Præsenteret her er en protokol til isolering af mus hepatocytter fra voksne mus lever ved hjælp af en modificeret kollagenase perfusion teknik. Også beskrevet er den langsigtede kultur af hepatocytter i en 3D kollagen sandwich indstilling samt immunolabeling af cytoskelet komponenter til at studere galde canaliculært dannelse og dens respons på behandling.
Hepatocytter er de centrale celler i leveren er ansvarlige for sin metaboliske funktion. Som sådan danner de et unikt polariseret epitel, hvor to eller flere hepatocytter bidrager med apikale membraner til dannelse af et galde canaliculært netværk, hvorigennem galde udskilles. Hepatocyt polarisering er afgørende for korrekt canaliculært dannelse og afhænger af interaktioner mellem hepatocyt cytoskelet, celle-celle kontakter, og den ekstracellulære matrix. In vitro undersøgelser af hepatocyt cytoskelet involvering i eller dannelse og dens reaktion på patologiske situationer er handicappet af manglen på cellekultur, som vil nøje ligne eller netværk struktur in vivo. Beskrevet her er en protokol til isolering af mus hepatocytter fra voksne mus leveren ved hjælp af en modificeret kollagenase perfusion teknik. Også beskrevet er produktion af kultur i en 3D kollagen sandwich indstilling, som anvendes til immunolabeling af cytoskelet komponenter til at studere galde canaliculært dannelse og dens respons på behandlinger in vitro. Det er vist, at hepatocyt 3D kollagen sandwich kulturer reagerer på behandlinger med toksiner (ethanol) eller actin cytoskelet ændre narkotika (f. eks, blebbistatin) og tjene som et værdifuldt værktøj til in vitro-undersøgelser af galde eller dannelse og funktion.
Hepatocytter, de centrale cellulære strukturer i leveren, der er ansvarlige for dens metaboliske funktioner, er unikt polariserede epiteliale celler. Deres polarisering, der optræder i pattedyr kort efter fødslen, resulterer i dannelse af det Biliære canaliculære netværk og er afgørende for korrekt galde sekretion. Apical membraner af hepatocytter kollektivt danner galde canaliculi, mens basal membraner forbliver i kontakt med endotelet af sinusoids. Tabet af hepatocyt polarisering fører til omfordeling af galde transportører og resulterer i patologiske processer forbundet med galde retention i leveren (dvs. kolestase).
Etablering og vedligeholdelse af hepatocyt polarisering og udvikling af galde eller indebærer komplekse mekanismer. De underliggende processer afhænger af det kollektive samspil mellem cyskelettet hepatocyt, celle celle kontakter og interaktioner med den ekstracellulære matrix1. Den hepatocyt cytoskelet består af alle tre filament netværk, actin cytoskelet, microtubuler, og mellemliggende filamenter, som giver strukturel støtte til canaliculært dannelse. Den differentiale rolle af cytoskelet komponenter i regenerering og vedligeholdelse af galde canaliculært netværk er tidligere blevet illustreret in vitro i 3D kollagen-sandwich hepatocyt kulturer2.
Actin mikrofilamenter og microtubuler er vigtige i de indledende stadier af hepatocyt membran polarisering på stederne for canaliculus generation2. Actin cytoskelet etablerer strukturen og funktionen af galde canaliculi, danner membran-associerede mikrofilamenter og den circumferentielle ring, således støtte den canaliculære arkitektur og indsættelse af actin cytoskelet i stramme og klæber kryds3. Ringen af keratin mellemliggende filamenter uden for actin cytoskelettet stabiliserer yderligere den canaliculære struktur3.
Betydningen af proteiner i hepatocyt supplerende komplekser i organiseringen af galde eller arkitektur er blevet veldokumenteret i flere knock-out musemodeller, som viser forvrænget eller i mus mangler både stramme og/eller klæber supplerende proteiner4,5,6. Det har vist sig, at udeladelsen af klæber Junction protein α-køreledningen fører til disorganisering af hepatocyt actin cytoskelet, dilatation af galde canaliculære lumen, utætte stramme vejkryds og effektivt til en kolestatisk fænotype4. Desuden har in vitro-undersøgelser vist betydningen af klæber Junction komponenter E-cadherin og β-køreledning i remodeling af hepatocellulære apikale lumen og protein handel7.
Påfaldende, ablation af cytoskelet binding protein plectin, som er den største Keratin organisator, har afsløret fænotyper sammenlignelige med dem, der er forbundet med actin cytoskelet8. Dette antyder en afgørende rolle for Keratin mellemliggende filamenter i støtte af canaliculært struktur. In vitro undersøgelser udnytter 3D hepatocyt kollagen sandwich har også vist betydningen af den amp-aktiverede protein kinase og dens upstream aktivator LKB1 i galde canaliculært netværk dannelse9. Disse fund blev derefter yderligere bekræftet af de efterfølgende in vivo-undersøgelser10,11. Således, det er blevet klart, at in vitro-undersøgelser er nødvendige for at fremme forståelsen af signalering processer involveret i etableringen af hepatocyt polarisering, korrekt canaliculært netværk dannelse, og galde sekretion.
