Summary

İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması

Published: November 27, 2019
doi:

Summary

RNA saç tokaları ve döngüler, sekansa özgü astarların yokluğunda ters transkripsiyon (RT) için astar işlevi görebilir ve üst üste gelen antisense transkriptlerin incelenmesine müdahale eder. İplik spesifik RNA’yı tanımlayabilen bir teknik geliştirdik ve bunu HIV-1 antisense protein ASP’yi incelemek için kullandık.

Abstract

Retrovirüslerde antisense transkripsiyon hem insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) hem de insan T-lenfotropik virüs 1 (HTLV-1) olarak tanımlanmıştır. HIV-1’de antisense protein ASP geni env’nin negatif iplikçiküzerinde, -2 okuma çerçevesinde gp120/gp41 kavşaklarını kapsayan bir proteinde bulunur. Asp açık okuma çerçevesinin 3′ ucu gp120 hiperdeğişken bölgeler V4 ve V5 ile örtüşmektedir. ASP RNA çalışması RT-self-priming olarak bilinen bir fenomen tarafından engellenmiştir, rna ikincil yapılar belirli astar yokluğunda RT asal yeteneğine sahip, spesifik olmayan CD’ler üreten. RT reaksiyonunda biyotinylated ters astarlar ile yüksek RNA denatürasyonu kombine kullanımı, streptavidin kaplı manyetik boncuküzerine cDNA afinite ile birlikte, bize seçici OLARAK CD4 ASP RNA yükseltmek için izin verdi + T hücreleri HIV-1 ile enfekte bireylerden türetilen. Yöntemimiz nispeten düşük maliyetli, gerçekleştirmek için basit, son derece güvenilir ve kolayca tekrarlanabilir. Bu bağlamda, sadece HIV-1’de değil, diğer biyolojik sistemlerde de antisense transkripsiyon çalışması için güçlü bir araçtır.

Introduction

Antisense protein (ASP) geni, insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) zarf (env) geninin negatif iplikçik üzerinde bulunan açık okuma çerçevesi (ORF) olup, gp120/gp411kavşağına yayılan bir gendir. Son 30 yıl içinde, çeşitli raporlar HIV ASP geni gerçekten transkripsiyonu ve tercüme olduğunu göstermiştir2,3,4,5,6,7,8,9. ASP antisense transkriptler tamamen in vitrokarakterize olmasına rağmen , yakın zamana kadar hastalarda ASP RNA gerçek üretimi hakkında bilgi hala eksikti.

ASP dizisi ters ve env tamamlayıcıdır. Bu, ASP transkriptlerini algılamaya çalışırken büyük bir engel teşkil eder. Standart ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemleri, doğru polaritenin tamamlayıcı NA’larını (cDNA’ları) sentezlemek için genlere özgü antisense astarlar kullanır. Ancak bu yaklaşım, rna saç tokaları veya döngüleri10astar yokluğunda her iki yönde de RT asal olabilir, rt kendini astar olarak bilinen bir fenomen, ilk RNA şablonunun yönünü (anlamda veya antisense) belirlemek için izin vermez. Çoğu ASP araştırmacıları HIV-111,12ile ilgili olmayan dizileri ile etiketlenmiş astarlar kullanarak RT kendini astar sorunu kenara . Ancak bu strateji, fenomenin oluşumunu ortadan kaldırmaz ve PCR11’espesifik olmayan CDNA’ların potansiyel olarak taşınmasına yol açabilir.

Yakın zamanda antisense RNA çalışması için yeni bir iplikçik özgü RT-PCR tayini geliştirdik ve Tablo 1’degösterildiği gibi, altı HIV enfekte hastanın bir kohort ASP RNA tespiti için kullandık. Aşağıda açıklanan prosedür daha önce Antonio Mancarella ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Protokolümüzde, spesifik olmayan CNA’ların çift yaklaşımla üretiminden kaçınıyoruz. İlk olarak, RNA’yı yüksek sıcaklıkta (94 °C) reddederek RNA ikincil yapılarını ortadan kaldırıyoruz ve ikinci olarak, biyotinylated ASP’ye özgü astar kullanarak ASP RNA’yı tersine çeviriyoruz ve elde edilen cDNA’yı arındırıyoruz. Bu yaklaşımla, spesifik olmayan diğer RT ürünlerinin üretilmesi (RNA’nın yüksek sıcaklık denatürasyonu) engellenmesi veya PCR (afinite arınma) öncesinde ortadan kaldırılması önlendiği için, sadece hedef cDNA’mızı yükseltebiliriz.

Protocol

Bu çalışma, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Hiv-1HXB2 suşu ile periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMCs) enfeksiyonu 1. Gün: PBMCS UYARITMA Sağlıklı bir donör buffy ceket PBMCs izole. Komple Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (R-10) içeren 1×106/ mL konsantr…

Representative Results

Biyotinylated cDNA afinite ile birleştiğinde yüksek sıcaklık RNA denatürasyonu, pcr sırasında non-spesifik ASP ürünlerinin in vitro enfekte PCR ve hastalardan izole CD4 + T hücrelerinde amplifikasyon önler. RT kendini priming antisense RNA10ters transkripsiyon sırasında meydana gösterilmiştir10 ,14,15,16,17. Bu fenomeni önlemek için,…

Discussion

Bu raporda, HIV-1 ile enfekte olan bireylerden izole cd4+ T hücrelerinde ASP RNA tespitine uygulanan iplikçik spesifik RT tayini açıklanmıştır. RT sırasında spesifik olmayan astar oluşumu, RNA transkriptlerinin doğru polarite ile saptanmasını engelleyerek sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açtı. Önceki gruplar RT reaksiyonu sırasında astar-bağımsız cDNA sentezini önlemeye yönelik çeşitli stratejiler geliştirmişlerdir. HIV ile ilgili olmayan dizileri ile 3 ‘sonunda ters astar etiketleme i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick ve Matthieu Perreau her zaman bizim çalışma ve AIDS İmmünopatogenez Laboratuvarı’nda tüm insanlar değerli teknik yardım için tartışmak için kullanılabilir olduğu için teşekkür ederiz. Biz de John ve Aaron Weddle VSB Associated Inc kim mükemmel sanat ile katkıda teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, tüm hastalara çok özel teşekkürler, onsuz bu çalışma mümkün olmazdı. Bu çalışma herhangi bir finansman ajansı ndan özel bir hibe almadı.

Materials

BD LSR II Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4337450
dNTP Set (100 mM) Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19052
Fetal Bovine Serum Biowest S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit Becton Dickinson 554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC Beckman Coulter 6604665
Human IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) Sigma-Aldrich 61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen, Thermo Fisher Scientific L34967
Mouse Anti-Human CD28 Becton Dickinson 55725
Mouse Anti-Human CD3 Becton Dickinson 55329
Primers and Probes Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin BioConcept 4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent Sigma-Aldrich TR-1003-G
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells Invitrogen, Thermo Fisher Scientific K450001
TURBO DNase (2 U/µL) Invitrogen, Thermo Fisher Scientific AM2238
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4375786

References

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

Play Video

Cite This Article
Mancarella, A., Procopio, F. A., Achsel, T., De Crignis, E., Foley, B. T., Corradin, G., Bagni, C., Pantaleo, G., Graziosi, C. Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR. J. Vis. Exp. (153), e60511, doi:10.3791/60511 (2019).

View Video