المقدمة هنا هو بروتوكول لعزل الخلايا الكبدية الماوس من كبد الفار الكبار باستخدام تقنيه ترويه المعدلة كولاجيناز. كما يوصف هو ثقافة طويلة الأجل من الخلايا الكبدية في اعداد ساندويتش الكولاجين 3d ، فضلا عن المناعية للمكونات خلوي لدراسة تشكيل الصفراوية كاناليكاجي واستجابتها للعلاج.
الكبد هي الخلايا المركزية للكبد المسؤولة عن وظيفتها الايضيه. علي هذا النحو ، فانها تشكل ظهاره الاستقطاب فريد ، والتي تسهم فيها اثنين أو أكثر من الخلايا الكبدية اغشيه قمي لتشكيل شبكه قنيوي الصفراوية من خلالها يفرز الصفراء. الاستقطاب الكبد أمر ضروري لتشكيل قنيوي الصحيح ويعتمد علي التفاعلات بين cytoskeleton الخلايا الكبدية ، والاتصالات خليه خليه ، ومصفوفة خارج الخلية. في المختبر الدراسات من الخلايا الكبدية مشاركه خلوي في تشكيل كاناليكولي واستجابتها للحالات المرضية ويعوقها عدم وجود ثقافة الخلية ، والتي من شانها ان تشبه بشكل وثيق بنيه شبكه كاناليكولي في الجسم الفيفو. وصف هنا هو بروتوكول لعزل الخلايا الكبدية الماوس من الكبد الفار الكبار باستخدام تقنيه ترويه التحوير المعدلة. كما هو موضح هو إنتاج الثقافة في اعداد ساندويتش الكولاجين 3d ، والذي يستخدم للمناعة من مكونات خلوي لدراسة تشكيل الصفراوية قنيوي واستجابتها للعلاجات في المختبر. ويظهر ان الخلايا الكبدية 3d الكولاجين ساندويتش الثقافات تستجيب للعلاجات مع السموم (الايثانول) أو الاكتين خلوي تغيير المخدرات (علي سبيل المثال ، blebbistatin) وبمثابه أداه قيمه للدراسات في المختبر من تكوين كاناليكولي الصفراوية ووظيفتها.
الخلايا الكبدية ، والهياكل الخلوية المركزية للكبد التي هي المسؤولة عن وظائفها الايضيه ، هي فريدة من نوعها الاستقطاب الظهاريه. الاستقطاب ، والتي تظهر في الثدييات بعد فتره وجيزة من الولادة ، والنتائج في تشكيل شبكه قنيوي الصفراوية وضروري لإفراز الصفراء السليم. الاغشيه apical من الخلايا الكبدية تشكل مجتمعه canaliculi الصفراوية ، في حين تبقي الاغشيه القاعدية في اتصال مع بطانة من السينويدات. يؤدي فقدان استقطاب الخلايا الكبدية إلى أعاده توزيع الناقلات الصفراوية والنتائج في العمليات المرضية المرتبطة باحتباس الصفراء في الكبد (اي ، الركود الصفراوي).
إنشاء وصيانة الاستقطاب الخلايا الكبدية وتطوير كاناليكولي الصفراوية يستتبع أليات معقده. تعتمد العمليات الاساسيه علي التفاعل الجماعي بين خلايا الكبد الخلوية ، واتصالات خلايا الخلية ، والتفاعلات مع المصفوفة الخارجة عن الخلية1. يتكون الخلايا الكبدية من جميع الشبكات خيوط الثلاثة ، و خلوي الاكتين ، الأنابيب الدقيقة ، وخيوط المتوسطة ، والتي توفر الدعم الهيكلي لتشكيل قنيوي. وقد سبق توضيح الدور التفاضلي للمكونات خلوي في تجديد وصيانة الشبكات الصفراوية قنيوي في المختبر في 3d الكولاجين-ساندويتش الكبد الثقافات2.
الخيوط الدقيقة actin والأنابيب الدقيقة هي مهمة خلال المراحل الاوليه من الاستقطاب غشاء الخلايا الكبدية في مواقع الجيل كاناليكولوس2. ال [اكتيتن] يؤسس البنية وعمل من [كنكلولي] صفراويه, يشكل غشاء-يرتبط [ميكروخيوط] والحلقة محيطيه, لذلك يساند الهندسة المعمارية [كنولولار] ويدخل ال [اكتيتن] [سيتوسيتون] داخل مشدودة وملتصقة تقاطعات3. الحلقة من الشعيرات المتوسطة الكيراتين خارج الجهاز الخلوي الأكثر استقرارا هيكل قنيوي3.
وقد تم توثيق اهميه البروتينات في مجمعات الخلايا الكبدية في تنظيم الهندسة المعمارية كاناليكولي الصفراوية بشكل جيد في عده نماذج الماوس تدق الخروج ، والتي تظهر المشوهة كاناليكولي في الفئران التي تفتقر إلى كل من ضيق و/أو تمسك البروتينات الموجبة4،5،6. حذف البروتين تقاطع الملتصقة α-catenin وقد ثبت ان يؤدي إلى فوضي من الخلايا الكبدية الدهنية الخلوية ، وتوسع من شمعه قنيوي الصفراوية ، التقاطعات ضيقه راشح ، وبشكل فعال إلى النمط الظاهري الركودي4. وعلاوة علي ذلك ، أظهرت الدراسات في المختبر اهميه التمسك مكونات تقاطع E-الملتصقون و β-catenin في أعاده عرض التجويف كبديه قمي والبروتين الاتجار7.
لافت للنظر ، والاجتثاث من سيتوكلاتون البروتين المتقاطع plectin ، والذي هو منظم الكيراتين الرئيسية ، وكشفت الأنماط الظاهرية مماثله لتلك المرتبطة بالشبكات الخلويةالثمانية. وهذا يوحي بدور حاسم من خيوط الكيراتين المتوسطة في دعم هيكل كاناليكاجي. في المختبر الدراسات التي تستخدم 3d الكبد الكولاجين السندويشات وأظهرت أيضا اهميه كيناز البروتين المنشط AMP ولها LKB1 المنشط المنبع في تكوين شبكه قنيوي الصفراوية9. بعد ذلك أكدت هذا استنتاجات كان لاحقا في [فيفو] دراسات10,11. التالي ، فقد أصبح من الواضح ان الدراسات في المختبر ضرورية لتعزيز فهم عمليات الإشارات المشاركة في إنشاء الاستقطاب الخلايا الكبدية ، وتشكيل شبكه قنيوي السليم ، وإفراز الصفراء.
ومن التحديات الرئيسية في دراسة العمليات المرتبطة بتكوين الصفراء الصفراوية واستجابتها للحالات المرضية في المختبر استخدام ظروف ثقافة الخلية التي تشبه بشكل وثيق الوضع في الجسم المجري12. الخلايا الكبدية الاوليه المعزولة الطازجة ليست مستقطبه. وهكذا ، فانها تفقد وظيفتها ، المورفولوجية ، والصفراوية الوظيفية كاناليكولي في ظروف الثقافة 2d (علي سبيل المثال ، التغييرات في تنظيم الجينات ، والاستقطاب ، وأزاله التمايز13،14،15). علي الرغم من هذه الحقيقة, الخلايا الكبدية المعزولة الطازجة تعكس بشكل وثيق طبيعة الكبد في الجسم الطبيعي, علي عكس الكبد مشتقه من خطوط الخلايا16. علي الرغم من انها قد استخدمت في الماضي ، وخطوط الخلايا الخلد لا تمارس المورفولوجية مثل الشكل المميز للخلايا الكبدية ، والصفراوية شمعه كاناليكاجي التي تشكلها هذه الخلايا تشبه canalميكولi الكبد سيئه7. في الاونه الاخيره ، أصبحت الثقافات 3d من الخلايا الكبدية الاوليه ، من كل من الفئران والجرذان ، أداه مفيده للتحقيق في العمليات التي تنطوي علي تكوين شبكه قنيوي الصفراوية في المختبر9. يمكن للخلايا الكبدية الاوليه المستزرعة بين طبقتين من الكولاجين (يشار اليها باسم ثقافة ساندويتش الكولاجين ثلاثي الابعاد) ان تعيد الاستقطاب في عده أيام. بسبب الطلبات التقنية العالية المطلوبة عند زراعه الخلايا الكبدية الماوس في السندويشات الكولاجين 3d ، هنا نقدم بروتوكول معقده لعزل ، للزراعة ، والخلايا الكبدية الماوس المناعية جزءا لا يتجزا من السندويشات الكولاجين 3d من أجل توصيف مشاركه مكونات خلوي خلال تشكيل قنيوي الصفراوية.
استخدام الماوس الثقافات الكبدية الاساسيه الهامه للدراسات في المختبر لفهم أفضل عمليات الإشارات المشاركة في إنشاء الاستقطاب الكبد, تشكيل هيكل قنيوي السليم, وإفراز الصفراء. وقد دفعت التحديات في العزلة وثقافة طويلة الأجل من الخلايا الكبدية الاوليه الماوس في الثقافة 2D اختراع العديد من النهج التقنية مع زيادة العزلة الاستئجار وطول العمر من الخلايا المعزولة ، ولكل منها العديد من المزايا عيوب. ومن المقبول علي نطاق واسع الآن ان الثقافات 2D من الخلايا الكبدية الاوليه تقليد عدد محدود فقط من سمات بيولوجيا الكبد لفتره قصيرة من الزمن. وهكذا ، زراعه 3d في ترتيب ساندويتش الكولاجين علي نطاق واسع لتحل محل الظروف 2d ، وخاصه عندما تركز علي وظيفة خلوي في بيولوجيا الكبد (علي سبيل المثال ، اثار المخدرات السامة أو التنظيم المكاني للنقل الصفراوية).
منذ 1980s ، وقد وصفت عده بروتوكولات لعزل خلايا الكبد الماوس مع مختلف التعديلات. وقد أصبح نهج المزج بين الخطوتين الثنائية الاتجاه يستخدم علي نطاق واسع في العديد من المختبرات. أضافه طرد التدرج في بروتوكول العزل يسمح بازاله الخلايا الميتة19،20 ويزيد بشكل كبير من عدد الخلايا القابلة للحياة (هنا ، بشكل روتيني إلى ~ 93 ٪). علي الرغم من ان هذه الخطوة تمتد وقت المناولة من الخلايا والنتائج في أرقام الخلايا المنخفضة21، وينظر إلى هذه الخطوة كما هو ضروري في ثقافة ساندويتش الكولاجين 3d لتشكيل شبكه قنيوي السليم. بالاضافه إلى ذلك ، فمن الأكثر اهميه للمضي قدما بسرعة وبدقه اثناء الخطوات ترويه ، الذي يقصر الوقت يتم التعامل مع الخلايا.
العوامل الهامه الأخرى التي تزيد من صلاحيه الخلايا وقدرتها علي تشكيل شبكات قنيوي في 3d هو استخدام الحلول الطازجة وتجنب فقاعات خلال perfusion. ولذلك ، يجب اعداد الحلول في يوم عزل الخلايا الكبدية الفاره ، ويجب فحص المضخة التمعجيه والأنابيب عند تغيير الحلول. إذا تم اتباع البروتوكول عن كثب ، يجب ان تكون عزله الخلايا الكبدية الاوليه ناجحه مع الغلة العالية للخلايا قابله للحياة.
وهناك عامل حاسم آخر في ثقافة الخلايا الكبدية ثلاثية الابعاد الطويلة الأجل هو المصدر الاولي للخلايا الكبدية الاوليه التي يتم استخدامها. من المهم استخدام الحيوانية التي هي 8-12 أسابيع من العمر ، والتي تخدم كمتبرعين الأمثل من الخلايا الكبدية. استخدام خلايا الكبد من الكائنات القديمة لم يكن ناجحا في الثقافة علي المدى الطويل, كما ان هذه الخلايا الكبدية غيرت المورفولوجية في كثير من الأحيان, الاستقطاب, وتوقفت عن تشكيل شبكات قنيوي. أيضا ، الخلايا الكبدية الطلاء علي بشكل صحيح تحييد هلام الكولاجين التي تشكلت من حل مركزه للغاية نسبيا هو خطوه حيوية. في معظم البروتوكولات ، يتم استخدام تركيزات حوالي 1 مغ/مل. بعد العديد من التحسينات, تركيز 1.5 مغ/مل هو الأمثل لزراعه الخلايا الكبدية علي المدى الطويل ويوفر الخلايا الكبدية المنظمة للغاية مع canaliculi الصفراوية المشكلة.
هذا البروتوكول سهله المتابعة يسمح للزراعة طويلة الأجل من خلايا الكبد الماوس الاساسيه. تظهر النتائج التمثيلية طيفا واسعا من الاستخدام لخلايا الكبد الاساسيه المثقفة ثلاثية الابعاد عند دراسة دور مكونات خلوي في تشكيل كاناليكولي الصفراوية.
The authors have nothing to disclose.
وقد حظي هذا العمل بدعم وكاله المنح التابعة للجمهورية التشيكية (02699S) ؛ وكاله المنح التابعة لوزارة الصحة في الجمهورية التشيكية (31538A) ؛ مشروع البحوث المؤسسية للاكاديميه التشيكية للعلوم (RVO 68378050) و MEYS CR المشاريع (LQ1604 NPU II ، LTC17063 ، LM2015040 ، OP RDI CZ. 1.05/2.1.00/19.0395 ، و OP RVO CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) ؛ جامعه تشارلز (الراتب الشخصي لk.k.) ، وبرنامج تشغيلي براغ-مشروع القدرة التنافسية (CZ. 2.16/3.1.00/21547). ونحن نعترف الخفيفة المجهر الاساسيه مرفق ، IMG CAS ، براغ ، جمهوريه التشيك (دعم MEYS CR المشاريع LM2015062 و LO1419) للحصول علي الدعم مع التصوير المجهري قدم.
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |