Summary

Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine

Published: November 27, 2019
doi:

Summary

Les épingles à cheveux et les boucles d’ARN peuvent fonctionner comme amorces pour la transcription inverse (RT) en l’absence des amorces séquence-spécifiques, interférant avec l’étude des transcriptions antisense de chevauchement. Nous avons mis au point une technique capable d’identifier l’ARN spécifique aux brins, et nous l’avons utilisée pour étudier la protéine antisens HIV-1 ASP.

Abstract

Dans les rétrovirus, la transcription d’antisense a été décrite dans le type 1 de virus d’immunodéficience humaine (HIV-1) et le virus T-lymphotropic humain 1 (HTLV-1). Dans LE VIH-1, le gène ASP de protéine antisens est situé sur le brin négatif de l’env, dans le cadre de lecture -2, couvrant la jonction gp120/gp41. Dans le sens de l’orientation, la fin de 3′ du cadre de lecture ouverte ASP chevauche avec les régions hypervariables gp120 V4 et V5. L’étude de l’ARN ASP a été contrecarrée par un phénomène connu sous le nom de RT-auto-amorçage, par lequel les structures secondaires d’ARN ont la capacité de premier rinçage RT en l’absence de l’amorce spécifique, générant des cDNAs non spécifiques. L’utilisation combinée de la dénaturation à haut ARN avec des amorces inverses biotinylated dans la réaction de RT, avec la purification d’affinité de l’ADNc sur les perles magnétiques streptavidin-enduites, nous a permis d’amplifier sélectivement l’ARN d’ASP dans les cellules De T CD4MD dérivées des individus infectés par HIV-1. Notre méthode est relativement peu coûteuse, simple à exécuter, très fiable et facilement reproductible. À cet égard, il représente un outil puissant pour l’étude de la transcription antisens non seulement dans le VIH-1, mais aussi dans d’autres systèmes biologiques.

Introduction

Le gène de protéine antisens (ASP) est un cadre de lecture ouvert (ORF) situé sur le brin négatif du gène de l’enveloppe du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) (env), couvrant la jonction gp120/gp411. Au cours des 30 dernières années, plusieurs rapports ont montré que le gène DUVIH est en effet transcrit et traduit2,3,4,5,6,7,8,9. Bien que les transcriptions antisense d’ASP aient été entièrement caractérisées in vitro,jusqu’à récemment l’information au sujet de la production réelle de l’ARN d’ASP dans les patients était toujours manquante.

La séquence de l’ASP est inversée et complémentaire à env. Cela représente un obstacle majeur lorsque vous essayez de détecter les transcriptions pour ASP. Les méthodes standard de réaction en chaîne de transcription-polymérase inverse (RT-PCR) utilisent des amorces antisens spécifiques aux gènes pour synthétiser les ANN complémentaires (CDNA) de la polarité droite. Cette approche, cependant, ne permet pas de déterminer l’orientation (sens ou antisens) du modèle initial d’ARN, puisque les épingles à cheveux ou les boucles d’ARN peuvent primer RT dans les deux directions en l’absence des amorces10,un phénomène connu sous le nom d’auto-amorçage de RT. La plupart des chercheurs de l’ASP écartent le problème de l’auto-amorçage de RT à l’aide d’amorces étiquetées avec des séquences qui ne sont pas liées au VIH-111,12. Toutefois, cette stratégie n’élimine pas l’occurrence du phénomène et peut entraîner un report potentiel des ADCD non spécifiques dans le PCR11.

Nous avons récemment mis au point un nouvel essai RT-PCR spécifique au brin pour l’étude de l’ARN antisens et nous l’avons utilisé pour la détection de l’ARN ASP dans une cohorte de six patients infectés par le VIH, comme le montre le tableau 1. La procédure décrite ci-dessous a déjà été publiée par Antonio Mancarella et coll.13. Dans notre protocole, nous évitons la production de CDNA non spécifiques par une double approche. Tout d’abord, nous éliminons les structures secondaires de l’ARN en dénaturant l’ARN à haute température (94 oC), et deuxièmement, nous rincions l’ARN ASP à l’aide d’une amorce spécifique à l’ASP biotinylated et l’affinité purifie l’ADNc résultant. Par cette approche, nous sommes en mesure d’amplifier seulement notre cDNA cible, puisque d’autres produits NON spécifiques de RT sont empêchés d’être générés (dénaturation à haute température de l’ARN) ou éliminés avant PCR (purification d’affinité).

Protocol

Cette étude a été approuvée par la Commission d’examen institutionnel du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV). 1. Infection des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) par soucheHXB2 VIH-1 Jour 1: PBMCs STIMULATION Isoler les PBMC d’un pelage velauve de donneur sain. Compter et resuspendre les PBMC à une concentration de 1×106/mL dans le milieu complet du Roswell Park Memorial Institute (RP…

Representative Results

La dénaturation à haute température de l’ARN couplée à la purification d’affinité de l’ADNc biotinylated empêche l’amplification des produits ASP non spécifiques pendant PCR dans les PBMCs infectés in vitro et dans les cellules T CD4MD isolées des patients. RT auto-amorçage a été montré pour se produire lors de la transcription inverse des ARN antisens10,14,15,16,</s…

Discussion

Dans ce rapport, nous décrivons un essai de RT spécifique au brin appliqué à la détection de l’ARN ASP dans les cellules T CD4MD isolées chez des personnes infectées par le VIH-1. L’occurrence de l’amorçage non spécifique pendant RT entrave la détection des transcriptions d’ARN avec la polarité droite, menant à l’interprétation erronée des résultats. Les groupes précédents ont développé plusieurs stratégies visant à empêcher la synthèse d’ADNc amorce-indépendante pendant la réaction de RT. Le mar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick et Matthieu Perreau d’être toujours disponibles pour discuter de notre travail et de toutes les personnes du Laboratoire d’immunopathogenèse du sida pour leur précieuse assistance technique. Nous tenons également à remercier John et Aaron Weddle de VSB Associated Inc. qui ont contribué avec d’excellentes œuvres d’art. Enfin, un grand merci à tous les patients, sans qui ce travail n’aurait pas été possible. Ces travaux n’ont reçu aucune subvention spécifique d’un organisme de financement.

Materials

BD LSR II Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4337450
dNTP Set (100 mM) Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19052
Fetal Bovine Serum Biowest S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit Becton Dickinson 554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC Beckman Coulter 6604665
Human IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) Sigma-Aldrich 61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen, Thermo Fisher Scientific L34967
Mouse Anti-Human CD28 Becton Dickinson 55725
Mouse Anti-Human CD3 Becton Dickinson 55329
Primers and Probes Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin BioConcept 4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent Sigma-Aldrich TR-1003-G
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells Invitrogen, Thermo Fisher Scientific K450001
TURBO DNase (2 U/µL) Invitrogen, Thermo Fisher Scientific AM2238
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4375786

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Cite This Article
Mancarella, A., Procopio, F. A., Achsel, T., De Crignis, E., Foley, B. T., Corradin, G., Bagni, C., Pantaleo, G., Graziosi, C. Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR. J. Vis. Exp. (153), e60511, doi:10.3791/60511 (2019).

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