Detección de transcripciones de ARN de proteína antisentido (VIH-1) de proteína antisentido (VIH-1) en pacientes por RT-PCR específico de Hebra
Summary
Las horquillas y bucles de ARN pueden funcionar como imprimaciones para la transcripción inversa (RT) en ausencia de imprimaciones específicas de secuencia, interfiriendo con el estudio de transcripciones antisentido superpuestas. Hemos desarrollado una técnica capaz de identificar el ARN específico de las hebras, y lo hemos utilizado para estudiar la proteína antisentido VIH-1 ASP.
Abstract
En retrovirus, la transcripción del antisentido se ha descrito tanto en el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) como en el virus t-linfotrópico humano 1 (HTLV-1). En HIV-1, el gen ASP de proteína antisentido se encuentra en la cadena negativa de env, en el marco de lectura -2, que abarca la unión gp120/gp41. En la orientación del sentido, el extremo de 3′ del marco de lectura abierto ASP se superpone con las regiones hipervariables gp120 V4 y V5. El estudio del ARN ASP se ha visto frustrado por un fenómeno conocido como RT-autocebado, por el que las estructuras secundarias de ARN tienen la capacidad de primar RT en ausencia de la imprimación específica, generando cDNAs no específicos. El uso combinado de alta desnaturalización de ARN con imprimaciones inversas biotiniadas en la reacción RT, junto con la purificación de afinidad del ADNc sobre cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina, nos ha permitido amplificar selectivamente el ARN ASP en células T CD4+ derivadas de individuos infectados con VIH-1. Nuestro método es relativamente bajo costo, fácil de realizar, altamente confiable y fácilmente reproducible. En este sentido, representa una poderosa herramienta para el estudio de la transcripción antisentido no sólo en el VIH-1, sino también en otros sistemas biológicos.
Introduction
El gen de la proteína antisentido (ASP) es un marco de lectura abierto (ORF) situado en la cadena negativa del gen de sobre de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), que abarca la unión gp120/gp411. En los últimos 30 años, varios informes han demostrado que el gen del VIH ASP es de hecho transcrito y traducido2,3,4,5,6,7,8,9. Aunque las transcripciones antisentido ASP se han caracterizado completamente in vitro,hasta hace poco faltaba información sobre la producción real de ARN ASP en pacientes.
La secuencia de ASP es inversa y complementaria a env. Esto representa un obstáculo importante al intentar detectar transcripciones para ASP. Los métodos estándar de reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) utilizan imprimaciones antisentidos específicas genéticas para sintetizar los ADN complementarios (CNNAs) de la polaridad derecha. Este enfoque, sin embargo, no permite determinar la orientación (sentido o antisentido) de la plantilla inicial de ARN, ya que las horquillas o bucles de ARN pueden preparar RT en ambas direcciones en ausencia de imprimaciones10,un fenómeno conocido como autocebado RT. La mayoría de los investigadores de ASP desvían el problema de la autocebación RT utilizando imprimaciones etiquetadas con secuencias que no están relacionadas con HIV-111,12. Esta estrategia, sin embargo, no elimina la ocurrencia del fenómeno, y puede conducir a la posible prórroga de los CDNa no específicos en el PCR11.
Recientemente hemos desarrollado un nuevo ensayo RT-PCR específico de hebra para el estudio del ARN antisentido y lo hemos utilizado para la detección de ARN ASP en una cohorte de seis pacientes infectados por el VIH, como se muestra en la Tabla 1. El procedimiento descrito a continuación ha sido publicado previamente por Antonio Mancarella et al.13. En nuestro protocolo, evitamos la producción de CDNA no específicos mediante un enfoque dual. En primer lugar, eliminamos las estructuras secundarias de ARN desnaturalizando el ARN a alta temperatura (94 oC) y, en segundo lugar, invertimos el ARN ASP mediante una imprimación biotinilada específica de ASP y purificamos la afinidad del ADNC resultante. Con este enfoque, somos capaces de amplificar sólo nuestro ADNc objetivo, ya que se impide que otros productos RT no específicos se generen (desnaturalización a alta temperatura del ARN) o se eliminen antes de la PCR (purificación de afinidad).
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe describimos un ensayo RT específico de hebra aplicado a la detección de ARN ASP en células T CD4+ aisladas de individuos infectados con VIH-1. La aparición de cebado no específico durante RT dificulta la detección de transcripciones de ARN con la polaridad derecha, lo que lleva a una interpretación errónea de los resultados. Grupos anteriores han desarrollado varias estrategias destinadas a prevenir la síntesis de ADNc independiente de imprimación durante la reacción RT. Etiquetar la imprimaci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick y Matthieu Perreau por estar siempre disponibles para discutir nuestro trabajo y todas las personas en el Laboratorio de Inmunopatógenos del SIDA por su valiosa asistencia técnica. También nos gustaría dar las gracias a John y Aaron Weddle de VSB Associated Inc. que contribuyeron con excelentes obras de arte. Por último, muchas gracias especiales a todos los pacientes, sin los cuales este trabajo no habría sido posible. Este trabajo no recibió ninguna subvención específica de ninguna agencia de financiación.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
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