En stor udfordring i at studere processer i forbindelse med galde canaliculær dannelse og dens reaktion på patologiske situationer in vitro er ved hjælp af en cellekultur betingelser, der nøje ligner situationen i vivo12. Frisk isolerede primære hepatocytter er ikke polariseret; således mister de deres funktion, morfologi, og funktionelle galde eller i 2D kulturforhold (f. eks ændringer i genregulering, polarisering, og de-differentiering13,14,15). På trods af dette faktum, frisk isolerede hepatocytter mest nøje afspejler karakteren af leveren in vivo, i modsætning til lever-afledte cellelinjer16. Selv om de har været brugt i fortiden, udødeliggjort cellelinjer ikke udøver epitelial-lignende karakteristisk morfologi af hepatocytter, og galde canaliculært lumen dannet af disse celler ligne leveren eller dårligt7. For nylig, 3D-kulturer af primære hepatocytter, fra både mus og rotter, er blevet et nyttigt redskab til at undersøge processer involveret i galde canaliculært netværk dannelse in vitro9. Primære hepatocytter, der dyrkes mellem to lag af kollagen (omtalt som en 3D kollagen sandwich kultur) kan repolarisere i flere dage. På grund af høje tekniske krav, der kræves, når dyrkning mus hepatocytter i 3D kollagen sandwich, her præsenterer vi en kompleks protokol for at isolere, dyrke, og at immunolabel mus hepatocytter indlejret i 3D kollagen sandwich for at karakterisere inddragelsen af cytoskelet komponenter under galde canaliculært dannelse.
Brugen af mus primære hepatocyt kulturer er vigtigt for in vitro-undersøgelser for bedre at forstå signalering processer involveret i etableringen af hepatocyt polarisering, korrekt canaliculært struktur dannelse, og galde sekretion. Udfordringerne i isolation og langsigtet kultur af mus primære hepatocytter i 2D kultur har drevet opfindelsen af flere tekniske tilgange med øget isolation effektivitet og levetid af isolerede celler, hver med flere fordele og Ulemper. Det er nu almindeligt accepteret, at 2D-kulturer af primære hepatocytter efterligner kun begrænset antal attributter af leveren biologi for en kort periode. Således 3D dyrkning i en kollagen sandwich arrangement er bredt erstatter de 2D betingelser, især når fokuseret på funktion af cytoskelet i leveren biologi (f. eks, giftige narkotika effekter eller rumlig organisering af galde transport).
Siden 1980 ‘ erne, flere protokoller for isolering af mus hepatocytter med forskellige modifikationer er blevet beskrevet. Den to-trins kollagenase perfusion tilgang er blevet meget udbredt i mange laboratorier. Tilføjelsen af gradient centrifugering i isolations protokollen tillader fjernelse af døde celler19,20 og øger antallet af levedygtige celler (her rutinemæssigt til ~ 93%). Selv om dette trin udvider behandlingstiden for cellerne og resulterer i reducerede cellenumre21, ses dette trin som nødvendigt i 3D kollagen sandwich kulturen for korrekt galde canaliculært netværksdannelse. Derudover er det vigtigere at fortsætte hurtigt og præcist under perfusions trin, hvilket forkorter den tid, cellerne håndteres.
Andre vigtige faktorer, der øger levedygtigheden af cellerne og deres evne til at danne canaliculært netværk i 3D er brugen af frisk tilberedte opløsninger og undgåelse af bobler under perfusion. Derfor bør opløsninger være forberedt på dagen for mus hepatocyt isolation, og den peristaltiske pumpe og slanger skal kontrolleres, når de skifter opløsninger. Hvis protokollen følges nøje, bør isolering af primære hepatocytter lykkes med et højt udbytte af levedygtige celler.
En anden kritisk faktor i langsigtede 3D hepatocyt kultur er den oprindelige kilde til primære hepatocytter, der anvendes. Det er vigtigt at bruge dyr, der er 8 – 12 uger gamle, der tjener som optimale donorer af hepatocytter. Brugen af hepatocytter fra ældre dyr var ikke så vellykket i langsigtet kultur, som disse hepatocytter ændrede deres morfologi oftere, depolariseret, og ophørte med at danne canaliculært netværk. Også plating hepatocytter på korrekt neutraliseret kollagen gel dannet af relativt stærkt koncentreret opløsning er et afgørende skridt. I de fleste protokoller anvendes der koncentrationer på ca. 1 mg/mL. Efter mange optimeringer er en koncentration på 1,5 mg/mL optimal til langvarig hepatocyt dyrkning og giver meget organiserede hepatocytter med dannet galde canaliculi.
Denne nemme at følge protokol giver langsigtet dyrkning af primære mus hepatocytter. Repræsentative resultater demonstrere et bredt spektrum af brug for 3D kulturperler primær mus hepatocytter når man studerer rollen af cytoskelet komponenter i galde eller dannelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Den Tjekkiske Republiks tilskuds agentur (18-02699S); Den Tjekkiske Republiks sundhedsministeriums tilskuds agentur (17-31538A) det institutionelle forskningsprojekt under det tjekkiske Videnskabsakademi (RVO 68378050) og MEYS CR-projekter (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ. 1,05/2.1.00/19.0395 og OP RDE CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775); Charles University (Personal stipendium til K.K.), og et operationelt program Prag-konkurrenceevne projekt (CZ. 2.16/3.1.00/21547). Vi anerkender den lette mikroskopi kerne facilitet, IMG CAS, Prag, Tjekkiet (støttet Meys CR projekter LM2015062 og LO1419) for støtte med mikroskopi Imaging præsenteret.
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |