Summary
Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von Maushepatozyten aus erwachsenen Mauslebern mit einer modifizierten Kollagenase-Perfusionstechnik vorgestellt. Ebenfalls beschrieben ist die Langzeitkultur von Hepatozyten in einer 3D-Kollagen-Sandwich-Einstellung sowie die Immunkennzeichnung der zytoskelettalen Komponenten zur Untersuchung der Gallenkanalbildung und deren Reaktion auf die Behandlung.
Abstract
Hepatozyten sind die zentralen Zellen der Leber, die für ihre Stoffwechselfunktion verantwortlich sind. Als solche bilden sie ein einzigartig polarisiertes Epithel, bei dem zwei oder mehr Hepatozyten apikale Membranen zu einem Gallenkanalnetz beitragen, durch das Galle abgesondert wird. Hepatozytenpolarisation ist wichtig für die korrekte kanalikuläre Bildung und hängt von Wechselwirkungen zwischen dem Hepatozyten-Zytoskelett, Zell-Zell-Kontakten und der extrazellulären Matrix ab. In-vitro-Studien über Hepatozyten-Zytoskelett-Beteiligung an der Canaliculi-Bildung und ihre Reaktion auf pathologische Situationen werden durch den Mangel an Zellkultur behindert, die der Canaliculi-Netzwerkstruktur in vivo sehr ähnlich wäre. Beschrieben hier ist ein Protokoll für die Isolierung von Maus Hepatozyten aus der erwachsenen Mausleber mit einer modifizierten Kollagenase Perfusionstechnik. Ebenfalls beschrieben ist die Produktion von Kultur in einer 3D-Kollagen-Sandwich-Einstellung, die für die Immunkennzeichnung von zytoskelettalen Komponenten verwendet wird, um die Gallenkanalbildung und ihre Reaktion auf Behandlungen in vitro zu untersuchen. Es wird gezeigt, dass Hepatozyten-3D-Kollagen-Sandwichkulturen auf Behandlungen mit Toxinen (Ethanol) oder Aktin-Zytoskelett-verändernden Medikamenten (z. B. Blebbistatin) reagieren und als wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien zur Bildung und Funktion von Gallenkanaliculi dienen.
Introduction
Hepatozyten, die zentralen zellulären Strukturen der Leber, die für ihre Stoffwechselfunktionen verantwortlich sind, sind einzigartig polarisierte Epithelzellen. Ihre Polarisation, die bei Säugetieren kurz nach der Geburt auftritt, führt zur Bildung des gallenförmigen kanalikulären Netzes und ist für die richtige Gallensekretion unerlässlich. Apische Membranen von Hepatozyten bilden kollektiv Gallenkanaliculi, während Basalmembranen in Kontakt mit dem Endothel der Sinusoiden bleiben. Der Verlust der Hepatozytenpolarisation führt zu einer Umverteilung von Gallentransportern und führt zu pathologischen Prozessen im Zusammenhang mit der Gallenretention in der Leber (d.h. Cholestase).
Die Etablierung und Aufrechterhaltung der Hepatozytenpolarisation und die Entwicklung von Gallenkanaliculi erfordern komplexe Mechanismen. Die zugrunde liegenden Prozesse hängen vom kollektiven Zusammenspiel zwischen dem Hepatozyten-Zytoskelett, Zell-Zell-Kontakten und Wechselwirkungen mit der extrazellulären Matrix1ab. Das Hepatozyten-Zytoskelett besteht aus allen drei Filamentnetzen, dem Aktin-Zytoskelett, Mikrotubuli und Zwischenfilamenten, die die kanalikuläre Bildung strukturell unterstützen. Die unterschiedliche Rolle der zytoskelettalen Komponenten bei der Regeneration und Pflege von Gallenkanalnetzen wurde zuvor in vitro in 3D-Kollagen-Sandwich-Hepatozytenkulturen2dargestellt.
Actin Mikrofilamente und Mikrotubuli sind wichtig in den Anfangsstadien der Hepatozytenmembranpolarisation an den Stellen der Canaliculus Generation2. Das Aktin-Zytoskelett legt die Struktur und Funktion von Gallenkanaliculi fest, bildet membranassoziierte Mikrofilamente und den Umfangsring, unterstützt so die kanalförmige Architektur und fügt das Aktin-Zytoskelett in enge und haftete Kreuzungen3. Der Ring von Keratin-Zwischenfilamenten außerhalb des Aktin-Zytoskeletts stabilisiert die kanalikuläre Struktur3weiter.
Die Bedeutung von Proteinen in Hepatozyten-Junctional-Komplexen bei der Organisation der Gallenkanaliculi-Architektur ist in mehreren Knock-out-Mausmodellen gut dokumentiert, die verzerrte Canaliculi bei Mäusen zeigen, die sowohl enge als auch/oder haftende Junction-Proteine4,5,6aufweisen. Die Deletion der Adhäsurten-Knoten-Protein-Catenin hat gezeigt, dass zu einer Desorganisation des Hepatozyten-Aktin-Zytoskeletts, der Erweiterung der Gallenkanallumen, und undichte enge Knoten, und effektiv zu einem cholestatischen Phänotyp4führen. Darüber hinaus haben In-vitro-Studien gezeigt, wie wichtig die Adhästenkomponenten E-Cadherin und A-Catenin bei der Umgestaltung des hepatozellulären apikalen Lumens und des Proteinhandelssind 7.
Auffallend ist, dass die Ablation des Zytoskelett-Vernetzungsproteins Plectin, das der wichtigste Keratin-Organisator ist, Phänotypen ergeben hat, die mit denen vergleichbar sind, die mit dem Aktin-Zytoskelett8verbunden sind. Dies deutet auf eine entscheidende Rolle von Keratin-Zwischenfilamenten bei der Unterstützung der kanalikulären Struktur hin. In-vitro-Studien mit 3D-Hepatozyten-Kollagen-Sandwiches haben auch die Bedeutung der AMP-aktivierten Proteinkinase und ihres vorgelagerten Aktivators LKB1 in der Gallenkanalnetzbildung9gezeigt. Diese Ergebnisse wurden dann durch nachfolgende in vivo-Studien10,11bestätigt. So ist deutlich geworden, dass In-vitro-Studien notwendig sind, um das Verständnis von Signalprozessen zu fördern, die bei der Etablierung von Hepatozytenpolarisation, richtiger kanalikulärer Netzwerkbildung und Gallensekretion beteiligt sind.
Eine große Herausforderung bei der Untersuchung von Prozessen im Zusammenhang mit der Gallenkanalbildung und ihrer Reaktion auf pathologische Situationen in vitro ist die Verwendung einer Zellkultur, die der Situation in vivo12sehr ähnlich ist. Frisch isolierte primäre Hepatozyten sind nicht polarisiert; So verlieren sie ihre Funktion, Morphologie und funktionelle Galle Canaliculi in 2D-Kulturbedingungen (z.B. Veränderungen der Genregulation, Polarisation und De-Differenzierung13,14,15). Trotz dieser Tatsache spiegeln frisch isolierte Hepatozyten am ehesten die Natur der Leber in vivowider, im Gegensatz zu Leber-abgeleiteten Zelllinien16. Obwohl sie in der Vergangenheit verwendet wurden, üben verewigte Zelllinien nicht die epitheliale charakteristische Morphologie von Hepatozyten aus, und die gallenkanalicularen Lumen, die von diesen Zellen gebildet werden, ähneln Lebercanaliculi schlecht7. Kürzlich sind 3D-Kulturen von primären Hepatozyten, sowohl von Mäusen als auch von Ratten, zu einem nützlichen Werkzeug geworden, um Prozesse zu untersuchen, die an der Bildung von Kanalnetzen in vitro9an der Gallenkanalnetzbildung beteiligt sind. Primäre Hepatozyten, die zwischen zwei Kollagenschichten kultiviert werden (als 3D-Kollagen-Sandwichkultur bezeichnet), können in mehreren Tagen repolarisieren. Aufgrund der hohen technischen Anforderungen, die bei der Kultivierung von Maushepatozyten in 3D-Kollagen-Sandwiches erforderlich sind, präsentieren wir hier ein komplexes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Immunlabel-Maushepatozyten, eingebettet in 3D-Kollagen-Sandwiches, um die Einbeziehung von zytoskelettalen Komponenten bei der Gallenkanalbildung zu charakterisieren.
Protocol
Alle Tierversuche wurden gemäß der europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt und von der tschechischen Zentralkommission für Tierschutz genehmigt.
1. Materialien
- Haustiere unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen nach den Richtlinien der Federation for Laboratory Animal Science Associations mit freiem Zugang zu regulärem Chow und Trinkwasser. Haustiere unter einem 12 h/12 h dunkel/lichten Zyklus. Für Hepatozytenisolation und Kultur verwenden Sie 8-12 Wochen alte Tiere.
- Lagerlösungen A und B
- Bereiten Sie Lagerlösung A und Lagerlösung B gemäß Tabelle 1 bzw. Tabelle 2im Voraus vor. Alle Komponenten in 1 L destillierth H2O (dH2O) auflösen.
- Stellen Sie den pH-Wert der Lösungen auf 7,2 ein und filtern Sie die Lösungen über einen 0,2-mm-Filter. Beide Lösungen können bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Lagerlösung C
- Bereiten Sie Lösung C am Tag der primären Hepatozytenisolation vor.
- Fügen Sie alle Komponenten gemäß Tabelle 3 hinzu, füllen Sie ein Gesamtvolumen von 50 ml mit dH2O aus und lösen Sie es auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein.
- Aliquot 50 ml der Lösung in 50 ml Rohren. Verwenden Sie eine Röhre pro Tier. Legen Sie alle erforderlichen Aliquots in ein vorgewärmtes Wasserbad (37 °C).
- Lagerlösung D
- Bereiten Sie Lösung D am Tag der primären Hepatozytenisolation vor.
- Fügen Sie alle Komponenten gemäß Tabelle 4hinzu, füllen Sie ein Gesamtvolumen von 30 ml mit dH2O aus und lösen Sie es auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein.
- Aliquot 30 ml der Lösung in 50 ml Rohren. Kollagenase I (5 mg/30 ml) in Lösung D geben. Verwenden Sie ein Aliquot pro Tier. Legen Sie alle Aliquots in ein vorgewärmtes Wasserbad (37 °C).
- Lagerlösung E
- Bereiten Sie Lösung E am Tag der primären Hepatozytenisolation vor.
- Fügen Sie alle Komponenten gemäß Tabelle 5 hinzu, füllen Sie ein Gesamtvolumen von 50 ml mit dH2O aus und lösen Sie es auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein.
- Aliquot 50 ml der Lösung in 50 ml Rohren. Fügen Sie Albumin V (0,65 g/50 ml) in Lösung E ein. Verwenden Sie ein Aliquot pro Tier. Legen Sie alle Aliquots in ein vorgewärmtes Wasserbad (37 °C).
2. Zubereitung von Kollagen-Sandwiches
- Einen Tag vor der primären Hepatozytenisolierung bereiten Sie die erste Schicht des Kollagen-I-Sandwiches vor.
HINWEIS: Arbeiten Sie auf Eis und verwenden Sie vorgekühlte Lösungen, Spitzen, Teller und Tuben, um unerwünschte Gelation von Kollagen I zu minimieren. - Neutralisieren Sie die erforderliche Menge an Kollagen I (vom Rattenschwanz) nach dem Herstellerprotokoll. Es wird ein Volumen von 100 l neutralisiertem Kollagen (1,5 mg/ml) pro Versuchsprobe (3,5 cm Schale) benötigt. Zur Zubereitung von 1 ml neutralisiertem Kollagen (1,5 mg/ml) fügen Sie 100 l 10x DMEM, 1,5 l 1M NaOH und 48,5 l dH2O in 500 l Kollagen (Lagerkonzentration = 3 mg/ml) hinzu. Überprüfen Sie den pH-Wert von neutralisiertem Kollagen mit Lackmuspapier (der pH-Wert sollte 7,5 USD betragen).
- Verteilen Sie 100 l neutralisierte Kollagenlösung gleichmäßig mit einer vorgekühlten 200-L-Spitze über die Oberfläche einer 3,5 cm großen Schale, die auf Eis gesetzt ist.
- Über Nacht unter Standardkulturbedingungen inkubieren (Inkubator mit 5%CO2 bei 37 °C). Am Tag der primären Hepatozytenisolation 1 ml vorgewärmt (37 °C) PBS in die erste Kollagenschicht geben. Lassen Sie das Kollagen für 2-3 h bei 37 °C rehydrieren.
3. Ausrüstung eingerichtet
- Bereiten Sie alle Geräte vor, wie in der Materialtabelle aufgeführt, und richten Sie sie wie in Abbildung 1dargestellt ein.
4. Chirurgischer Eingriff
- Anästhesisieren Sie die Maus durch intramuskuläre Injektion von Tiletamin (60 mg/kg Körpergewicht), Zolazepam (60 mg/kg) und Xylazin (4,5 mg/kg). Nach einigen Minuten die richtige Anästhesisierung durch die Zehenzange bestätigen. Wenn das Tier nicht auf die Prise reagiert, fahren Sie mit 4.2 fort.
- Legen Sie die anästhesierte Maus auf eine Seziermatte und befestigen Sie die unteren und oberen Extremitäten, um die Maus in einer Supine-Position zu fixieren. Den Bauch mit 70% Ethanol abwischen und den Bauch mit einem V-förmigen Schnitt vom Schambereich bis zu den Vorderbeinen öffnen. Falten Sie die Haut über die Brust, um die Bauchhöhle zu entdecken. Legen Sie die Sezierenmatte unter ein Sezierendes Mikroskop.
- Biegen Sie eine Insulinspritze Nadel (30 G) in einen 45°-Winkel. Setzen Sie die minderwertige Vena cava (IVC) durch Bewegen des Darms und Dickdarm in die kaudale Richtung.
- 2,5 ml vorgewärmter (37 °C) Lösung C in eine 2 ml Spritze mit kanülen füllen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Kanüle oder Spritze befinden.
- Positionieren Sie die Leberlappen vor der Cannulation des IVC neu, indem Sie sie mit einem nassen (PBS) Wattestäbchen auf die Membran drücken. Legen Sie eine Seidennaht um das IVC direkt unter die Leber (Abbildung 2A,B).
- Mit einer Insulinspritze mit einer 30 G Nadel, die in einem 45°-Winkel gebogen ist (Abbildung 2C), in die Portalvene injizieren.
- Um die Leber zu kanülieren, machen Sie einen kleinen Schnitt mit mikrochirurgischer Schere zum IVC direkt neben der Leber (unter der Naht; Abbildung 2D), die groß genug ist, um die Kanüle einzufügen. Sichern Sie die Kanüle in der Position mit Nähten und zwei chirurgischen Knoten (Abbildung 2E).
- Schneiden Sie die Portalvene (Abbildung 2F), damit die Perfusionspuffer aus der Leber herausfließen, um eine Ausdehnung der Leber zu verhindern.
- Durch manuelles Durchdringen der Leber mit 1,5 ml vorgewärmter Lösung C durch langsames Drücken der an die Kanüle angeschlossenen Spritze (dies sollte 15 s dauern). Die Entfernung von Blut aus der Leber durch Verfärbung der Leber kann nun beobachtet werden.
- Befüllen Sie eine peristaltische Pumpe mit vorgewärmter (37 °C) Lösung C. Überprüfen Sie das Perfusionsgerät und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im System befinden.
- Trennen Sie vorsichtig die Kanüle von der Spritze und schließen Sie sie an die Schläuche der Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von 2,5 ml/min an. Arbeiten Sie schnell, aber sorgfältig und stellen Sie sicher, dass die Kanüle in Position bleibt und keine Blasen in den Schlauch oder die Kanüle gelangen.
- Durchschnonen Sie die Leber mit Lösung C für 2 min (5 ml Lösung C). Wechseln Sie zu Lösung D und setzen Sie die Perfusion für weitere 10 min (25 ml Lösung D) fort.
- Sobald die Leber durchdrät ist, entfernen Sie sie aus der Bauchhöhle. Die Leber wird nun sehr zerbrechlich und blass in der Farbe sein (Abbildung 3).
5. Isolierung von primären Hepatozyten
- Entfernen Sie die Leber von der Maus. Die Kanüle wird immer noch an die Leber gebunden werden, so verwenden Sie die Zange, um die Kanüle mit der Leber zu heben, und sorgfältig schneiden Sie alle Faszienverbindungen. Übertragen Sie die Leber in ein 50 ml-Rohr mit 20 ml vorgewärmter Lösung E.
- Halten Sie die Kanüle mit der Leber mit Zangen und trennen Sie das Gewebe, indem Sie die Leber um die Wand der Röhre reiben, um die isolierten Hepatozyten in Puffer zu übertragen. Halten Sie die isolierten Zellen auf Eis.
HINWEIS: Isolierte primäre Hepatozyten sind für mehrere Stunden lebensfähig, während sie auf Eis gehalten werden. Benutzer können die Schritte 4.1 bis 5.2 wiederholen, um primäre Hepatozyten von einer anderen Spendermaus zu isolieren, falls erforderlich, oder mit dem nächsten Schritt fortfahren. - Legen Sie ein 70 m nylonzelles Sieb auf ein 50 ml-Rohr und filtern Sie die isolierten Zellen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 50 x g und 4 °C für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand. Um abgestorbene Zellen zu entfernen und den Anteil lebensfähiger Zellen zu erhöhen, setzen Sie das Pellet in 20 ml von 40% Procol in DMEM wieder aus.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 50 x g und 4 °C für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand, der abgestorbene Zellen enthält, und setzen Sie das Pellet in 20 ml lösung E wieder auf.
- Zentrifugenrohre bei 50 x g und 4 °C für 5 min. Den Überstand ansaugen und das Pellet in 10 ml Lösung E wieder aufhängen.
- Überprüfen Sie die primäre Hepatozytenausbeute und Lebensfähigkeit mit Trypanblaufärbung. Zählen Sie die Zellzahl mit einer Neubauer-Zellzählkammer und passen Sie die Zellkonzentration auf 3,75 x 105 lebensfähige Zellen/ml an. Halten Sie die Zellen auf Eis.
6. Anbau von primären Hepatozyten in 3D-Kollagen-Sandwiches
- Bereiten Sie Hepatozytenkulturmedium (HCM). Fügen Sie 15 l Glucagon (1 mg/ml), 15 l Hydrocortison (50 mg/ml) und 40 l Insulin (10 mg/ml) bis 50 ml komplettes Medium (DMEM, hohe Glukose, 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin) hinzu.
- Gleichmäßig 2 ml (5 x 105 Zellen/ml) lebensfähiger Primärhepatozyten in einer vorbeschichteten 3,5 cm Schale verteilen. Inkubieren Sie die Zellen mit 5%CO2 bei 37 °C für 3 h. Wichtig: Gleichmäßig verteilen Sie die Zellen, indem Sie die Schale in alle Richtungen kippen, kurz bevor Sie die Schale in den Brutkasten legen.
- Bereiten Sie neutralisiertes Kollagen I (100 l/3,5 cm Schale; d.h. ein ausreichendes Volumen für alle Gerichte wie oben beschrieben [Schritt 2.1]). Auf Eis bis zur Verwendung.
- Nach 3 h, entfernen Sie vorsichtig die mittleren und ungebundenen Zellen und fügen Sie 100 l neutralisiertes Kollagen I zu jeder 3,5 cm Schale, um die oberste Schicht von Kollagen-Sandwich auf Zellen zu bilden. Inkubieren Sie das Kollagen-Sandwich unter Standard-Zellkulturbedingungen (5%CO2 bei 37 °C) für 1 h. Nach einer 1 h Inkubation 2 ml HCM vorsichtig hinzufügen.
- Nach 24 h Kultur, ändern Sie das HCM-Medium für ein frisches.
- Kultur für 3-8 Tage, abhängig von der Bildung von Galle Canaliculi. Überprüfen Sie die Kultur jeden Tag unter dem Mikroskop (Abbildung 4). Ändern Sie den HCM jeden zweiten Tag.
7. Immunolabelierung von primären Hepatozyten in 3D-Kollagen-Sandwiches
- Entfernen Sie die Medien aus den Hepatozyten-Sandwiches, dann sorgfältig mit vorgewärmten PBS waschen. Fixieren Sie die Sandwichkulturen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
- Nach der Fixierung die Sandwiches 3x für 10 min in 2 ml PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T) waschen.
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 1 ml 0,1 m Glycin, 0,2% Triton X-100 in PBS bei RT für 1 h. 3x für 10 min in PBS-T waschen.
- Stören Sie die obere Kollagenschicht vorsichtig mit einer 10-L-Ladespitze, die mit einer Vakuumaspiration verbunden ist, um eine ausreichende Antikörperdurchdringung zu gewährleisten.
- Block mit 1 ml 5% BSA in PBS-T (d.h. Blocklösung) für 2 h. Inkubieren mit primär antikörpern verdünnt in Blockierlösung über Nacht bei 37 °C. 3x für 15 min in PBS-T waschen.
- Nach dem Waschen mit Sekundärantikörper bei 37 °C für 5 h inkubieren. 3x für 15 min in PBS-T waschen, gefolgt von 1x Waschen mit destilliertem H2O.
- Montieren Sie mit Anti-Fade-Montagemedien (siehe Tabelle der Materialien) für die Mikroskopie.
Representative Results
Maus primäre Hepatozyten wurden isoliert und in 3D-Kollagen-Sandwiches gesät. Bile Canaliculi zwischen zwei benachbarten Zellen begann sich innerhalb weniger Stunden nach der Aussaat zu bilden. Zellen bildeten Cluster und selbstorganisiert in einem ungefähr regelmäßigen Netzwerk von Gallenkanaliculi innerhalb von 1 Tag (Abbildung 4). Innerhalb von 3–6 Tagen wurden in der Regel Cluster von 5–10 Zellen beobachtet, wobei vollständig polarisierte Hepatozyten ein kanaliculares Netzwerk bildeten (Abbildung 4).
Behandlung von primären Maushepatozyten in 3D-Kollagen-Sandwiches mit Toxin (Ethanol) oder zytoskelettverändernden Medikamenten (z. B. Blebbistatin, Okadasäure) führte zu Veränderungen im Hepatozyten-Zytoskelett, Canaliculi-Breite, Form und Anzahl der Gallenkanaliculi, die durch Immunlabelierung mit einem Antikörper gegen Keratin 8 (das am häufigsten vorkommende Keratin in Hepatozyten), Phalloidin (Visualisierung von F-Aktin) und Antikörper gegen enge Sandel-Zonula-Occludens(ZO-1) veranschaulicht wurden. Abbildung 5).
Ethanol-Behandlung hatte nur eine milde Wirkung auf die Organisation von Keratin 8; jedoch erhöhte es die Tortuosität (wie von F-Actin Färbung gesehen) und Verteilung der Galle kanalicular breiten (Abbildung 5). Die Signalintensität der ZO-1-Färbung wurde in Ethanol-behandelten Gallenkanaliculi im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen verringert, was auf einen Verlust enger Verbindungen nach der Ethanolbehandlung hindeutet. Die Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität mit Blebbistatin wirkte sich signifikant auf die Form und Anzahl der Galle Canaliculi aus. Das regelmäßige kanalikuläre Netz wurde im Vergleich zu unbehandelten Hepatozyten zu ungeordnet geformten Gallenkanaliculi mit einer erhöhten Inzidenz von dicken abgerundeten Galle-Canaliculi anstelle dünner langer (wie im Histogramm der kanalikulären Breiten zu sehen) neu organisiert.
Zusätzlich wirkte sich die Behandlung mit okadainsäure (OA) hemmenden Phosphatasen stark auf die physikalischen Eigenschaften von Keratinen aus, wie zuvor gezeigt8,17. OA verändert die Löslichkeit von Keratin-Filamenten; So führte die Behandlung zu einer tiefgreifenden Reorganisation des Keratin-Netzes, das in große perinukleare Aggregate zerbrach. Sowohl F-Actin als auch das enge Knotenprotein ZO-1 wurden nicht in bestimmte Strukturen lokalisiert, was auf ein fast vollständiges Verschwinden der organisierten Gallenkanaliculi und einen vollständigen Verlust der Hepatozytenpolarität hindeutet. Die verbleibenden Gallenkanaliculi wurden im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen signifikant verengt, wie im Kanalbreitenhistogramm (Abbildung 5) zu sehen ist.
Um mikroskopische Beobachtungen von Veränderungen im Hepatozyten-Zytoskelett mit der hepatozellulären biochemischen Reaktion auf die Behandlung zu korrelieren, wurden im Protokoll auch Werte der Alanin-Aminotransferase (ALT) und aspartat-Transaminase (AST) (zwei Leberenzyme, die häufig als hepatozelluläre Verletzungsmarker verwendet werden) im Überstand aus den 3D-Kollagen-Sandwiches(Abbildung 6)18gemessen. Ethanol-Behandlung deutlich erhöhte die Niveaus von ALT und AST, was auf schwere hepatozelluläre Verletzungen. Blebbistatin Behandlung führte nicht zu erheblichen Veränderungen in ALT und AST-Spiegel im Vergleich zu Okadaic Säure Behandlung, die milde biochemische Veränderungen mit erhöhten NIVEAUS von ALT ausgelöst, aber keine Änderung der Niveaus der AST. So korrelieren biochemische Marker der hepatozellulären Verletzung, die in vitro vom Hepatozytenüberstand gemessen wurden, mit den zytoskelettalen Veränderungen, die durch Immunfärbung beobachtet werden.
Abbildung 1: Versuchseinrichtung. (A) Maus in einer Supine-Position fixiert, wird unter einem Sezieren Mikroskop vor der Operation platziert. Alle erforderlichen chirurgischen Instrumente werden auf ein Tablett gelegt. (B) Die Perfusionssuite während der Mausleberperfusion mit Silikonschläuchen, die das Reservoir mit warmem Puffer und der perfundierten Maus verbinden. (C) Schematische Darstellung von B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Öffnung der Bauchhöhle und Konservenbildung des IVC. Der Bauch wird mit einem V-förmigen Schnitt vom Schambereich bis zu den Vorderbeinen geöffnet. Die Haut wird über die Brust gefaltet, um die Bauchhöhle freizulegen und zu vergrößern. Um die IVC zu belichten, werden der Darm und der Dickdarm sorgfältig kauenal bewegt. (A, B) Vor der Cannulation des IVC sollten Leberlappen neu positioniert werden, indem sie mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen nach oben zum Zwerchfell gedrückt werden. Das IVC wird dann sorgfältig von umgebenden Geweben getrennt, und eine Seidennaht wird um das IVC in unmittelbarer Nähe der Leber platziert. Panel B stellt Schaltpläne der Bauchhöhle dar, die in Panel A dargestellt ist. Die Leberlappen, Darm, minderwertige Vena cava (IVC, rot), und Nähte sind angezeigt. (C) Heparin wird mit einer Insulinspritze (30 G Nadel im 45°-Winkel) in die Portalvene (PV, Pfeil) injiziert. (D) Um die Leber zu impfen, wird das IVC direkt neben der Leber (unterhalb der Naht) eingeschnitten. (E) Die Kanüle wird durch Binden von zwei chirurgischen Knoten eingeführt und mit Nähten gesichert. (F) Die Portalvene ist vollständig geschnitten, um einen freien Pufferabfluss zu ermöglichen und so eine Leberexpansion zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Leberbilder vor und nach der Perfusion. (A, B) Die konnolierte Leber wurde resektiert und 12 min bei einer Durchflussrate von 2,5 ml/min durchnässt. Beachten Sie die deutlich verfärbte Leber nach Perfusion (B) im Vergleich zur frisch resektierten Leber (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: 3D-Kollagen-Sandwichkultur von primären Maushepatozyten. Repräsentative Hellfeldbilder von Mausprimärhepatozyten, die für 1, 2 und 3 Tage unter 3D-Bedingungen kultiviert wurden. Es sollte beachtet werden, dass größere Cluster von hoch organisierten Zellen nach 3 Tagen in der Kultur gebildet werden. Geschachtelte Bereiche zeigen 3x vergrößerte Bilder. Pfeilspitzen zeigen die Galle Canaliculi. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bewertung der morphologischen Reaktion auf toxischen Stress durch immunfluoreszierende Mikroskopie. Primäre Maushepatozyten, die in 3D-Kollagen-Sandwiches kultiviert wurden, wurden am 3. Tag der Kultur mit Toxinen (Ethanol, Blebbistatin oder Okadasäure) behandelt. Feste Zellen wurden gefärbt, um zytoskelettale Komponenten zu visualisieren: Keratin 8 (grün), F-Actin (rot) und Zonula-Okkludens-1 (ZO-1, Magenta) durch Immunfluoreszenz. Die toxische Behandlung führte zur Desorganisation der visualisierten Zytoskelettkomponenten, und es reduzierte die Anzahl und erhöhte die Tortuosität der Galle Canaliculi. Kanalförmige Breiten wurden sowohl in unbehandelten als auch in behandelten Hepatozyten gemessen und werden als Histogramme der Breitenverteilung dargestellt. Pfeilspitzen zeigen die Galle Canaliculi. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Biochemische Analyse der Reaktion von 3D-Hepatozyten-Kollagen-Sandwiches auf toxische Verletzungen in vitro. ALT und AST, etablierte Marker für hepatozelluläre Verletzungen, wurden in Überstand aus 3D-Hepatozytenkollagen-Sandwiches gemessen, die mit Toxinen (Ethanol, Blebbistatin und Okadasäure) behandelt wurden. ALT und AST wurden in behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten erhöht. Die Daten werden als arithmetische Mittel -SEM gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lagerlösung A (10x) | |
| Reagenz | Endkonzentration (g/Liter) |
| Nacl | 80 |
| Kcl | 4 |
| MgSO4bei 7H2O | 1.97 |
| Na2HPO4bei 2H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
Tabelle 1: Lagerlösung Ein Rezept.
| Lagerlösung B (10x) | |
| Reagenz | Endkonzentration (g/Liter) |
| Nacl | 69 |
| Kcl | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO4bei 7H2O | 2.94 |
| CaCl2 | 2.772 |
Tabelle 2: Lagerlösung B Rezept.
| Lösung C | |
| Reagenz | |
| Lagerlösung A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1094 g |
| EGTA | 0,0095 g |
| dH2O | bis 50 ml |
Tabelle 3: Lagerlösung C Rezept.
| Lösung D | |
| Reagenz | |
| Lagerlösung A (10x) | 3 mL |
| NaHCO3 | 0,065 g |
| CaCl2 | 0,0125 g |
| dH2O | bis 30 ml |
Tabelle 4: Lagerlösung D Rezept.
| Lösung E | |
| Reagenz | |
| Lagerlösung B (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1 g |
| Glukose | 0,045 g |
| dH2O | bis 50 ml |
Tabelle 5: Lagerlösung E Rezept.
Discussion
Die Verwendung von Mausprimärhepatozytenkulturen ist wichtig für In-vitro-Studien, um die Signalprozesse besser zu verstehen, die bei der Etablierung von Hepatozytenpolarisation, richtiger kanalikulärer Strukturbildung und Gallensekretion beteiligt sind. Die Herausforderungen in der Isolation und der Langzeitkultur der Mausprimärhepatozyten in der 2D-Kultur haben die Erfindung mehrerer technischer Ansätze mit erhöhter Isolationswirkung und Langlebigkeit isolierter Zellen mit jeweils mehreren Vorteilen und Nachteile. Es ist heute weithin anerkannt, dass 2D-Kulturen von primären Hepatozyten nur eine begrenzte Anzahl von Attributen der Leberbiologie für einen kurzen Zeitraum imitieren. So ersetzt der 3D-Anbau in einer Kollagen-Sandwich-Anordnung weitgehend die 2D-Bedingungen, insbesondere wenn er sich auf die Funktion des Zytoskeletts in der Leberbiologie konzentriert (z. B. toxische Arzneimitteleffekte oder räumliche Organisation des Gallentransports).
Seit den 1980er Jahren wurden mehrere Protokolle zur Isolierung von Maushepatozyten mit verschiedenen Modifikationen beschrieben. Der zweistufige Collagenase-Perfusionsansatz ist in vielen Laboratorien weit verbreitet. Die Zugabe von Gradientenzentrifugation in das Isolationsprotokoll ermöglicht die Entfernung abgestorbener Zellen19,20 und erhöht die Anzahl lebensfähiger Zellen signifikant (hier routinemäßig auf 93 %). Auch wenn dieser Schritt die Handhabungszeit der Zellen verlängert und zu reduzierten Zellzahlen21führt, wird dieser Schritt in der 3D-Kollagen-Sandwichkultur für die richtige Gallenkanalnetzbildung als notwendig angesehen. Darüber hinaus ist es wichtiger, während der Perfusionsschritte schnell und genau vorzugehen, was die Zeit verkürzt, in der die Zellen behandelt werden.
Weitere wichtige Faktoren, die die Lebensfähigkeit der Zellen und ihre Fähigkeit, kanalikuläre Netzwerke in 3D zu bilden, erhöhen, sind die Verwendung von frisch zubereiteten Lösungen und die Vermeidung von Blasen während der Perfusion. Daher sollten Lösungen am Tag der Hepatozytenisolation der Maus vorbereitet werden, und die peristaltische Pumpe und Schläuche sollten beim Lösungswechsel überprüft werden. Wenn das Protokoll genau befolgt wird, sollte die Isolierung von primären Hepatozyten mit einer hohen Ausbeute an lebensfähigen Zellen erfolgreich sein.
Ein weiterer kritischer Faktor in der langfristigen 3D-Hepatozytenkultur ist die anfängliche Quelle von primären Hepatozyten, die verwendet werden. Es ist wichtig, Tiere zu verwenden, die 8-12 Wochen alt sind, die als optimale Spender von Hepatozyten dienen. Die Verwendung von Hepatozyten von älteren Tieren war in der Langzeitkultur nicht so erfolgreich, da diese Hepatozyten ihre Morphologie häufiger veränderten, depolarisierten und aufhörten, kanalikuläre Netzwerke zu bilden. Auch die Beschichtung von Hepatozyten auf richtig neutralisiertem Kollagengel aus relativ hochkonzentrierter Lösung ist ein wichtiger Schritt. In den meisten Protokollen werden Konzentrationen von etwa 1 mg/ml verwendet. Nach vielen Optimierungen ist eine Konzentration von 1,5 mg/ml optimal für den langfristigen Hepatozytenanbau und versorgt hochorganisierte Hepatozyten mit gebildeten Gallenkanaliculi.
Dieses einfach zu befolgenden Protokoll ermöglicht die langfristige Kultivierung von primären Maushepatozyten. Repräsentative Ergebnisse zeigen ein breites Anwendungsspektrum für 3D-kultivierte primäre Maushepatozyten bei der Untersuchung der Rolle von zytoskelettalen Komponenten bei der Gallenkanaliculi-Bildung.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Grant Agency der Tschechischen Republik (18-02699S) unterstützt; die Grant Agency des Gesundheitsministeriums der Tschechischen Republik (17-31538A); das Institutionelle Forschungsprojekt der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (RVO 68378050) und MEYS CR-Projekte (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 und OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Karlsuniversität (persönliches Stipendium für K.K.) und ein Operationelles Programm Prag–Wettbewerbsfähigkeit (CZ.2.16/3.1.00/21547). Wir würdigen die Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tschechische Republik (unterstützte MEYS CR-Projekte LM2015062 und LO1419) für die Unterstützung bei der vorgestellten Mikroskopie-Bildgebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
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