यहां प्रस्तुत एक संशोधित कोलेजेनेज़ परफ्यूजन तकनीक का उपयोग करके वयस्क माउस यकृत से माउस हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है। इसके अलावा वर्णित एक 3 डी कोलेजन सैंडविच सेटिंग में हेपेटोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति के साथ-साथ पित्त कैनालिकुलर गठन और उपचार के प्रति इसकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए साइटोस्केलेटल घटकों की इम्यूनोलेबलिंग है।
हेपेटोसाइट्स अपने मेटाबोलिक फ़ंक्शन के लिए जिम्मेदार यकृत की केंद्रीय कोशिकाएं हैं। जैसे, वे एक विशिष्ट ध्रुवीकृत एपिथेलियम बनाते हैं, जिसमें दो या अधिक हेपेटोसाइट्स एक पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क बनाने के लिए एपिकल झिल्ली का योगदान करते हैं जिसके माध्यम से पित्त को स्रावित किया जाता है। हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण सही कनभ्युलर गठन के लिए आवश्यक है और हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन, सेल-सेल संपर्कों और बाह्युलर मैट्रिक्स के बीच बातचीत पर निर्भर करता है। कैनालकुली गठन में हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन की भागीदारी के विट्रो अध्ययन और रोग स्थितियों के प्रति इसकी प्रतिक्रिया सेल संस्कृति की कमी से विकलांग हैं, जो वीवो में कैनालकुली नेटवर्क संरचना के समान होगी। यहां वर्णित एक संशोधित कोलेजेनेस परफ्यूजन तकनीक का उपयोग करके वयस्क माउस जिगर से माउस हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है। इसके अलावा वर्णित एक 3 डी कोलेजन सैंडविच सेटिंग में संस्कृति का उत्पादन है, जिसका उपयोग पित्त कैनेलिकुलर गठन और विट्रो में उपचार के प्रति इसकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए साइटोस्केलेटल घटकों के इम्यूनोलेबलिंग के लिए किया जाता है। यह दिखाया गया है कि हेपेटोसाइट 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृतियां विषाक्त पदार्थों (इथेनॉल) या ऐक्टिन साइटोस्केलेटन बदलने वाली दवाओं (जैसे, ब्लेबिस्टिन) के उपचार ों का जवाब देती हैं और पित्त कैनालकुली गठन और कार्य के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में काम करती हैं।
हेपेटोसाइट्स, जिगर की केंद्रीय सेलुलर संरचनाएं जो इसके मेटाबोलिक कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं, विशिष्ट ध्रुवीकृत एपिथेलियल कोशिकाएं हैं। उनके ध्रुवीकरण, जन्म के तुरंत बाद स्तनधारियों में प्रदर्शित होने, पित्त कनालिकुलर नेटवर्क के गठन में परिणाम है और उचित पित्त स्राव के लिए आवश्यक है । हेपेटोसाइट्स की एपिकल झिल्ली सामूहिक रूप से पित्त कैनालकुली बनाती है, जबकि बेसल झिल्ली साइनसॉइड के एंडोथेलियम के संपर्क में रहती हैं। हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण के नुकसान से पित्त ट्रांसपोर्टरों का पुनर्वितरण होता है और इसके परिणामस्वरूप जिगर (यानी, कोलेस्टेसिस) में पित्त प्रतिधारण से जुड़ी रोग प्रक्रियाएं होती हैं।
हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण की स्थापना और रखरखाव और पित्त कैनालकुली के विकास के लिए जटिल तंत्र की आवश्यकता होती है। अंतर्निहित प्रक्रियाएं हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन, सेल-सेल संपर्कों और बाह्युलर मैट्रिक्स1के साथ बातचीत के बीच सामूहिक परस्पर क्रिया पर निर्भर करती हैं। हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन में सभी तीन फिलामेंट नेटवर्क, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन, माइक्रोट्यूबबुल और इंटरमीडिएट फिलामेंट्स होते हैं, जो कैनालिकुलर गठन के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान करते हैं। पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क के उत्थान और रखरखाव में साइटोस्केलेटल घटकों की अंतर भूमिका पहले 3 डी कोलेजन-सैंडविच हेपेटोसाइट संस्कृतियों2में विट्रो में सचित्र की गई है।
कैनेलीकुलस जनरेशन2के स्थलों पर हेपेटोसाइट झिल्ली ध्रुवीकरण के प्रारंभिक चरणों के दौरान ऐक्टिन माइक्रोफिलामेंट्स और माइक्रोट्यूबबुल महत्वपूर्ण होते हैं । ऐक्टिन साइटोस्केलेटन पित्त कैनालकुली की संरचना और कार्य को स्थापित करता है, झिल्ली से जुड़े माइक्रोफिलामेंट्स और परिस्थितिजन्य अंगूठी बनाता है, इस प्रकार कैनालिकुलर वास्तुकला का समर्थन करता है और ऐक्टिन साइटोस्केलेटन को तंग में डालता है और जंक्शनों का पालन करता है3। ऐक्टिन साइटोस्केलेटन के बाहर केराटिन इंटरमीडिएट फिलामेंट्स की अंगूठी और कनवंकुलर संरचना3को स्थिर करती है ।
पित्त कैनालकुली वास्तुकला के संगठन में हेपेटोसाइट जंक्शनल परिसरों में प्रोटीन का महत्व कई नॉक-आउट माउस मॉडल में अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, जो चूहों में विकृत कैनालकुली दिखाते हैं, जो तंग और/या अनुयायियों जंक्शनल प्रोटीन4,5,6की कमी है । पालन जंक्शन प्रोटीन α-catenin के विलोपन हेपेटोसाइट ऐक्टिन साइटोस्केलेटन के विघटन के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाया गया है, पित्त कैनाकुलर ल्यूमेंस के फैलाव, टपका हुआ तंग जंक्शनों, और प्रभावी ढंग से एक कोलेस्टैटिक फेनोटाइप4के लिए । इसके अलावा, इन विट्रो अध्ययनों ने हेपेटोसेलुलर एपिकल ल्यूमेन और प्रोटीन तस्करी7के पुनर्मॉडलिंग में जंक्शन घटकों ई-कैथेरिन और ए-कैटेनिन के पालन के महत्व को दर्शाया है।
हड़ताली रूप से, साइटोस्केलेटन क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन प्लेक्टिन का एब्लेशन, जो प्रमुख केराटिन आयोजक है, ने ऐक्टिन साइटोस्केलेटन8से जुड़े लोगों के बराबर फेनोटाइप का खुलासा किया है। यह कनालिकुलर संरचना के समर्थन में केराटिन मध्यवर्ती तंतुओं की एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देता है। 3 डी हेपेटोसाइट कोलेजन सैंडविच का उपयोग करने वाले इन विट्रो अध्ययनों में पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क गठन9में एएमपी-सक्रिय प्रोटीन किनेज और इसके अपस्ट्रीम एक्टिवेटर एलकेबी 1 के महत्व को भी दर्शाया गया है। इसके बाद वीवो स्टडीज10,11तक इन निष्कर्षों की पुष्टि हुई . इस प्रकार, यह स्पष्ट हो गया है कि हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण, उचित कंकैलिकुलर नेटवर्क गठन और पित्त स्राव की स्थापना में शामिल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं की समझ को आगे बढ़ाने के लिए इन विट्रो अध्ययन आवश्यक हैं।
पित्त कैनाकुलर गठन से जुड़ी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में एक बड़ी चुनौती और विट्रो में रोग स्थितियों के प्रति इसकी प्रतिक्रिया एक कोशिका संस्कृति की स्थितियों का उपयोग कर रही है जो वीवो12की स्थिति के समान है । हौसले से अलग प्राथमिक हेपेटोसाइट्स ध्रुवीकृत नहीं हैं; इस प्रकार, वे 2डी संस्कृति स्थितियों में अपने कार्य, आकृति विज्ञान और कार्यात्मक पित्त कैनालकुली खो देते हैं (उदाहरण के लिए, जीन विनियमन, ध्रुवीकरण और डी-विभेदन13,14,15)में परिवर्तन। इस तथ्य के बावजूद, ताजा अलग हेपेटोसाइट्स सबसे बारीकी से वीवो में जिगर की प्रकृति कोप्रतिबिंबित, जिगर से व्युत्पन्न सेल लाइनों16के विपरीत । यद्यपि उनका उपयोग अतीत में किया गया है, फिर भी अमर कोशिका रेखाएं हेपेटोसाइट्स की एपिथेलियाल जैसी विशेषता आकृति विज्ञान नहीं करती हैं, और इन कोशिकाओं द्वारा गठित पित्त कैनेलिकुलर ल्यूमेंस लिवर कैनालकुली खराब7के समान होते हैं। हाल ही में, चूहों और चूहों दोनों से प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की 3 डी संस्कृतियां विट्रो9में पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क गठन में शामिल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बन गई हैं। कोलेजन की दो परतों के बीच सुसंस्कृत प्राथमिक हेपेटोसाइट्स (जिसे 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृति के रूप में जाना जाता है) कई दिनों में फिर से ध्रुवीकरण कर सकता है। 3 डी कोलेजन सैंडविच में माउस हेपेटोसाइट्स को संचरित करते समय आवश्यक उच्च तकनीकी मांगों के कारण, यहां हम पित्त कैनेलिकुलर गठन के दौरान साइटोस्केलेटल घटकों की भागीदारी की विशेषता के लिए 3डी कोलेजन सैंडविच में एम्बेडेड माउस हेपेटोसाइट्स को अलग करने, खेती करने और इम्यूनोलेबल माउस हेपेटोसाइट्स को इम्मुनोलेबल माउस हेपेटोसाइट्स करने के लिए एक जटिल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट संस्कृतियों का उपयोग इन विट्रो अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण है ताकि हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण, उचित कंकैलिकुलर संरचना गठन और पित्त स्राव की स्थापना में शामिल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझा जा सके। 2 डी संस्कृति में माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति में चुनौतियों ने कई तकनीकी दृष्टिकोणों के आविष्कार को प्रेरित किया है, जिसमें अलगाव की प्रभावऔर अलग-थलग कोशिकाओं की दीर्घायु होती है, प्रत्येक कई फायदे के साथ और नुकसान. अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की 2डी संस्कृतियां थोड़े समय के लिए यकृत जीव विज्ञान के गुणों की केवल सीमित संख्या की नकल करती हैं। इस प्रकार, कोलेजन सैंडविच व्यवस्था में 3 डी की खेती व्यापक रूप से 2डी स्थितियों की जगह ले रही है, खासकर जब यकृत जीव विज्ञान में साइटोस्केलेटन के कार्य पर ध्यान केंद्रित किया जाता है (उदाहरण के लिए, विषाक्त दवा प्रभाव या पित्त परिवहन का स्थानिक संगठन)।
1 9 80 के दशक से, विभिन्न संशोधनों के साथ माउस हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए कई प्रोटोकॉल वर्णित किए गए हैं। दो कदम कोलेजेनेज़ परफ्यूजन दृष्टिकोण व्यापक रूप से कई प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है । आइसोलेशन प्रोटोकॉल में ढाल केंद्रीकरण के अलावा मृत कोशिकाओं को हटाने की अनुमति देताहै 19,20 और काफी व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है (यहां, नियमित रूप से ~93%)। हालांकि यह कदम कोशिकाओं के हैंडलिंग समय और कम सेल संख्या21में परिणाम बढ़ाता है, इस कदम को उचित पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क गठन के लिए 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृति में आवश्यक के रूप में देखा जाता है। इसके अतिरिक्त, परफ्यूजन चरणों के दौरान जल्दी और सटीक रूप से आगे बढ़ना अधिक महत्वपूर्ण है, जो कोशिकाओं को संभालने के समय को छोटा करता है।
कोशिकाओं की व्यवहार्यता बढ़ाने वाले अन्य महत्वपूर्ण कारक और 3 डी में कंएलिकुलर नेटवर्क बनाने की उनकी क्षमता ताजा तैयार समाधानों और परफ्यूजन के दौरान बुलबुले से बचने का उपयोग है। इसलिए, माउस हेपेटोसाइट अलगाव के दिन समाधान तैयार किए जाने चाहिए, और समाधान बदलते समय पेरिस्टैटिक पंप और ट्यूबिंग की जांच की जानी चाहिए। यदि प्रोटोकॉल का बारीकी से पालन किया जाता है, तो प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का अलगाव व्यवहार्य कोशिकाओं की उच्च उपज के साथ सफल होना चाहिए।
दीर्घकालिक 3 डी हेपेटोसाइट संस्कृति में एक और महत्वपूर्ण कारक प्राथमिक हेपेटोसाइट का प्रारंभिक स्रोत है जिसका उपयोग किया जाता है। 8-12 सप्ताह पुराने जानवरों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जो हेपेटोसाइट्स के इष्टतम दानदाताओं के रूप में काम करते हैं। पुराने जानवरों से हेपेटोसाइट्स का उपयोग दीर्घकालिक संस्कृति में उतना सफल नहीं था, क्योंकि इन हेपेटोसाइट्स ने अपनी आकृति विज्ञान को अधिक बार बदल दिया, ध्रुवीकृत किया, और कैनालिकुलर नेटवर्क बनाना बंद कर दिया। इसके अलावा, अपेक्षाकृत अत्यधिक केंद्रित समाधान से गठित ठीक से निष्प्रभावी कोलेजन जेल पर हेपेटोसाइट्स चढ़ाना एक महत्वपूर्ण कदम है। अधिकांश प्रोटोकॉल में, लगभग 1 मिलीग्राम/mL की सांद्रता का उपयोग किया जाता है। कई अनुकूलन के बाद, 1.5 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता दीर्घकालिक हेपेटोसाइट खेती के लिए इष्टतम है और गठित पित्त कैनिकुली के साथ अत्यधिक संगठित हेपेटोसाइट प्रदान करती है।
यह आसान-से-पालन प्रोटोकॉल प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स की दीर्घकालिक खेती की अनुमति देता है। प्रतिनिधि परिणाम पित्त कैनालकुली गठन में साइटोस्केलेटल घटकों की भूमिका का अध्ययन करते समय 3डी सुसंस्कृत प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स के लिए उपयोग का एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को चेक गणराज्य की ग्रांट एजेंसी (18-02699S) ने समर्थन दिया; चेक गणराज्य के स्वास्थ्य मंत्रालय की अनुदान एजेंसी (17-31538A); चेक एकेडमी ऑफ साइंसेज (आरवीओ 68378050) और एमवाईएस सीआर परियोजनाओं (LQ1604 एनपीयू II) की संस्थागत अनुसंधान परियोजना, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395, और OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/0.0/0.0.0/16_013/0001775); चार्ल्स विश्वविद्यालय (के.के. को व्यक्तिगत वजीफा), और एक परिचालन कार्यक्रम प्राग-प्रतिस्पर्धा परियोजना (CZ.2.16/3.1.00/21547) । हम प्रस्तुत माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ समर्थन के लिए लाइट माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, आईएमजी कैस, प्राग, चेक गणराज्य (समर्थित एमवाईएस सीआर परियोजनाओं LM2015062 और LO1419) को स्वीकार करते हैं।
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |