Summary

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

Published: November 27, 2019
doi:

Summary

RNA haarspelden en lussen kunnen fungeren als primers voor reverse transcriptie (RT) bij afwezigheid van sequentie-specifieke primers, interfereren met de studie van overlappende antisense transcripten. We hebben een techniek ontwikkeld die in staat is om streng-specifiek RNA te identificeren, en we hebben het gebruikt om HIV-1 antisense Protein ASP te bestuderen.

Abstract

Bij retrovirussen is antisense transcriptie beschreven in zowel humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) als humaan T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). In HIV-1 bevindt het antisense Protein ASP-gen zich op de negatieve streng van env, in het Lees frame-2, dat de kruising gp120/gp41 beslaat. In de zin oriëntatie overlapt het 3 ‘ einde van het open Lees frame van ASP met gp120 hypervariable-regio’s v4 en V5. De studie van ASP-RNA is gedwarslanteerd door een fenomeen dat bekend staat als RT-Self-priming, waarbij RNA-secundaire structuren de mogelijkheid hebben om RT bij afwezigheid van de specifieke primer te prime, waardoor niet-specifieke Cdna’s worden gegenereerd. Het gecombineerde gebruik van hoge RNA-denaturatie met biotinyleerd reverse primers in de RT-reactie, samen met affiniteits zuivering van de cDNA op streptavidin gecoate magnetische kralen, heeft ons toegestaan om selectief te versterken ASP-RNA in CD4 + T cellen afgeleid van individuen geïnfecteerd met HIV-1. Onze methode is relatief voordelig, eenvoudig uit te voeren, zeer betrouwbaar en gemakkelijk reproduceerbaar. In dit opzicht vertegenwoordigt het een krachtig hulpmiddel voor de studie van antisense transcriptie, niet alleen in HIV-1, maar ook in andere biologische systemen.

Introduction

Het antisense protein (ASP)-gen is een open Lees frame (ORF) dat zich bevindt op de negatieve streng van het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) envelop (env)-gen, dat de kruising gp120/gp411beslaat. In de afgelopen dertig jaar hebben verschillende rapporten aangetoond dat het HIV ASP-gen inderdaad is getranscribeerd en vertaald2,3,4,5,6,7,8,9. Hoewel ASP antisense transcripten volledig in vitrozijn gekarakteriseerd, was tot voor kort nog informatie over de werkelijke productie van ASP-RNA bij patiënten verdwenen.

De opeenvolging van ASP is omgekeerd en complementair aan env. Dit vormt een belangrijk obstakel wanneer u transcripten voor ASP probeert te detecteren. Standaard reverse transcriptie-polymerase chain reaction (RT-PCR) methoden gebruiken genspecifieke antisense primers om complementaire Dna’s (Cdna’s) van de juiste polariteit te synthetiseren. Deze aanpak staat echter niet toe om de oriëntatie (zin of antisense) van de initiële RNA-template te bepalen, aangezien RNA-haarspelden of lussen in beide richtingen kunnen worden priem bij afwezigheid van primers10, een fenomeen dat bekend staat als RT Self-priming. De meeste ASP-onderzoekers gaan het probleem van RT Self-priming aan met behulp van primers gelabeld met sequenties die niet gerelateerd zijn aan HIV-111,12. Deze strategie elimineert echter niet het optreden van het fenomeen en kan leiden tot een mogelijke overname van niet-specifieke Cdna’s in de PCR11.

We hebben onlangs een nieuwe strand-specifieke RT-PCR-test ontwikkeld voor de studie van antisense RNA en we hebben het gebruikt voor ASP-RNA-detectie in een cohort van zes HIV-geïnfecteerde patiënten, zoals weergegeven in tabel 1. De hieronder beschreven procedure is eerder gepubliceerd door Antonio Mancarella et al.13. In ons protocol vermijden we de productie van niet-specifieke Cdna’s door een dubbele aanpak. Ten eerste elimineren we RNA-secundaire structuren door denaturerende RNA op hoge temperatuur (94 ° c), en ten tweede, we reverse transcriberen ASP RNA met behulp van een biotinyleerd ASP-specifieke primer en affiniteit-zuiveren van de resulterende cDNA. Door deze aanpak kunnen we alleen onze doel-cDNA versterken, omdat andere niet-specifieke RT-producten worden verhinderd om te worden gegenereerd (denaturatie van hoge temperaturen van RNA) of geëlimineerd vóór PCR (affiniteits zuivering).

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de institutioneel beoordelings Raad van het Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV). 1. infectie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) met HIV-1HXB2 stam Dag 1: PBMCs STIMULATIE Isoleer PBMCs van een gezonde donateurs Buffy vacht. Tellen en respenderen PBMCs in een concentratie van 1×106/ml in het complete Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium dat 10% foetaal …

Representative Results

Hoge temperatuur RNA denaturatie gekoppeld aan affiniteit zuivering van biotinyleerd cDNA voorkomt versterking van niet-specifieke ASP-producten tijdens PCR in PBMCs geïnfecteerd in vitro en in CD4 + T-cellen geïsoleerd van patiënten. RT zelfaanzuigend is aangetoond tijdens omgekeerde transcriptie van antisense RNAS10,14,15,16,17. Om dit fenomeen t…

Discussion

In dit rapport beschrijven we een streng-specifieke RT assay toegepast op de detectie van ASP-RNA in CD4 + T-cellen geïsoleerd van personen geïnfecteerd met HIV-1. Het optreden van niet-specifieke priming tijdens RT belemmert de detectie van RNA-transcripten met de juiste polariteit, wat leidt tot een verkeerde interpretatie van de resultaten. Eerdere groepen hebben verschillende strategieën ontwikkeld die gericht zijn op het voorkomen van primer-onafhankelijke cDNA-synthese tijdens de RT-reactie. Het taggen van de om…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick en Matthieu Perreau om altijd beschikbaar te zijn om ons werk en alle mensen in het laboratorium voor AIDS-immunopathogenese te bespreken voor hun kostbare technische hulp. We willen ook John en Aaron Weddle van VSB Associated Inc. bedanken die hebben bijgedragen aan uitstekende kunstwerken. Tot slot, veel speciale dank aan alle patiënten, zonder wie dit werk niet mogelijk zou zijn geweest. Dit werk ontving geen specifieke subsidie van een financierings instantie.

Materials

BD LSR II Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4337450
dNTP Set (100 mM) Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19052
Fetal Bovine Serum Biowest S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit Becton Dickinson 554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC Beckman Coulter 6604665
Human IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) Sigma-Aldrich 61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen, Thermo Fisher Scientific L34967
Mouse Anti-Human CD28 Becton Dickinson 55725
Mouse Anti-Human CD3 Becton Dickinson 55329
Primers and Probes Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin BioConcept 4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent Sigma-Aldrich TR-1003-G
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells Invitrogen, Thermo Fisher Scientific K450001
TURBO DNase (2 U/µL) Invitrogen, Thermo Fisher Scientific AM2238
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4375786

References

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

Play Video

Cite This Article
Mancarella, A., Procopio, F. A., Achsel, T., De Crignis, E., Foley, B. T., Corradin, G., Bagni, C., Pantaleo, G., Graziosi, C. Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR. J. Vis. Exp. (153), e60511, doi:10.3791/60511 (2019).

View Video