Presentato qui è un protocollo per l’isolamento degli epatociti del topo dai fegati di topo adulti utilizzando una tecnica di perfusione di collagenasi modificata. È stata inoltre descritta la cultura a lungo termine degli epatociti in un sandwich di collagene 3D, nonché l’immunolabeling dei componenti citoscheletrici per studiare la formazione biliare e la sua risposta al trattamento.
Gli epatociti sono le cellule centrali del fegato responsabili della sua funzione metabolica. Come tali, formano un epitelio polarizzato in modo univoco, in cui due o più epatociti contribuiscono alle membrane apicali per formare una rete biliare attraverso la quale la bile viene secreta. La polarizzazione dell’epatocite è essenziale per la corretta formazione canalicolare e dipende dalle interazioni tra il citoscheletro epatocite, i contatti delle cellule cellulari e la matrice extracellulare. Gli studi in vitro sul coinvolgimento dei citoscheletri epatociti nella formazione dei canalicoli e la sua risposta alle situazioni patologiche sono ostacolati dalla mancanza di coltura cellulare, che assomiglierebbe molto alla struttura della rete canaliculi in vivo. Descritto qui è un protocollo per l’isolamento degli epatociti del topo dal fegato di topo adulto utilizzando una tecnica di perfusione collagenase modificata. Viene inoltre descritta la produzione di coltura in un sandwich di collagene 3D, che viene utilizzato per l’immunoetichettatura dei componenti citoscheletrici per studiare la formazione biliare e la sua risposta ai trattamenti in vitro. È dimostrato che le colture di sandwich di collagene 3D epatocite rispondono ai trattamenti con tossine (etanolo) o actinoscheletro alterare i farmaci (ad esempio, blebbistatin) e servono come strumento prezioso per gli studi in vitro della formazione e della funzione dei canalicelli.
Gli epatociti, le strutture cellulari centrali del fegato che sono responsabili delle sue funzioni metaboliche, sono cellule epiteliali polarizzate in modo univoco. La loro polarizzazione, che appare nei mammiferi poco dopo la nascita, si traduce nella formazione della rete canalicolare biliare ed è essenziale per una corretta secrezione. Le membrane apicaliche degli epatociti formano collettivamente bilicanali, mentre le membrane basali rimangono in contatto con l’endotelio dei sinusoidi. La perdita di polarizzazione degli epatociti porta alla ridistribuzione dei trasportatori di bile e si traduce in processi patologici connessi con la ritenzione biliare nel fegato (cioè la colestasi).
L’istituzione e il mantenimento della polarizzazione degli epatociti e lo sviluppo di canalicolai biliari comportano meccanismi complessi. I processi sottostanti dipendono dall’interazione collettiva tra il citoscheletro epatocito, i contatti cellulare e le interazioni con la matrice extracellulare1. Il citoscheletro epatocite è costituito da tutte e tre le reti di filamento, il citoscheletro actina, i microtubuli e i filamenti intermedi, che forniscono supporto strutturale per la formazione canalica. Il ruolo differenziale dei componenti citoscheletrici nella rigenerazione e nella manutenzione delle reti biliacolari è stato precedentemente illustrato in vitro nelle colture epatite 3D collagene-sandwich2.
Microfilamenti di Actin e microtubuli sono importanti durante le fasi iniziali della polarizzazione della membrana epatocitica nei siti del canaliculus generazione2. Il citoscheletro actin stabilisce la struttura e la funzione dei bilecanaliculi, formando microfilamenti associati alla membrana e l’anello circonferenziale, sostenendo così l’architettura canalicolare e inserendo il citoscheletro actino nelle giunzioni strette e aderenti3. L’anello di filamenti intermedi di cheratina al di fuori del citoscheletro actina stabilizza ulteriormente la struttura canalicolare3.
L’importanza delle proteine nei complessi giunzionali epatociti nell’organizzazione dell’architettura biliare canaliculi è stata ben documentata in diversi modelli murini knock-out, che mostrano canaliculi distorti nei topi privi di proteine junctionali sia strette che/o aderenti4,5,6. È stato dimostrato che la delezione della proteina di giunzione aderisce a ondosi di catena di lavoro per portare alla disorganizzazione del citoscheletro dell’epatocito actin, alla dilatazione dei lumen biliari, alle giunzioni strette che perdono, e in effetti a un fenotipo colestatico4. Inoltre, gli studi in vitro hanno dimostrato l’importanza di aderire componenti giunzione E-cadherin e z-catenina nel rimodellamento del lumame apicale epatocellulare e del traffico di proteine7.
Sorprendentemente, l’ablazione del citoscheletro che attraversa la pletcina proteica, che è il principale organizzatore della cheratina, ha rivelato fenotipi paragonabili a quelli collegati al citoscheletro actina8. Questo suggerisce un ruolo critico dei filamenti intermedi di cheratina nel sostenere la struttura canalicolare. Gli studi in vitro che utilizzano sandwich di collagene epatociti 3D hanno anche dimostrato l’importanza della chinasi proteica attivata da AMP e del suo attivatore a monte LKB1 nella formazione della rete biliare della rete canalicolare9. Questi risultati sono stati poi ulteriormente confermati da successivi studi in vivo10,11. Così, è diventato chiaro che gli studi in vitro sono necessari per approfondire la comprensione dei processi di segnalazione coinvolti nella creazione della polarizzazione degli epatociti, nella corretta formazione della rete canalica e nella secrezione della bile.
Una sfida importante nello studio dei processi legati alla formazione canaliculare della bile e della sua risposta alle situazioni patologiche in vitro è l’uso di condizioni di coltura cellulare che assomigliano molto alla situazione in vivo12. Gli epatociti primari appena isolati non sono polarizzati; così, perdono la loro funzione, morfologia, e bile canaliculi funzionale in condizioni di coltura 2D (ad esempio, cambiamenti nella regolazione genica, polarizzazione, e de-differenziazione13,14,15). Nonostante questo fatto, gli epatociti appena isolati riflettono più da vicino la natura del fegato in vivo, a differenza delle linee cellulari derivate dal fegato16. Anche se sono state utilizzate in passato, le linee cellulari immortalate non esercitano la morfologia caratteristica epiteliale degli epatociti, e i canalghi canalicani canaliculari formati da queste cellule assomigliano al fegato scarsamente7. Recentemente, le colture 3D di etutociti primari, sia da topi che da ratti, sono diventate uno strumento utile per studiare i processi coinvolti nella formazione di reti biliari in vitro9. Gli epatociti primari coltivati tra due strati di collagene (indicati come una cultura di sandwich di collagene 3D) possono ripolarsi in diversi giorni. A causa delle elevate esigenze tecniche richieste durante la coltura degli epatociti del topo in sandwich di collagene 3D, qui presentiamo un protocollo complesso per isolare, coltivare e immunoetichettare gli epatociti del topo incorporati nei panini di collagene 3D al fine di caratterizzare il coinvolgimento di componenti biliareli durante la formazione del canale.
L’uso di colture di epatociti primari epatociti primari e patociti topi è importante per gli studi in vitro per comprendere meglio i processi di segnalazione coinvolti nella creazione della polarizzazione degli epatociti, della corretta formazione della struttura canalica e della secrezione della bile. Le sfide nell’isolamento e nella coltura a lungo termine degli epatociti primari del topo nella cultura 2D hanno guidato l’invenzione di diversi approcci tecnici con una maggiore efficacia di isolamento e longevità delle cellule isolate, ognuno con diversi vantaggi e Svantaggi. È ormai ampiamente accettato che le colture 2D degli epatociti primari imitano solo un numero limitato di attributi della biologia epatica per un breve periodo di tempo. Pertanto, la coltivazione 3D in una disposizione sandwich di collagene sta ampiamente sostituendo le condizioni 2D, in particolare quando si concentra sulla funzione del citoscheletro nella biologia epatica (ad esempio, effetti di droga tossici o organizzazione spaziale del trasporto biliare).
A partire dagli anni ’80, sono stati descritti diversi protocolli per l’isolamento degli epatociti del topo con varie modifiche. L’approccio a due fasi della perfusione di collagenasi è diventato ampiamente utilizzato in molti laboratori. L’aggiunta della centrifugazione del gradiente nel protocollo di isolamento consente la rimozione delle cellule morte19,20 e aumenta significativamente il numero di cellule vitali (qui, regolarmente al 93%). Anche se questo passo estende il tempo di gestione delle cellule e si traduce in numeri di cellule ridotte21, questo passaggio è visto come necessario nella coltura panino di collagene 3D per una corretta formazione della rete biliare. Inoltre, è più importante procedere rapidamente e con precisione durante le fasi di perfusione, il che riduce il tempo di gestione delle cellule.
Altri fattori importanti che aumentano la vitalità delle cellule e la loro capacità di formare reti cocanacolari in 3D è l’uso di soluzioni appena preparate ed evitare bolle durante la perfusione. Pertanto, le soluzioni devono essere preparate il giorno dell’isolamento degli epatociti del topo, e la pompa peristaltica e il tubo devono essere controllati quando si cambiano le soluzioni. Se il protocollo è seguito da vicino, l’isolamento degli equaliciti primari dovrebbe avere successo con un alto rendimento di cellule vitali.
Un altro fattore critico nella cultura degli epatociti 3D a lungo termine è la fonte iniziale di epatociti primari che vengono utilizzati. È importante utilizzare animali di età che hanno 8-12 settimane, che servono come donatori ottimali di epatociti. L’uso di epatociti da animali più anziani non ebbe lo stesso successo nella cultura a lungo termine, poiché questi epatociti cambiarono la loro morfologia più spesso, si depolarizzarono e cessarono di formare reti collerie. Inoltre, la placcatura degli epatociti su gel di collagene correttamente neutralizzati formata da una soluzione relativamente altamente concentrata è un passo vitale. Nella maggior parte dei protocolli, vengono utilizzate concentrazioni di circa 1 mg/mL. Dopo molte ottimizzazioni, una concentrazione di 1,5 mg/mL è ottimale per la coltivazione di epatociti a lungo termine e fornisce epatociti altamente organizzati con canalicolo biliari formati.
Questo protocollo facile da seguire permette la coltivazione a lungo termine di epatociti primari del topo. I risultati rappresentativi dimostrano un ampio spettro di utilizzo per gli epotociti del topo primario coltivato in 3D quando studiano il ruolo delle componenti citoscheletriche nella formazione di canalicelli bilicolari.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dall’Agenzia Grant della Repubblica Ceca (18-02699S); l’Agenzia Grant del Ministero della Sanità della Repubblica Ceca (17-31538A); il Progetto di Ricerca Istituzionale dell’Accademia Ceca delle Scienze (RVO 68378050) e i progetti MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI C.1.05/2.1.00/19.0395 e OP RDE C.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Charles University (stipend a K.K.) e un progetto di programma operativo Praga-Competitività (C.2.16/3.1.00/21547). Riconosciamo il Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Repubblica Ceca (supportati progetti MEYS CR LM2015062 e LO1419) per il supporto con l’imaging a microscopia presentato.
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |