Summary
Présenté ici est un protocole pour l'isolement des hépatocytes de souris des foies adultes de souris utilisant une technique modifiée de perfusion de collagène. On décrit également la culture à long terme des hépatocytes dans un arrangement 3D de sandwich de collagène aussi bien que l'immunolabeling des composants cytosquelettiques pour étudier la formation canaliculaire biliaire et sa réponse au traitement.
Abstract
Les hépatocytes sont les cellules centrales du foie responsables de sa fonction métabolique. En tant que tels, ils forment un épithélium polarisé unique, dans lequel deux hépatocytes ou plus contribuent membranes apicales pour former un réseau canaliculaire biliaire à travers lequel la bile est sécrétée. La polarisation d'hépatocyte est essentielle pour la formation canaliculaire correcte et dépend des interactions entre le cytosquelette d'hépatocyte, les contacts de cellule-cellule, et la matrice extracellulaire. Les études in vitro de la participation de cytosquelette d'hépatocyte dans la formation de canaliculi et de sa réponse aux situations pathologiques sont handicapées par le manque de culture cellulaire, qui ressemblerait étroitement à la structure de réseau de canaliculi in vivo. Décrit ici est un protocole pour l'isolement des hépatocytes de souris du foie adulte de souris utilisant une technique modifiée de perfusion de collagène. On décrit également la production de la culture dans un arrangement 3D de sandwich de collagène, qui est employé pour l'immunolabeling des composants cytoskeletal pour étudier la formation canaliculaire biliaire et sa réponse aux traitements in vitro. Il est démontré que les cultures de sandwichs au collagène 3D d'hépatocyte s'adressent aux traitements avec des toxines (éthanol) ou des cytosquelettes d'actine qui modifient les médicaments (p. ex. la blebbistatin) et servent d'outil précieux pour les études in vitro de la formation et de la fonction du canalcisique bilique.
Introduction
Les hépatocytes, les structures cellulaires centrales du foie qui sont responsables de ses fonctions métaboliques, sont des cellules épithéliales polarisées uniques. Leur polarisation, apparaissant chez les mammifères peu de temps après la naissance, entraîne la formation du réseau canaliculaire biliaire et est essentielle pour une sécrétion biliaire appropriée. Les membranes apicales des hépatocytes forment collectivement des canauxudes biliaire, tandis que les membranes basales restent en contact avec l'endothélium des sinusoïdes. La perte de polarisation des hépatocytes entraîne une redistribution des transporteurs biliaire et entraîne des processus pathologiques liés à la rétention des bile dans le foie (c.-à-d. la cholémase).
L'établissement et le maintien de la polarisation des hépatocytes et le développement de la bile canaliculi impliquent des mécanismes complexes. Les processus sous-jacents dépendent de l'interaction collective entre le cytosquelette de l'hépatocyte, les contacts cellule-cellule, et les interactions avec la matrice extracellulaire1. Le cytosquelette d'hépatocyte se compose des trois réseaux de filament, le cytosquelette d'actine, les microtubules, et les filaments intermédiaires, qui fournissent le soutien structurel pour la formation canaliculaire. Le rôle différentiel des composants cytosquelettiques dans la régénération et l'entretien des réseaux canaliculaires biliaires a été précédemment illustré in vitro dans les cultures 3D d'hépatocyte de collagène-sandwich2.
Les microfilaments d'actine et les microtubules sont importants pendant les étapes initiales de la polarisation de membrane d'hépatocyte aux emplacements de la génération2de canaliculus. Le cytosquelette d'actine établit la structure et la fonction du canaliculi biliaire, formant des microfilaments membranaires et l'anneau circonférence, soutenant ainsi l'architecture canaliculaire et insérant le cytosquelette d'actine dans les jonctions serrées et adhérentes3. L'anneau de filaments intermédiaires de kératine à l'extérieur du cytosquelette d'actine stabilise davantage la structure canaliculaire3.
L'importance des protéines dans les complexes de jonction d'hépatocyte s'est avérée dans l'organisation de l'architecture canaliculi biliaire dans plusieurs modèles de souris knock-out, qui montrent des canauxuuli déformés chez les souris dépourvues de protéines de jonction serrées et/ou adhérentes4,5,6. La suppression de la protéine de jonction d'adhérents --caténine a été montrée pour mener à la désorganisation du cytosquelette d'actine d'hépatocyte, à la dilatation des lumens canaliculaires biliaires bile, aux jonctions serrées de fuite, et effectivement à un phénotype cholestatic4. En outre, des études in vitro ont montré l'importance des composants de jonction adhérents E-cadherin et 'caténine dans le remodelage du lumen apical hépatocellulaire et le trafic de protéines7.
Étonnamment, l'ablation de la pléctine de protéine de croisement de cytosquelette, qui est l'organisateur principal de kératine, a indiqué des phénotypes comparables à ceux liés au cytosqueletted'actine 8. Ceci suggère un rôle critique des filaments intermédiaires de kératine en soutenant la structure canaliculaire. Des études in vitro utilisant des sandwichs au collagène d'hépatocyte 3D ont également montré l'importance de la kinase de protéine activée par l'AMP et de son activateur en amont LKB1 dans la formation de réseau canaliculaire biliaire9. Ces résultats ont ensuite été confirmés par des études in vivo ultérieures10,11. Ainsi, il est devenu clair que des études in vitro sont nécessaires pour approfondir la compréhension des processus de signalisation impliqués dans l'établissement de la polarisation des hépatocytes, la formation appropriée du réseau canaliculaire et la sécrétion biliaires.
Un défi majeur dans l'étude des processus liés à la formation canaliculaire biliaire et sa réponse à des situations pathologiques in vitro est d'utiliser une culture cellulaire conditions qui ressemblent étroitement à la situation in vivo12. Les hépatocytes primaires fraîchement isolés ne sont pas polarisés; ainsi, ils perdent leur fonction, morphologie, et canaliculi biliaire fonctionnel dans des conditions de culture 2D (par exemple, changements dans la régulation de gène, la polarisation, et la dédifférenciation13,14,15). Malgré cela, les hépatocytes fraîchement isolés reflètent le plus étroitement la nature du foie invivo, contrairement aux lignées cellulaires dérivées du foie16. Même si elles ont été utilisées dans le passé, les lignées cellulaires immortalisées n'exercent pas la morphologie caractéristique épithéliale des hépatocytes, et les lumens canaliculaires biliaires formés par ces cellules ressemblent mal au canaliculi hépatique7. Récemment, les cultures 3D des hépatocytes primaires, des souris et des rats, sont devenues un outil utile pour étudier les processus impliqués dans la formation de réseau canaliculaire bilique bile in vitro9. Les hépatocytes primaires cultivés entre deux couches de collagène (appelée culture sandwich au collagène 3D) peuvent se repolariser en plusieurs jours. En raison des exigences techniques élevées exigées en cultivant des hépatocytes de souris dans des sandwichs de collagène 3D, ici nous présentons un protocole complexe pour isoler, cultiver, et pour immunolabel des hépatocytes de souris incorporés dans des sandwichs de collagène 3D afin de caractériser la participation des composants cytosquelettiques pendant la formation canaliculaire biliaire.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à la directive européenne 2010/63/UE et ont été approuvées par la Commission centrale tchèque pour le bien-être des animaux.
1. Matériaux
- Ménagez les animaux dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes conformément aux lignes directrices de la Fédération des associations de sciences animales de laboratoire ayant un accès gratuit à l'eau régulière de la chow et de l'eau potable. Animaux de maison sous un cycle foncé/lumière de 12 h/12 h. Pour l'isolement et la culture des hépatocytes, utilisez des animaux de 8 à 12 semaines.
- Solutions stock A et B
- Préparer la solution d'actions A et la solution Dactions B selon le tableau 1 et le tableau 2,respectivement, à l'avance. Dissoudre tous les composants en 1 L de H2O distillé (dH2O).
- Ajustez le pH des solutions à 7,2 et filtrez les solutions à l'intermédiaire d'un filtre de 0,2 m. Les deux solutions peuvent être stockées à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à 6 mois.
- Solution d'actions C
- Préparer la solution C le jour de l'isolement primaire des hépatocytes.
- Ajouter tous les composants selon le tableau 3, remplir à un volume total de 50 ml avec dH2O, et dissoudre. Ajuster le pH à 7,3.
- Aliquot 50 ml de la solution en tubes de 50 ml. Utilisez un tube par animal. Placer tous les aliquots requis dans un bain d'eau pré-chauffé (37 oC).
- Stock solution D
- Préparer la solution D le jour de l'isolement primaire des hépatocytes.
- Ajouter tous les composants selon le tableau 4, remplir à un volume total de 30 ml avec dH2O, et dissoudre. Ajuster le pH à 7,3.
- Aliquot 30 ml de la solution en tubes de 50 ml. Ajouter le collagène I (5 mg/30 ml) dans la solution D. Utilisez un aliquot par animal. Placer tous les aliquots dans un bain d'eau pré-chauffé (37 oC).
- Stock solution E
- Préparer la solution E le jour de l'isolement primaire des hépatocytes.
- Ajouter tous les composants selon le tableau 5, remplir à un volume total de 50 ml avec dH2O, et dissoudre. Ajuster le pH à 7,3.
- Aliquot 50 ml de la solution en tubes de 50 ml. Ajouter l'albumine V (0,65 g/50 ml) dans la solution E. Utilisez un aliquot par animal. Placer tous les aliquots dans un bain d'eau pré-chauffé (37 oC).
2. Préparation de sandwichs au collagène
- Un jour avant l'isolement primaire d'hépatocyte, préparez la première couche du sandwich de collagène I.
REMARQUE : Travaillez sur la glace et utilisez des solutions pré-réfrigérées, des bouts, des plaques et des tubes pour réduire au minimum la gélation non désirée du collagène I. - Neutraliser la quantité requise de collagène I (à partir de la queue de rat) selon le protocole du fabricant. Un volume de 100 l de collagène neutralisé (1,5 mg/mL) par échantillon expérimental (3,5 cm) est nécessaire. Pour préparer 1 ml de collagène neutralisé (1,5 mg/mL), ajouter 100 oL de 10x DMEM, 1,5 l de 1 M NaOH, et 48,5 oL de dH2O en 500 oL de collagène (concentration en stock de 3 mg/mL). Vérifier le pH du collagène neutralisé avec du papier litmus (le pH doit être de 7,5 euros).
- Disperser uniformément 100 l de solution de collagène neutralisée à l'aide d'une pointe préréfrigérée de 200 l sur la surface d'un plat de 3,5 cm fixé sur la glace.
- Incuber toute la nuit dans des conditions de culture standard (incubateur avec 5% de CO2 à 37 oC). Le jour de l'isolement primaire des hépatocytes, ajouter 1 ml de PBS préréchauffé (37 oC) à la première couche de collagène. Laisser le collagène se réhydrater de 2 à 3 h à 37 oC.
3. Équipement mis en place
- Préparer tout l'équipement tel qu'il est indiqué dans le Tableau des matériaux et le configurer comme indiqué à la figure 1.
4. Procédure chirurgicale
- Anesthésiez la souris par injection intramusculaire de tiletamine (60 mg/kg de poids corporel), de zolazépam (60 mg/kg) et de xylazine (4,5 mg/kg). Après plusieurs minutes, confirmer l'anesthésiation appropriée par le pincement d'orteil. Si l'animal ne répond pas à la pincée, passez à 4.2.
- Placez la souris anesthésié sur un tapis de dissection et tapez les extrémités inférieures et supérieures pour fixer la souris en position de supine. Élongez l'abdomen avec 70% d'éthanol et ouvrez l'abdomen avec une incision en forme de V de la zone pubienne aux pattes avant. Pliez la peau sur la poitrine pour découvrir la cavité abdominale. Placer le tapis de dissection sous un microscope à disséquer.
- Pliez une aiguille de seringue à insuline (30 G) à un angle de 45 degrés. Exposer le veau cava inférieur (IVC) en déplaçant les intestins et les deux points dans la direction caudale.
- Remplir 2,5 ml de solution C préréchauffée (37 oC) dans une seringue de 2 ml à l'arme à canule. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la canule ou la seringue.
- Avant l'annulation de l'IVC, repositionner les lobes du foie en les pressant jusqu'au diaphragme avec un coton humide (PBS). Placez une suture de soie autour de l'IVC juste en dessous du foie (Figure 2A,B).
- Injecter 10 l'héparine (5000 U/mL) dans la veine du portail à l'aide d'une seringue à insuline avec une aiguille de 30 G pliée à un angle de 45 degrés (figure 2C).
- Pour canuiller le foie, faire une petite incision avec des ciseaux microchirurgicaux à l'IVC directement à côté du foie (sous la suture; Figure 2D) qui est assez grande pour insérer la canule. Fixer la canule dans la position à l'aide de sutures et de deux noeuds chirurgicaux (figure 2E).
- Couper la veine du portail (Figure 2F) pour permettre aux tampons de perfusion de s'écouler du foie pour empêcher l'expansion du foie.
- Perfle manuellement le foie avec 1,5 ml de solution préchauffée C en appuyant lentement sur la seringue reliée à la canule (cela devrait prendre 15 s). L'ablation du sang du foie par décoloration du foie peut maintenant être observée.
- Préremplir une pompe péristtaltique avec une solution pré-chauffée (37 oC) C. Vérifier l'appareil de perfusion et s'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le système.
- Déconnectez prudemment la canule de la seringue et connectez-la à la tuyauterie de la pompe péristétique fonctionnant à un débit de 2,5 ml/min. Travaillez rapidement mais soigneusement et assurez-vous que la canule reste en position et qu'aucune bulle n'entre dans la tuyauterie ou la canule.
- Perfuser le foie avec la solution C pendant 2 min (5 ml de solution C). Changer la solution D et continuer la perfusion pendant 10 min (25 ml de solution D).
- Une fois que le foie a été perfused, retirez-le de la cavité abdominale. Le foie sera désormais très fragile et de couleur pâle (Figure 3).
5. Isolement des hépatocytes primaires
- Retirer le foie de la souris. La canule sera toujours liée au foie, alors utilisez les forceps pour soulever la canule avec le foie, et soigneusement couper toutes les connexions fascia. Transférer le foie dans un tube de 50 ml contenant 20 ml de solution E pré-chauffée.
- Maintenez la canule avec le foie à l'aide de forceps et dissocier le tissu en frottant le foie autour de la paroi du tube pour transférer les hépatocytes isolés en tampon. Gardez les cellules isolées sur la glace.
REMARQUE : Les hépatocytes primaires isolés sont viables pendant plusieurs heures pendant qu'ils sont conservés sur la glace. Les utilisateurs peuvent répéter les étapes 4.1 à 5.2 isolant les hépatocytes primaires d'une autre souris donneuse, si nécessaire, ou passer à l'étape suivante. - Placez une passoire à cellules en nylon de 70 m sur un tube de 50 ml et filtrez les cellules isolées.
- Centrifuger le tube à 50 x g et 4 oC pendant 5 min. Aspirez le supernatant. Pour enlever les cellules mortes et augmenter le pourcentage de cellules viables, resuspendre la pastille dans 20 ml de 40% percol dans DMEM.
- Centrifuger le tube à 50 x g et 4 oC pendant 5 min. Aspirer le supernatant contenant des cellules mortes et resuspendre la pastille dans 20 ml de la solution E.
- Tubes centrifuges à 50 x g et 4 oC pendant 5 min. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 10 ml de la solution E.
- Vérifiez le rendement primaire de l'hépatocyte et la viabilité à l'aide de colorations bleues trypan. Comptez le nombre de cellules à l'aide d'une chambre de comptage des cellules Neubauer et ajustez la concentration cellulaire à 3,75 x 105 cellules/mL viables. Gardez les cellules sur la glace.
6. Cultivation d'hépatocytes primaires dans des sandwichs au collagène 3D
- Préparer le milieu de culture d'hépatocyte (HCM). Ajouter 15 l de glucagon (1 mg/mL), 15 oL d'hydrocortisone (50 mg/mL) et 40 l d'insuline (10 mg/mL) à 50 mL de milieu complet (DMEM, glucose élevé, 10 % FBS, 1 % pénicilline-streptomycine).
- Disperser uniformément 2 ml (5 x 105 cellules/mL) d'hépatocytes primaires viables dans un plat pré-enduit de 3,5 cm. Incuber les cellules avec 5% de CO2 à 37 oC pendant 3 h. Important : Répartir uniformément les cellules en inclinant le plat dans toutes les directions juste avant de mettre le plat dans un incubateur.
- Préparer du collagène neutralisé I (plat de 100 l/3,5 cm; c'est-à-- c'est-à-d. un volume suffisant pour tous les plats tels que décrits ci-dessus [étape 2.1]). Garder sur la glace jusqu'à l'utilisation.
- Après 3 h, retirer soigneusement les cellules moyennes et non attachées et ajouter 100 l de collagène neutralisé I à chaque plat de 3,5 cm pour former la couche supérieure de sandwich au collagène sur les cellules. Incuber le sandwich au collagène dans des conditions de culture cellulaire standard (5 % de CO2 à 37 oC) pendant 1 h. Après une incubation de 1 h, ajouter délicatement 2 ml de HCM.
- Après 24 h de culture, changez le médium HCM pour un nouveau.
- Culture pendant 3 à 8 jours, selon la formation de bile canaliculi. Vérifiez la culture tous les jours au microscope (Figure 4). Changer le HCM tous les deux jours.
7. Immunolabeling des hépatocytes primaires dans les sandwichs de collagène 3D
- Retirer le support des sandwichs aux hépatocytes, puis laver soigneusement avec du PBS réchauffé. Fixer les cultures sandwich avec 1 ml de 4% de paraformaldéhyde en PBS pendant 30 min à température ambiante (RT).
- Après fixation, laver les sandwichs 3x pendant 10 min en 2 ml de PBS 0,1% Tween 20 (PBS-T).
- Cellules perméabilize avec 1 ml de 0,1 M de glycine, 0,2% Triton X-100 en PBS à RT pendant 1 h. Laver 3x pendant 10 min en PBS-T.
- Perturber délicatement la couche supérieure de collagène à l'aide d'une pointe de chargement de 10 l reliée à une aspiration sous vide afin d'assurer une pénétration suffisante des anticorps.
- Bloquer avec 1 ml de 5% de BSA en PBS-T (c.-à-d., solution de blocage) pendant 2 h. Incuber avec des anticorps primaires dilués dans la solution de blocage pendant la nuit à 37 oC. Laver 3x pendant 15 min en PBS-T.
- Après lavage, incuber avec un anticorps secondaire à 37 oC pendant 5 h. Laver 3x pendant 15 min en PBS-T suivi d'un lavage 1x avec H2O distillé.
- Mont avec des supports de montage anti-fade (voir Tableau des matériaux) pour la microscopie.
Representative Results
Les hépatocytes primaires de souris ont été isolés et ensepépins dans des sandwichs de collagène 3D. Bile canaliculi entre deux cellules adjacentes a commencé à se former dans les heures qui ont suivi l'ensemencement. Les cellules se sont formées en grappes et se sont auto-organisées dans un réseau environ régulier de canauxbilites dans un délai d'un jour (figure 4). Dans un délai de 3 à 6 jours, des grappes de cellules de 5 à 10 ont été observées, avec des hépatocytes entièrement polarisés formant un réseau canaliculaire (figure 4).
Traitement des hépatocytes primaires de souris dans des sandwichs au collagène 3D avec des médicaments à base de toxine (éthanol) ou de cytosquelette (p. ex., la blebbistatin, l'acide okadaic) a eu comme conséquence des changements dans le cytosquelette d'hépatocyte, la largeur, la forme, et le nombre de canaliculi biliaire illustrés par l'immunolabeling avec un anticorps à la kératine 8 (la kératine la plus abondante dans les hépatocytes), phalloidin (visualisant F-actin), et anticorps à la jonction serrée zonula ocludens-1 (ZO-1 ; Figure 5).
