Presenteras här är ett protokoll för isolering av mus hepatocyter från vuxna mus lever med hjälp av en modifierad kollagenase perfusion teknik. Beskrivs också är den långsiktiga kulturen av hepatocyter i en 3D Collagen Sandwich inställning samt immunolabeling av cytoskeletala komponenter för att studera galla canaliculära bildandet och dess svar på behandling.
Hepatocyter är de centrala cellerna i levern som ansvarar för dess metaboliska funktion. Som sådan, de bildar ett unikt polariserat epitel, där två eller fler hepatocyter bidra apikala membran att bilda en galla canaliculära nätverk genom vilken galla utsöndras. Hepatocyte polarisering är viktigt för korrekt canaliculära bildandet och beror på samspelet mellan hepatocyte cytoskeleton, cell-Cellkontakter, och den extracellulära matrisen. In vitro-studier av hepatocyte cytoskelettet inblandning i canaliculi formation och dess svar på patologiska situationer är handikappade av bristen på cellkultur, som skulle nära likna Canaliculi nätverksstruktur in vivo. Beskrivs här är ett protokoll för isolering av mus hepatocyter från vuxna mus levern med hjälp av en modifierad kollagenase perfusion teknik. Också beskrivs är produktionen av kulturen i en 3D Collagen Sandwich inställning, som används för immunolabeling av cytoskeletala komponenter för att studera galla kanalikulär formation och dess svar på behandlingar in vitro-. Det visas att hepatocyte 3D Collagen Sandwich kulturer reagera på behandlingar med toxiner (etanol) eller aktin cytoskelettet förändra droger (t. ex., blebbistatin) och fungera som ett värdefullt verktyg för in vitro-studier av galla Canaliculi formation och funktion.
Hepatocyter, den centrala cellulära strukturer i levern som är ansvariga för dess metaboliska funktioner, är unikt polariserade epitelceller. Deras polarisering, som förekommer i däggdjur strax efter födseln, resulterar i bildandet av gallvägarna canaliculära nätverk och är viktigt för korrekt galla sekretion. Apikala membran av hepatocyter kollektivt bildar galla Canaliculi, medan basalmembran kvar i kontakt med endotel av sinusoids. Förlusten av hepatocyte polarisering leder till omfördelning av galla transportörer och resulterar i patologiska processer i samband med galla retention i levern (i.e., kolestas).
Etablering och underhåll av hepatocyte polarisering och utvecklingen av galla Canaliculi medför komplexa mekanismer. De bakomliggande processerna är beroende av ett kollektivt samspel mellan hepatocyternas cytoskelett, cell cells kontakter och interaktioner med den extracellulära matrisen1. Den hepatocyte cytoskelettet består av alla tre filament nätverk, den aktin cytoskelettet, microtubules, och mellanliggande glödtrådar, som ger strukturellt stöd för kanalikulär formation. Den differentiella roll cytoskelett komponenter i förnyelse och underhåll av galla canaliculära nätverk har tidigare illustrerats in vitro i 3D kollagen-Sandwich hepatocyte kulturer2.
Actin Microfilaments och mikrotubuli är viktiga under de inledande stadierna av hepatocyte membran polarisering vid platserna för canaliculus generation2. Den aktin cytoskelettet etablerar struktur och funktion av galla Canaliculi, bildar membran-associerade microfilament och omkretsriktningen ringen, vilket stöder canaliculära arkitektur och sätta in aktin cytoskelettet i snäva och anhängare korsningar3. Ringen av keratin mellanliggande glödtrådar utanför aktin cytoskelettet ytterligare stabiliserar canaliculära struktur3.
Vikten av proteiner i hepatocyte av komplex i organisationen av galla Canaliculi arkitektur har varit väldokumenterade i flera knock-out musmodeller, som visar förvrängd Canaliculi hos möss som saknar både snäva och/eller anhängare av proteiner4,5,6. Strykningen av adherens Junction protein α-catenin har visat sig leda till oordning av hepatocyte aktin cytoskeleton, dilatation av galla canaliculära lumen, läckande snäva korsningar, och effektivt till en kolestatisk fenotyp4. Dessutom, in vitro-studier har visat vikten av adherens knutpunkt komponenter E-cadherin och β-catenin i remodeling av hepatocellulära apikala lumen och protein trafficking7.
Slående, ablation av cytoskelettet crosslinking protein plectin, som är den stora keratin arrangören, har avslöjat fenotyper jämförbara med dem som är kopplade till aktin cytoskelettet8. Detta tyder på en kritisk roll keratin mellanliggande glödtrådar i stöd av canaliculära struktur. In vitro-studier som utnyttjar 3D hepatocyte kollagen smörgåsar har också visat vikten av amp-aktiverat proteinkinas och dess uppströms Activator LKB1 i galla canaliculära nätverk formation9. Dessa fynd bekräftades sedan ytterligare genom efterföljande in vivo-studier10,11. Sålunda, det har blivit klart att in vitro-studier är nödvändiga för att främja förståelsen av signalering processer som deltar i inrättandet av hepatocyte polarisering, ordentlig canaliculära nätverk bildas, och galla sekretion.
En stor utmaning i att studera processer i samband med galla kanalikulär formation och dess svar på patologiska situationer in vitro använder en cell odlingsförhållanden som liknar situationen i vivo12. Nyligen isolerade primära hepatocyter är inte polariserade; Sålunda, de förlorar sin funktion, morfologi, och funktionella galla Canaliculi i 2D odlingsförhållanden (t. ex., förändringar i genreglering, polarisering, och de-differentiering13,14,15). Trots detta faktum, nyligen isolerade hepatocyter närmast återspeglar arten av levern in vivo, till skillnad från leverframställda cellinjer16. Även om de har använts i det förflutna, förevigade cellinjer inte utövar epitelial-liknande karakteristiska morfologi av hepatocyter, och galla canaliculära lumen bildas av dessa celler likna levern Canaliculi dåligt7. Nyligen, 3D-kulturer av primära hepatocyter, från både möss och råttor, har blivit ett användbart verktyg för att undersöka processer som deltar i galla canaliculära nätverk bildas in vitro-9. Primära hepatocyter odlade mellan två skikt av kollagen (kallad en 3D Collagen Sandwich kultur) kan repolarisera i flera dagar. På grund av höga tekniska krav som krävs när odla mus hepatocyter i 3D kollagen smörgåsar, här presenterar vi ett komplext protokoll för att isolera, att odla, och att immunolabel mus hepatocyter inbäddade i 3D kollagen smörgåsar för att karakterisera medverkan av cytoskeletala komponenter under galla kanalikulär formation.
Användningen av mus primära hepatocyte kulturer är viktigt för in vitro-studier för att bättre förstå signalering processer som deltar i inrättandet av hepatocyte polarisering, ordentlig canaliculära struktur formation, och galla sekretion. Utmaningarna i isolering och långsiktig kultur av mus primära hepatocyter i 2D-kulturen har drivit uppfinningen av flera tekniska metoder med ökad isolering effektivitet och livslängd av isolerade celler, var och en med flera fördelar och Nackdelar. Det är nu allmänt accepterat att 2D-kulturer av primära hepatocyter härma endast begränsat antal attribut av lever bio logi under en kort tidsperiod. Sålunda, 3D-odling i ett kollagen Sandwich arrangemang är allmänt ersätter 2D villkor, särskilt när fokuserade på funktionen av cytoskelettet i lever bio Logi (t. ex., toxiska effekter på läkemedlet eller rumslig organisation av galla transport).
Sedan 1980-talet har flera protokoll för isolering av mus hepatocyter med olika modifieringar beskrivits. Den tvåstegs kollagenas från perfusion tillvägagångssätt har blivit allmänt används i många laboratorier. Tillsatsen av gradientcentrifugering i isolerings protokollet tillåter avlägsnande av döda celler19,20 och ökar signifikant antalet livskraftiga celler (här, rutinmässigt till ~ 93%). Även om detta steg förlänger hanteringstiden för cellerna och resulterar i reducerade cell nummer21, detta steg ses som nödvändigt i 3D Collagen Sandwich kulturen för korrekt galla canaliculära nätverk bildas. Dessutom är det viktigare att gå vidare snabbt och korrekt under perfusion steg, vilket förkortar tiden som cellerna hanteras.
Andra viktiga faktorer som ökar livskraften hos cellerna och deras förmåga att bilda canaliculära nätverk i 3D är användningen av nyberedda lösningar och undvikande av bubblor under perfusion. Därför, lösningar bör förberedas på dagen för mus hepatocyte isolering, och peristaltiska pumpen och slangar bör kontrolleras vid byte av lösningar. Om protokollet följs noggrant, bör isoleringen av primära hepatocyter vara framgångsrik med en hög avkastning av livskraftiga celler.
En annan kritisk faktor i långsiktig 3D hepatocyte kultur är den initiala källan till primära hepatocyter som används. Det är viktigt att använda djur som är 8 – 12 veckor gamla, som fungerar som optimala givare av hepatocyter. Användningen av hepatocyter från äldre djur var inte lika framgångsrik i långsiktig kultur, eftersom dessa hepatocyter förändrat deras morfologi oftare, depolariserade, och upphörde att bilda canaliculära nätverk. Också, plätering hepatocyter på korrekt neutraliserad kollagen gel bildas från relativt mycket koncentrerad lösning är ett viktigt steg. I de flesta protokoll används koncentrationer på ca 1 mg/mL. Efter många optimeringar, en koncentration av 1,5 mg/mL är optimal för långsiktig hepatocyte odling och ger mycket organiserade hepatocyter med bildade galla Canaliculi.
Detta lätt att följa protokollet tillåter långsiktig odling av primära mus hepatocyter. Representativa resultat visar ett brett spektrum av användning för 3D odlade primära mus hepatocyter när man studerar rollen av cytoskelett komponenter i galla Canaliculi formation.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Tjeckiens bidrags byrå (18-02699S); Bidrags byrån vid Tjeckiens hälsoministerium (17-31538A); den institutionella forskningsprojekt av tjeckiska vetenskapsakademin (RVO 68378050) och MEYS CR projekt (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ. 1.05/2.1.00/19.0395, och OP RDE CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Charles University (personliga stipendium till KK), och ett operativt program Prag-konkurrenskraft projekt (CZ. 2.16/3.1.00/21547). Vi erkänner ljusmikroskopi Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjeckien (stöds MEYS CR projekt LM2015062 och LO1419) för stöd med mikroskopi Imaging presenteras.
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |