتحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا الإيجابية EdU في enteroids.
- احتضان enteroids مع EdU
- تنمو enteroids من الخطوة 1.2.4 لمدة 5-7 أيام. enteroids مرور في لوحة جديدة 24 جيدا في نسبة تقسيم 1:2. إضافة 600 ميكرولتر من ENR المتوسطة إلى كل بئر. احتضان enteroids لمدة 4-5 أيام في حاضنة 37 درجة مئوية.
- تعيين مجموعة التحكم (enteroids غير المعالجة) والمجموعة التجريبية (enteroids تعامل مع 5 نانوغرام / مل interleukin 22 [IL-22]). إعداد ثلاثة نسخ متماثلة على الأقل لكل مجموعة.
- إضافة EdU إلى وسيط ENR لإعداد متوسط EdU بتركيز 50 ميكرومتر. أضف 600 ميكرولتر من متوسط EdU إلى كل بئر واحتضان لساعتين في حاضنة 37 درجة مئوية. تعيين بئر واحد من enteroids دون علاج EdU كتحكم سلبي للطرح الخلفية.
- حصاد enteroids من مصفوفة غشاء الطابق السفلي
- استخدام وحدة تحكم ماصة لاستنشاق متوسط EdU وغسل 1x مع DPBS. إضافة 1 مل من DPBS.
- استخدام P1000 تلميح ماصة وماصة صعودا وهبوطا حتى لا تبقى قطع مصفوفة غشاء الطابق السفلي الصلبة. نقل إلى أنبوب 15 مل وتدور أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة. تجاهل supernatant.
- إضافة 500 ميكرولتر من إنزيمات الانفصام الخلوي(جدول المواد)واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استخدام P200 تلميح ماصة وماصة صعودا وهبوطا لكسر enteroids إلى خلايا واحدة.
- إضافة 3 مل من متوسط DMEM التي تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) وماصة مرارا وتكرارا مع طرف P1000 ماصة.
- تدور أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة واستنشاق الوسط supernatant. إعادة تعليق الخلايا مع 1 مل من DPBS.
- تثبيت ونفاذ الخلايا
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل، تدور أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة، وتجاهل supernatant.
- إعادة تعليق الخلايا مع 1 مل من 4٪ paraformaldehyde (PFA)، وإصلاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، وتدور أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة. تستنشق مع تلميح ماصة، وغسل 1x مع DPBS، وتدور لأسفل لإزالة supernatant.
- إعادة تعليق الخلايا مع 1 مل من 0.5٪ السطحي غير الأيونية. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
- تدور أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة واستنشاق supernatant. غسل 1x مع DPBS وتدور لأسفل لإزالة supernatant.
- الكشف عن EdU
- إعداد حلول الأسهم لكل مكون مقدما: 1) حل العمل من أزيد اليكسا فلور، 2) حل العمل من 1x EdU العازلة رد فعل، و 3) 10x حل المخزون من المضافة العازلة EdU.
- إعداد 1x EdU المضافة العازلة عن طريق تخفيف حل 10x 1:10 في المياه deionized. إعداد هذا الحل الطازجة.
- إعداد كوكتيل رد الفعل وفقا للجدول 1.
ملاحظة: إضافة المكونات بالترتيب المدرج في الجدول. استخدام كوكتيل رد فعل في غضون 15 دقيقة من التحضير. - أضف 100 ميكرولتر من كوكتيلات التفاعل إلى كل أنبوب 1.5 مل. إعادة تعليق الخلايا، وحماية من الضوء، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
- الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقيقة واستنشاق حل رد الفعل مع تلميح ماصة بلطف.
- إضافة 0.5٪ غير الأيونية السطحي ة المنشدون إلى كل أنبوب لغسل 1x في RT. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقيقة، يستنشق supernatant مع تلميح ماصة بلطف، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من DPBS.
- تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي
- تصفية الخلايا التي أعيد تعليقها مع مصفاة 40 ميكرومتر، ثم جمع الخلايا المصفاة مع أنبوب مخروطي 15 مل. إجراء الكشف عن FACS على الجهاز في أقرب وقت ممكن.
ملاحظة: إذا كانت الظروف محدودة، يجب تخزين العينات الملطخة بالخلايا في الظلام عند درجة حرارة 4 درجة مئوية واختبار التدفق في غضون 3 أيام. - حدد القناة المناسبة (وفقًا لنوع Alexa Fluor azide في مجموعة EdU ؛ هنا ، القناة الحمراء) والجهد (هنا ، ~ 150-350 V) لتحليل قياس التدفق الخلوي.
- استراتيجية جاتينغ
- رسم FSC-A (المحور س) مقابل SSC-A (ص محور) مؤامرة الرسم الزائفة اللون وتوزيع معظم الخلايا إلى النطاق المرئي للخريطة نقطة عن طريق ضبط الجهد. حدد عدد الخلايا (R1) واستبعد حطام الخلية في الزاوية اليسرى السفلية.
- من عدد الخلايا R1، إنشاء FSC-A (x-محور) مقابل. FSC-H (y-axis) رسم لون زائف، وتعيين البوابة لتحديد خلايا مفردة (R2) لاستبعاد كتل الخلايا.
- من مجموعة الخلايا R2، حدد شدة الفلورية (المحور س) مقابل. رقم الخلية (ص محور) مؤامرة، واستخدام عنصر التحكم السلبي لتعيين البوابة. منطقة إشارة الفلورسنت هي منطقة خلية إيجابية (R3). قارن نسبة الخلايا الإيجابية EdU (R3) بين المجموعات التجريبية ومجموعات التحكم.
- تصفية الخلايا التي أعيد تعليقها مع مصفاة 40 ميكرومتر، ثم جمع الخلايا المصفاة مع أنبوب مخروطي 15 مل. إجراء الكشف عن FACS على الجهاز في أقرب وقت ممكن.
3. تدفق تحليل الخلايا من الخلايا PI إيجابية في Enteroids
ملاحظة: يوضح الشكل 2 سير العمل لتحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا الإيجابية PI في enteroids.
- احتضان الخلايا المعوية مع PI
- تنمو enteroids من الخطوة 1.2.4 لمدة 5-7 أيام. enteroids مرور في لوحة جديدة 24 جيدا في نسبة تقسيم 1:2. إضافة 600 ميكرولتر من ENR المتوسطة إلى كل بئر. احتضان enteroids لمدة 4-5 أيام في حاضنة 37 درجة مئوية.
- تعيين مجموعة التحكم (غير المعالجة) والمجموعة التجريبية (IL-22 المعالجة)، باستخدام ثلاثة نسخ متماثلة على الأقل لكل مجموعة.
- أضف PI إلى وسيط ENR لإعداد وسيط PI بتركيز 3 ميكرومتر.
- أضف 600 ميكرولتر من PI المتوسط إلى كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية. تعيين بئر واحد من enteroids دون علاج PI كتحكم سلبي للطرح الخلفية.
- دخول الحصاد من مصفوفة غشاء الطابق السفلي بعد الخطوات 2.2.1−2.2.5.
- تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي
- تصفية الخلايا التي أعيد تعليقها مع مصفاة 40 ميكرومتر وجمع الخلايا المصفاة مع أنبوب مخروطي 15 مل.
- إجراء الكشف عن FACS على الجهاز في أقرب وقت ممكن.
ملاحظة: إذا كانت الظروف محدودة، يجب تخزين العينات الملطخة بالخلايا في الظلام عند درجة حرارة 4 درجة مئوية واختبار التدفق في غضون 3 أيام. - حدد القناة المناسبة (هنا، القناة الحمراء) والجهد (هنا، ~ 150-350 V) لتحليل التدفق الخلوي.
- استخدم نفس استراتيجية الجاتينغ كما هو موضح في القسم 2.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم عزل السراديب المعوية الصغيرة واستزراعها كأجهزة تدخل في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. بدأت Enteroids لتشكيل براعم 2 أيام بعد العزلة. في اليوم 6 ، كان لدى enteroids العديد من البراعم مع الكثير من الحطام (الخلايا الميتة) في التجويف. Enteroids كانت جاهزة للمرور في هذه المرحلة(الشكل 3).
وقد أظهرت العديد من الدراسات أن السيتوكينات الالتهابية ضرورية للحفاظ على التوازن الظهاري المعوي. يرتبط التعبير غير الطبيعي للسيتوكينات الالتهابية ارتباطًا وثيقًا بحدوث أمراض الأمعاء الالتهابية11. على سبيل المثال، أظهرت دراستنا السابقة أن IL-22 يعزز انتشار الخلايا المضخمة العابرة ولكنه يستنفد أيضًا Lgr5+ الخلايا الجذعية12.
عولجت الدوّانات المعوية بـ IL-22 لمدة 3 أيام، وبعد ذلك تم تسمية الحمض النووي الاصطناعي بـ EdU للإشارة إلى انتشار الخلايا. IL-22-المعالجة enteroids عرض عدد متزايد من EdU+ الخلايا(الشكل 4A). IL-22 زيادة الخلايا المنتشرة من 40.1٪ إلى 83.5٪ كما تم تحليلها من قبل قياس التدفق الخلوي(الشكل 4B). IL-22 العلاج أيضا زيادة موت الخلايا في enteroids، المشار إلى ذلك من قبل تلطيخ PI(الشكل 5A). IL-22 زيادة الخلايا الميتة من 4.9٪ إلى 16.2٪ كما تم تحليلها من قبل قياس التدفق الخلوي(الشكل 5B).
الشكل 1: مخطط سير العمل لتحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا الإيجابية EdU في enteroids. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط سير العمل لتحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا الإيجابية PI في enteroids. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور برايتفيلد من enteroids في 2، 4، و 6 أيام بعد عزل التشفير. مقياس شريط = 100 ميكرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: IL-22 يزيد انتشار enteroids. (أ)تم استزراع Enteroids في وسط بدون أو مع IL-22 (5 نانوغرام /مل) لمدة 3 أيام واحتضانها مع EdU (أحمر) لشريط مقياس 1 h. = 100 ميكرومتر. (ب)تدفق بيانات القياس الخلوي من enteroids المستزرعة دون (يسار) أو مع (يمين) IL-22. البيانات هي ممثلة لثلاث تجارب منفصلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: IL-22 يعزز موت الخلايا في enteroids. (أ)تم استزراع Enteroids في الوسط بدون أو مع IL-22 (5 نانوغرام / مل) لمدة 3 أيام وملطخة بيوديد البروبيديوم (أحمر). مقياس شريط = 100 ميكرون. (ب)تدفق بيانات القياس الخلوي من enteroids المستزرعة دون (يسار) أو مع (يمين) IL-22. البيانات هي ممثلة لثلاث تجارب منفصلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكونات التفاعل | عدد الآبار من 24 بئرا | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x العازلة رد الفعل | 86 ميكرولتر | 172 ميكرولتر | 430 ميكرولتر | 860 ميكرولتر | 1.72 ميكرولتر | 4.3 ميكرولتر |
| كوسو4 | 4 ميكرولتر | 8 ميكرولتر | 20 ميكرولتر | 40 ميكرولتر | 80 ميكرولتر | 200 ميكرولتر |
| أليكسا فلور أزيد | 0.25 ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | 1.25 ميكرولتر | 2.5 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | 12.5 ميكرولتر |
| مضافة المخزن المؤقت لتفاعل | 10 ميكرولتر | 20 ميكرولتر | 50 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 200 ميكرولتر | 500 ميكرولتر |
| إجمالي الحجم | 100 ميكرولتر | 200 ميكرولتر | 500 ميكرولتر | 1 ميكرولتر | 2 ميكرولتر | 5 ميكرولتر |
| ملاحظة: إضافة المكونات بالترتيب المدرج في الجدول. | ||||||
الجدول 1: كوكتيل رد فعل EdU.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة لثقافة enteroids في المختبر والقياس الكمي للخلايا EdU- و PI إيجابية في enteroids عن طريق قياس التدفق الخلوي. وهناك عدة مزايا لهذه الاستراتيجية. أولاً، يتم استخدام وضع العلامات EdU للكشف عن الخلايا المنتشرة في enteroids. بالمقارنة مع اختبار BrdU التقليدي ، فإن طريقة وضع العلامات EdU أسرع وأكثر حساسية وأكثر دقة. EdU يشبه إلى حد كبير الثيامين (T) ، الذي يحل محل الثيامين في تخليق الحمض النووي أثناء انقسام الخلايا. بالمقارنة مع الأجسام المضادة BrdU ، يسهل نشر EdU في الخلية ، ولا يتطلب اكتشاف EdU تلدينام الحمض النووي ورد فعل مضاد للأجسام المضادة. ثانيا، تحليل التدفق الخلوي يمكن بسرعة وبدقة تحديد الخلايا المنتشرة (EdU+) والميتة (PI+)في enteroids.
لتنفيذ الإجراء بأكمله بنجاح، هناك جوانب حاسمة يجب النظر فيها. أولا، من المهم لenteroids الثقافة في ظل ظروف كافية. يجب أن تحتوي اللتدخل المزروعة جيدًا على الكثير من البراعم ، والتي تحتوي على خلايا التكاثر. ثانيا، من المهم تقسيم enteroids في الوقت المناسب. الحطام المتراكم في تجويف يحتوي على خلايا ميتة، والتي يمكن أن تكون ملطخة مع PI. وهذا ضار لتحليل قياس التدفق الخلوي التالي. ثالثاً، بسبب الخطوات المتعددة (أي تلطيخ الخلايا، تثبيت الخلايا، تمزق الغشاء، والطرد المركزي)، يمكن فقدان الخلايا بسهولة أثناء الإجراء. وبالتالي ، من المهم جمع عدد كاف من enteroids. من المهم الجمع بين 2-3 آبار (في 24 بئراً) من الأورام المعوية قبل التثبيت. وأخيراً، من الأهمية بمكان إضافة المكونات إلى المخزن المؤقت من أجل الكشف عن EdU، وإلا فإن رد الفعل لن يستمر على النحو الأمثل.
باختصار ، البروتوكول تفاصيل خطوات لزراعة enteroids الماوس في المختبر والقياس الكمي للخلايا المنتشرة والميتة عن طريق قياس التدفق الخلوي. Enteroids هي أدوات مفيدة لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية العلاجية. هذا البروتوكول يساعد على استكشاف آثار السيتوكينات الالتهابية، ومسببات الأمراض، والمخدرات على انتشار الخلايا والبقاء على قيد الحياة الخلية في نماذج الثقافة المعوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31971062، 31900326، و 31601022)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20190043، BK20180838)، صندوق البحوث من مختبر الدولة الرئيسية للتكنولوجيا الحيوية الصيدلانية، جامعة نانجينغ (KF-GN-202004). مؤسسة العلوم الطبيعية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو في الصين (19KJB320003)، وبرنامج سبل العيش والتكنولوجيا في مدينة سوتشو (SYS2019030)، وبرنامج الابتكار البحثي لخريجي الجامعات في مقاطعة جيانغسو (KYCX19-1981) . ويدعم هذا العمل أيضا تانغ الباحث من جامعة سوهو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