Le traitement d'éthanol a eu seulement un effet doux sur l'organisation de la kératine 8 ; cependant, il a augmenté la tortuosité (comme on le voit à partir de la coloration F-actin) et la distribution des largeurs canaliculaires biliaires (figure 5). L'intensité du signal de la coloration ZO-1 a été diminuée dans le canaliculi biliaire traité à l'éthanol par rapport aux contrôles non traités, ce qui suggère une perte de jonctions serrées après le traitement de l'éthanol. L'inhibition de la contractilité d'actomyosin avec le blebbistatin a sensiblement affecté la forme et le nombre de canaliculi biliaires. Le réseau canaliculaire régulier a été réorganisé, comparé aux hépatocytes non traités, en canaliculi bilily formé de bile avec une incidence accrue de canaliculi bile arrondi épais au lieu des longs minces (comme vu dans l'histogramme des largeurs canaliculaires).
En outre, le traitement avec l'acide okadaic (OA) inhibant des phosphatases a fortement affecté les propriétés physiques des kératines, comme précédemment montré8,17. L'arthrose modifie la solubilité des filaments de kératine; ainsi, le traitement a eu comme conséquence la réorganisation profonde du maillage de kératine, qui s'est effondré en grands agrégats périnucléaires. Le F-actin et la protéine de jonction serrée ZO-1 n'ont pas été localisés dans n'importe quelle structures particulière, suggérant la disparition presque complète du canaliculi de bile organisé et une perte complète de polarité d'hépatocyte. Les canaux de la bile restante ont été considérablement réduits par rapport aux témoins non traités, comme on le voit dans l'histogramme de largeur canaliculaire (figure 5).
Pour corréler les observations microscopiques des changements dans le cytosquelette d'hépatocyte avec la réponse biochimique hépatocellulaire au traitement, le protocole a également mesuré des niveaux de l'aminotransferase d'alanine (ALT) et de transaminase d'aspartate (AST) (deux enzymes de foie qui sont généralement employées comme marqueurs de dommages hépatocellulaires) dans le supernatant des sandwichs 3D de collagène (figure 6)18. Le traitement d'éthanol a sensiblement augmenté les niveaux de l'ALT et de l'AST, suggérant des dommages hépatocellulaires graves. Le traitement de Blebbistatin n'a mené à aucun changement considérable des niveaux d'ALT et d'AST comparé au traitement d'acide okadaic, qui a déclenché des changements biochimiques doux avec des niveaux accrus d'ALT, mais aucun changement dans des niveaux d'AST. Ainsi, les marqueurs biochimiques des dommages hépatocellulaires mesurés in vitro du supernatant d'hépatocyte corrèlent avec les changements cytosquelettiques observés par immunostaining.
Figure 1 : Mise en place expérimentale. (A) La souris fixée en position de supine, est placée sous un microscope disséquant avant la chirurgie. Tous les instruments chirurgicaux requis sont placés sur un plateau. (B) La suite de perfusion pendant la perfusion de foie de souris montrant le tube de silicone reliant le réservoir avec le tampon chaud et la souris perfused. (C) Représentation schématique de B. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Ouverture de la cavité abdominale et cannulation de l'IVC. L'abdomen est ouvert avec une incision en forme de V de la zone pubienne aux pattes avant. La peau est repliée sur la poitrine pour exposer et agrandir la cavité abdominale. Pour exposer l'IVC, les intestins et les deux points sont soigneusement déplacés caudally. (A, B) Avant l'annulation de l'IVC, les lobes du foie doivent être repositionnés en les appuyant vers le haut vers le diaphragme avec un coton-tige pbS-wetted. L'IVC est alors soigneusement séparé des tissus environnants, et une suture de soie est placée autour de l'IVC à proximité du foie. Le panneau B représente les schémas de la cavité abdominale indiqués dans le panneau A. Les lobes du foie, l'intestin, la veine inférieure cava (IVC, rouge), et les sutures sont indiqués. (C) L'héparine est injectée dans la veine du portail (PV, flèche) avec une seringue à insuline (30 G aiguille pliée à 45'angle). (D) Pour canuiller le foie, l'IVC est incisé directement à côté du foie (sous la suture). (E) La canule est insérée et fixée avec des sutures en liant deux noeuds chirurgicaux. (F) La veine du portail est entièrement coupée pour permettre une sortie de mémoire tampon libre, empêchant ainsi l'expansion du foie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images hépatiques représentatives avant et après la perfusion. (A, B) Le foie cannulé a été réséqué et perfusé pendant 12 min à un débit de 2,5 ml/min. Notez le foie significativement décoloré après perfusion (B) par rapport au foie fraîchement réséqué (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Culture de sandwich au collagène 3D des hépatocytes primaires de souris. Images de champ lumineux représentatives des hépatocytes primaires de souris cultivés pendant 1, 2, et 3 jours dans des conditions 3D. Il convient de noter que de plus grands groupes de cellules très organisées sont formés après 3 jours de culture. Les zones encadrées montrent des images agrandies de 3x. Les pointes de flèche indiquent la bile canaliculi. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Évaluation de la réponse morphologique au stress toxique par microscopie immunofluorescente. Les hépatocytes primaires de souris cultivés dans les sandwichs 3D de collagène ont été traités avec des toxines (éthanol, blebbistatin, ou acide okadaic) le jour 3 de la culture. Des cellules fixes ont été souillées pour visualiser des composants cytosquelettiques : kératine 8 (vert), F-actin (rouge), et zonula occludens-1 (ZO-1, magenta) par immunofluorescence. Le traitement toxique a mené à la désorganisation des composants cytosquelettiques visualisés, et il a réduit le nombre et a augmenté la tortuosité du canaliculi bilique. Les largeurs canaliculaires ont été mesurées dans les hépatocytes non traités et traités et sont représentées comme des histogrammes de distribution de largeurs. Les pointes de flèche indiquent la bile canaliculi. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Analyse biochimique de la réponse des sandwichs au collagène d'hépatocyte 3D aux dommages toxiques in vitro. L'ALT et l'AST, marqueurs bien établis des dommages hépatocellulaires, ont été mesurés dans le supernatant des sandwichs 3D de collagène d'hépatocyte traité avec des toxines (éthanol, blebbistatin, et acide okadaic). L'ALT et l'AST ont été élevés dans les cellules traitées comparées aux cellules non traitées. Les données sont signalées comme des moyens arithmétiques - SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Solution Stock A (10x) | |
| Réactif | Concentration finale (g/litre) |
| Nacl | 80 |
| Kcl | 4 |
| MgSO47H2O | 1.97 |
| Na2HPO42H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
Tableau 1 : Solution de stock Une recette.
| Solution Stock B (10x) | |
| Réactif | Concentration finale (g/litre) |
| Nacl | 69 |
| Kcl | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO47H2O | 2.94 |
| CaCl2 (en) | 2.772 |
Tableau 2 : Recette de la solution B en stock.
| Solution C | |
| Réactif | |
| Solution Stock A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 Annonces | 0,1094 g |
| EGTA (en anglais seulement) | 0,0095 g |
| dH2O | à 50 ml |
Tableau 3 : Recette de la solution C en stock.
| Solution D | |
| Réactif | |
| Solution d'achat A (10x) | 3 mL |
| NaHCO3 Annonces | 0,065 g |
| CaCl2 (en) | 0,0125 g |
| dH2O | à 30 ml |
Tableau 4 : Recette de la solution D en stock.
| Solution E | |
| Réactif | |
| Solution stock B (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 Annonces | 0,1 g |
| Glucose | 0,045 g |
| dH2O | à 50 ml |
Tableau 5 : Recette de la solution Stock E.
Discussion
L'utilisation des cultures primaires d'hépatocyte de souris est importante pour des études in vitro pour mieux comprendre les processus de signalisation impliqués dans l'établissement de la polarisation d'hépatocyte, de la formation appropriée de structure canaliculaire, et de la sécrétion biliaires. Les défis dans l'isolement et la culture à long terme des hépatocytes primaires de souris dans la culture 2D ont conduit à l'invention de plusieurs approches techniques avec l'effectivité d'isolement accrue et la longévité des cellules isolées, chacune avec plusieurs avantages et Inconvénients. Il est maintenant largement admis que les cultures 2D des hépatocytes primaires imitent seulement un nombre limité d'attributs de la biologie hépatique pendant une courte période de temps. Ainsi, la culture 3D dans un arrangement de sandwich de collagène remplace largement les conditions 2D, particulièrement lorsqu'elles se concentrent sur la fonction du cytosquelette dans la biologie de foie (par exemple, les effets toxiques de drogue ou l'organisation spatiale du transport biliestif).
Depuis les années 1980, plusieurs protocoles d'isolement des hépatocytes de souris avec diverses modifications ont été décrits. L'approche de perfusion de collagène en deux étapes est devenue largement utilisée dans de nombreux laboratoires. L'ajout de centrifugation de gradient dans le protocole d'isolement permet l'enlèvement des cellules mortes19,20 et augmente considérablement le nombre de cellules viables (ici, systématiquement à 93%). Même si cette étape prolonge le temps de manipulation des cellules et entraîne une réduction des nombres cellulaires21,cette étape est considérée comme nécessaire dans la culture sandwich au collagène 3D pour la formation de réseau canaliculaire bilique bile appropriée. En outre, il est plus important de procéder rapidement et avec précision pendant les étapes de perfusion, ce qui raccourcit le temps que les cellules sont manipulées.
D'autres facteurs importants qui augmentent la viabilité des cellules et leur capacité à former des réseaux canaliculaires en 3D est l'utilisation de solutions fraîchement préparées et l'évitement des bulles pendant la perfusion. Par conséquent, les solutions doivent être préparées le jour de l'isolement des hépatocytes de souris, et la pompe péristtique et le tube doivent être vérifiés lors du changement de solutions. Si le protocole est suivi de près, l'isolement des hépatocytes primaires devrait être réussi avec un rendement élevé des cellules viables.
Un autre facteur critique dans la culture à long terme d'hépatocytes 3D est la source initiale des hépatocytes primaires qui sont employés. Il est important d'utiliser des animaux qui sont de 8 à 12 semaines, qui servent de donneurs optimaux d'hépatocytes. L'utilisation d'hépatocytes d'animaux plus âgés n'a pas été aussi réussie dans la culture à long terme, car ces hépatocytes ont changé leur morphologie plus souvent, dépolarisé, et ont cessé de former des réseaux canaliculaires. En outre, placage hépatocytes sur le gel de collagène correctement neutralisé formé à partir de solution relativement fortement concentrée est une étape essentielle. Dans la plupart des protocoles, des concentrations d'environ 1 mg/mL sont utilisées. Après de nombreuses optimisations, une concentration de 1,5 mg/mL est optimale pour la culture à long terme des hépatocytes et fournit des hépatocytes très organisés avec canaliculi bilique séminuen.
Ce protocole facile à suivre permet la culture à long terme d'hépatocytes de souris primaires. Les résultats représentatifs démontrent un large spectre d'utilisation pour les hépatocytes primaires de souris cultivés en 3D en étudiant le rôle des composants cytosquelettiques dans la formation de canaliculi bilique.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Agence des subventions de la République tchèque (18-02699S); l'Agence de subventions du Ministère de la santé de la République tchèque (17-31538A); projets de recherche institutionnelle de l'Académie tchèque des sciences (RVO 68378050) et des projets MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395, et OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775); L'Université Charles (allocation personnelle à K.K.) et un projet de programme opérationnel Prague-Compétitivité (CZ.2.16/3.1.00/21547). Nous reconnaissons le Centre de microscopie légère, IMG CAS, Prague, République tchèque (soutenu MEYS CR projets LM2015062 et LO1419) pour le soutien avec l'imagerie microscopie présenté.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
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