Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope methode die het mogelijk maakt de kwantificering van lijmtumorcellen naar lymfeklier (LN) cryosecties. LN-aanhangende tumorcellen worden gemakkelijk geïdentificeerd door lichtmicroscopie en bevestigd door een fluorescentiegebaseerde methode, waardoor een adhesie-index wordt gegeven die de tumorcelbindende affiniteit met LN-parenchyma onthult.
Abstract
Tumordrainerende lymfeklieren (LNs) zijn niet alleen filters van tumorgeproduceerd afval. Ze zijn een van de meest voorkomende regionale locaties van voorlopige verblijfplaats van verspreide tumorcellen bij patiënten met verschillende vormen van kanker. De detectie van deze LN-residing tumorcellen is een belangrijke biomarker geassocieerd met een slechte prognose en adjuvante therapie beslissingen. Recente muismodellen hebben aangegeven dat LN-residing tumorcellen een wezenlijke bron van kwaadaardige cellen voor verre metastasen zouden kunnen zijn. De mogelijkheid om de adhesiviteit van tumorcellen te kwantificeren aan LN parenchyma is een kritische graadmeter in experimenteel onderzoek dat zich richt op de identificatie van genen of signaleringstrajecten die relevant zijn voor lymfe/gemetastaseerde verspreiding. Omdat LN's complexe 3D-structuren zijn met een verscheidenheid aan verschijningen en samenstellingen in weefselsecties, afhankelijk van het vlak van sectie, zijn hun matrices moeilijk experimenteel in vitro te repliceren op een volledig gecontroleerde manier. Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope methode die het mogelijk maakt de kwantificering van lijmtumorcellen naar LN cryosecties. Met behulp van seriële secties van dezelfde LN passen we de klassieke methode die Brodt ontwikkelde aan om niet-radioactieve labels te gebruiken en direct het aantal vasthoudende tumorcellen per LN-oppervlak te tellen. LN-aanhangende tumorcellen worden gemakkelijk geïdentificeerd door lichtmicroscopie en bevestigd door een fluorescentiegebaseerde methode, waardoor een adhesie-index wordt gegeven die de celbindende affiniteit met LN-parenchyma onthult, wat suggestief bewijs is van moleculaire veranderingen in de affiniteitsbinding van integrinns aan hun correlerende LN-liganden.
Introduction
Kankermetastase is de belangrijkste reden voor het falen van de behandeling en het dominante levensbedreigende aspect van kanker. Zoals 130 jaar geleden gepostuleerde, de uitgezaaide verspreiding resultaten wanneer een elite van verspreide tumorcellen (DDC's, de "zaden") verwerven specifieke biologische vaardigheden die hen in staat stellen om primaire sites te ontwijken en kwaadaardige groei vast te stellen op verre plaatsen (de "bodem")1. Onlangs zijn verschillende nieuwe concepten met betrekking tot de "zaad en bodem" relaties ontstaan, zoals de inductie van pregemetastaseerde niches (geconceptualiseerd als een "vruchtbare bodem" die nodig is voor "zaden" om te gedijen), zelfzaaiende primaire tumoren door DDC's, "zaad" rust op secundaire organen en de parallelle progressie model van metastase2.
Voor de meeste solide maligniteiten kunnen DDC's zich bevinden en worden gedetecteerd in veel mesenchymale organen, zoals beenmerg en lymfeklieren (LNs) bij patiënten met of zonder bewijs van klinische metastase. Omdat tumordrainerende LN's de eerste locatie zijn van de regionale verspreiding van DDC's, is de LN-status een belangrijke prognostische indicator en wordt vaak geassocieerd met adjuvante therapiebeslissingen3. Voor sommige tumortypes is de correlatie tussen LN-status en slechtere resultaten sterk, waaronder hoofd en nek4,5, borst6,prostaat7,long8, maag9, colorectale10,11 en schildklierkanker12.
LNs zijn kleine eivormige organen van het lymfestelsel, die zijn bedekt met reticulaire cellen en ingesloten met lymfevaten. Deze organen zijn absoluut noodzakelijk voor de werking van het immuunsysteem13. LNs fungeren als attractant platforms voor immuun circulerende cellen, het samenbrengen van de lymfocyten en antigeen-presenterende cellen14. Echter, LNs trekken ook circulerende tumorcellen. Gedurende tientallen jaren werden LN's afgebeeld als passieve routes van transport voor uitgezaaide tumorcellen. Recente studies hebben echter aangetoond dat tumorcellen ook naar LN's kunnen worden geleid door chemotactische (chemokines) en/of haptotactische (extracellulaire matrixelementen) signalen die worden afgescheiden door het lymfeendotheel15. Als voorbeelden vergemakkelijkt overexpressie van de CCR7-receptor in tumorcellen de begeleiding van uitgezaaide melanoomcellen naar tumordrainerende LNs16. Bovendien, extracellulaire LN eiwitten bieden een kleefsteiger voor de werving en overleving van circulerende tumorcellen17. In feite, tumor-drainerende LNs bieden vruchtbare bodem voor het zaaien van DDC's, die kan worden gehandhaafd in proliferative of slapende staten door specifieke LN microenvironmental signalen18. Het uiteindelijke lot van deze LN-residing DTCs is controversieel; sommige werken suggereren dat deze cellen passieve indicatoren zijn van uitgezaaide progressie19, terwijl anderen voorstellen dat ze waarschijnlijker grondleggers zijn van resistentie (door zelfzaaiende primaire sites) en/of fungeren als cellulaire reservoirs voor metastasen (verspreiding van "zaden" voor tertiaire kankergroei)20,21. Onlangs, met behulp van preklinische modellen, is aangetoond dat een fractie van deze LN-residing DTCs actief binnengevallen bloedvaten, in de bloedcirculatie en gekoloniseerd de longen21.
Gezien het feit dat de aanwezigheid van kankercellen in LN's is een marker voor kanker agressiviteit en invasieve, in deze studie, hebben we geoptimaliseerd een klassieke methode ontwikkeld door Brodt22 kwantitatief te meten tumorcel hechting aan LN's in vitro. Het gebruik van een op fluorescentie gebaseerde test stelde ons in staat om een goedkoop, snel, gevoelig en milieuvriendelijk (niet-radioactief) protocol te ontwikkelen voor de detectie van lijmveranderingen tussen tumorcellen en LN-cryosecties. Met behulp van de MCF-7 borstkankercellen die verschillende niveaus van NDRG4-genexpressie en ratten LN-bevroren secties uitdrukken om de methode te illustreren, toonden we aan dat dit protocol een goede correlatie mogelijk maakte tussen tumorcelhechting aan LN's in vitro en LN metastase waargenomen bij borstkankerpatiënten24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LNs werden teruggevonden uit verse karkassen van gezonde volwassen Wistar ratten geofferd door cervicale dislocatie. We volgden de NIH-richtlijnen voor pijn en nood in proefdieren en alle procedures zijn goedgekeurd door het Ethische Comité en Dieronderzoek van het Onderzoeks- en Onderwijsinstituut van het Sírio-Libanês-ziekenhuis (CEUA P 2016-04).
OPMERKING: Alle verse bevroren weefsels worden als biogevaarlijk beschouwd en moeten worden behandeld met behulp van passende bioveiligheidsvoorzorgsmaatregelen.
1. Lymfolymennectomie en cryosectieing
- Plaats verse karkassen van volwassen Wistar ratten (180-220 g) liggend in rugrecumbency op een schone dissectie boord bij kamertemperatuur.
LET OP: LNs moeten worden verzameld tot 30 min na euthanasie. - Spray het rattenkarkas met 70% isopropylalcohol en gebruik gesteriliseerde instrumenten voor LN-oogst.
- Til de buikhuid op met behulp van pincet en open een holte met een mediale incisie zonder het onderliggende weefsel te beschadigen, waardoor de buikingewanden worden blootgelegd. Trek de darm eruit en de borst- en buik-LN's worden zichtbaar (figuur 1).
- Zorgvuldig accijnzen de LAN's van elke rat met het gebruik van stompe tip schaar om te voorkomen dat verwonden van de superieure mesenteriale slagader liggen achter.
OPMERKING: Afhankelijk van de locatie van de gereseceerde lymfeklier is het noodzakelijk om andere weefsels te reinigen die eraan zijn gehecht, zoals mesenterisch weefsel. - Oogst LN's in 15 mL conische buizen met 5 mL steriel fosfaat gebufferd zout (PBS).
- Gooi de karkassen van de rat goed weg.
- Verwijder verse LN's uit de PBS, rol en droog het knooppunt op een droog filterpapier. Plaats het in een kleine petrischaal en voeg inbeddingsoplossing toe voor bevroren weefselmonsters (O.C.T.) gedurende 2 min.
- Breng en oriënteer de LN gezicht naar beneden in een gewenste positie in de basis van een cryomold, met net genoeg O.C.T om het te dekken. Vermijd bellen in de buurt van het weefsel. Het sectioning oppervlak is de onderkant van de cryomold.
- Onmiddellijk snap-vries de cryomold in een piepschuim koeler met droog ijs. Wanneer er nog een klein deel van niet-bevroren O.C.T. (~20-35 s) is, breng het monster over naar aluminiumfolie en plaats het in een koeler met droogijs terwijl u andere monsters blijft bevriezen. Bewaar aan het einde alle monsters bij -80 °C tot de sectie.
- Sectie de LN met een cryostat aanpassen sectie dikte tot 5-8 μm. Breng crysections op microscoop dia's.
OPMERKING: Verwijder voor het uitdelen de bevroren monsters uit de vrieskist -80 °C en laat ze de temperatuur in de cryostat microtomekamer op -22 °C voor ongeveer 30 min. LN-bevattende dia's kunnen maximaal een maand bij -80 °C worden opgeslagen.
2. Cellular Labeling met fluorescerende kleurstoffen
OPMERKING: Fluorescerende kleurstoffen worden veel gebruikt in de celbiologie. Wij geven de voorkeur aan de lange-keten dialkylcarbocyanines etikettering (DiI (C18),excitatie 549 nm, Emissie 565 nm) te gebruiken omdat ze helder, stabiel en direct kunnen worden toegevoegd aan kweekmedia, heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van cellen of cellijm eigenschappen25,26.
- Gescheiden cellen die groeien onder ideale omstandigheden (d.w.z. in volledig medium) en opnieuw opschorten in serumvrij medium met een dichtheid van 106 cellen/mL.
- Voeg 1 mL celvering (106 cellen) toe aan een conische buis van 15 mL en het etiket met Dil(C18) (2 μg/mL) gedurende 10 min bij 37 °C.
OPMERKING: Na 5 min, voorzichtig ageerte de buizen om celsedimentatie en onderbesing van sedimented cellen te voorkomen. Grotere dichtheden vereisen langere incubatietijden voor uniforme vlekken. Een optimale incubatietijd voor celkleuring varieert met cellijn. Het kan beter worden gekwantificeerd met behulp van de conventionele FL2 flow cytometrie detectiekanaal(Figuur 2A). - Centrifugeer de gelabelde ophangingsbuizen op 300 x g gedurende 4 min.
- Verwijder de supernatant en was twee maal in 10 mL serumvrij medium. Herstel de cellen als rode pellets. Schorsen de cellen op 106 cellen/mL in serumvrij medium met 0,1% runderserumalbumine (BSA).
3. Voorcoating gerechten met Poly-L-lysine Oplossing of BSA als een zaaicontrole (optioneel)
OPMERKING: We gebruikten celkweekgerechten die vooraf zijn gecoat met PLL als positieve laadcontroleoppervlakken om ervoor te zorgen dat verschillende experimentele groepen tumorcellen op hetzelfde nummer werden gezaaid, evenals met BSA bedekte oppervlakken als negatieve controles.
- Voeg onder steriele omstandigheden om pll- of BSA-gecoate putten voor te bereiden 300 μL PLL (0,1% w/v in H2O) of BSA (verdund bij 2,5% w/v in H2O) direct aan de 24-putplaat toe en 's nachts bij 4 °C incubeeren.
- Verwijder de oplossing door aspiratie, spoel het oppervlak voorzichtig af met steriele PBS en droog de plaat op kamertemperatuur in de weefselkweekkap voordat de cel sijpelt.
OPMERKING: De uiteindelijke volumes van PLL of BSA moeten worden aangepast aan de oppervlakte van verschillende putplaten.
4. Zaaien fluorescerende gelabelde tumorcellen op LN Cryosecties of PLL / BSA-gecoate putten
OPMERKING: Als experimentele besturingselementen gebruikten we (1) celkweekgerechten die vooraf zijn bekleed met PLL- of BSA-en (2) opeenvolgende delen van dezelfde LN per experiment (zie dit detail in figuur 2D),waarbij deze laatste regionale variaties in de samenstelling van de extracellulaire matrix (ECM) van elke LN-sectie zal minimaliseren, wat op zijn beurt het celadhesiepercentage kan dicteren. Selecteer voor de volgende hechtingstest van hoge kwaliteit en sequentiële LN-cryosecties voor de volgende tumorcelhechtingstest.
- Was de cryosecties twee keer voorzichtig met PBS en rehydrateer met PBS gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
- Blokkeer niet-specifieke hechting aan cryosecties met 2,5% BSA gedurende 30 min bij 37 °C. Gebruik immunohistochemie waskamers en lamina wiegen om ervoor te zorgen dat de gehele OK werd verwijderd tijdens wasbeurten en incubaties.
- Giet de overtollige BSA af op een droge papieren handdoek, droog de omtrek van LN-secties met een wattenstaafje en omcirkel de secties met behulp van een PAP-pen.
- Voor de bijspraakvan de tumorcel voeg u 100 μL celsuspensie (vanaf stap 2.4) toe aan elke omcirkelde LN-sectie of goed in de 24-well PLL-gecoate platen en plaats deze in een bevochtigd kamerrek gedurende 1-2 uur bij 37 °C in de conventionele celkweekincubator.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume van celvering moet worden aangepast aan het gebied van verschillende omcirkelde LN's. - Spoel niet-aanhangende cellen vier keer voorzichtig af met PBS. Bevestig de resterende aanhangende fluorescerende cellen met 3,7% formaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
5. Handmatige kwantificering van de lijmindex
OPMERKING: De lijmindex (d.w.z. tumorcellen/LN mm2)werd bereikt met behulp van een doelstelling van 10X en het handmatig tellen van het aantal tumorcellen, gemakkelijk geïdentificeerd door lichtmicroscopie en bevestigd door een fluorescentiemicroscopie(figuur 2D),per lymfekliergebieden van verschillende onafhankelijke velden (verkregen met behulp van ImageJ/FIJI-software van het National Institute of Health).
- Gebruik een fluorescerende microscoop met een 10x doelstelling om afzonderlijke TIFF-beelden te maken in twee kanalen die overeenkomen met de heldere en rood-fluorescerende velden(figuur 2D). Geef deze afbeeldingen systematisch een naam en sla ze op.
- Start ImageJ/FIJI, open de afbeeldingen en stel de schaal in. Het is noodzakelijk een kalibratieschaal te gebruiken (bijvoorbeeld een micrometrische liniaal 1 mm) (figuur 2C).
- Open de foto van de micrometrische liniaal (of een fasemicrometer), selecteer het gereedschap Rechte lijn en teken een rechte lijn die een bekende afstand definieert.
- Selecteer Schaal instellenin het menu Analyseren. De afstand in pixels wordt gevuld op basis van de lengte (in pixels) van de lijn die in stap 5.3 is getekend. De bekende afstand zal worden gevuld met de werkelijke afstand (in dit geval, in millimeters) en de eenheid van lengte in de eenheid van lengte veld (in dit geval, in millimeters).
- Klik op Global (deze kalibratie is van toepassing op alle afbeeldingen die zijn geopend in deze ImageJ/FIJI-sessie) en druk op OK.
- Lymfeknooppuntgebiedkwantificering: selecteer het gereedschap Wand en open door dubbel te klikken op de gereedschapsinstellingen van Wand. De modus instellen op 8-verbonden. Klik op de foto en stel de tolerantie in totdat u alle lymfeklieren in de foto selecteert en op OKdrukt. Open Analyseren | om het gebied te meten open | Meting (CTRL + M). Het gebied wordt uitgedrukt in de eenheden die eerder zijn ingesteld.
- Tumorcelkwantificering: Open de lichtmicroscopie/fluorescentiebeelden in FIJI-software. Plug-ins selecteren | Analyseren | Celteller | Celteller. Klik op de te kwantificeren foto en druk op Initialize-knop in het celloket. Selecteer het tellertype (1-8) en klik op de cellen in de foto. Als u de volgende foto wilt initialiseren, drukt u op de knop Opnieuw instellen in het celloket, opent u de nieuwe foto en herhaalt u alle stappen.
OPMERKING: LN adhesie index wordt uitgedrukt als het aantal aanhangende tumorcellen per LN bedekt gebied (cellen /mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We illustreren de test door de evaluatie van de LN lijm potentieel van rode fluorescerende MCF-7 borstkankercellen uitdrukken verschillende niveaus van de NDRG4 gen (aangeduid als NDRG4-positieve en NDRG4-negatieve cellen), een negatieve modulator van beta1-integrin clustering op het celoppervlak24, door het onderzoeken van de fracties van rat LN-aanhangende tumorcellen. Voorbeelden van de ruwe beelden van dit protocol worden weergegeven in figuur 2. Zoals waargenomen in figuur 2B, wordt de morfologie van aanhangende cellen afgerond in de vorm en zijn ze heterogeen verspreid over de LN. De LN-lijmindex is 2 keer hoger in NDRG4-negatieve MCF-7 cellen (877 ± 124 cellen/mm2 LN) in vergelijking met die in overeenkomstige NDRG4-positieve MCF-7 cellen (412 ± 76 cellen/mm2 ln, p = 0,03) (figuur 2D).
Figuur 1: Stapsgewijze procedure voor de isolatie van de rattenmesenteric LNs. (A) Ventrale midline huidincisie: geëuthanaseerde ratten werden geplaatst in rugreifaire recumbency positie en een 30-50 mm midline incisie werd gemaakt in de huid boven de middelste buik, bloot de buikingewanden (lever, dunne darm, cecum en blaas). (B) De dunne darm werd voorzichtig uit de buikholte getrokken die rattenmesenterische LN's blootmaakte die in visceraal vetweefsel zijn ingebed. (C) Grove anatomie van het ontleed e-darmkanaal na verwijdering. (D) Ontleed mesenterische lymfeklieren uit het verbindende vetweefsel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van tumorcelhechting aan rattenlymfekliersecties. (A) Illustratieve stroomcytometrieanalyse die de intensiteit van dii(C18)etikettering (bovenste kwadrant) in vergelijking met niet-geëtiketteerde cellen (onderste kwadrant) toont. (B) Lichte (links) en fluorescerende (rechts) microscopiebeelden van mcf-7-cellen met rood gelabelde cellen die na de wasstap aan LN-secties zijn bevestigd. (C) Na adhesietest worden aangesloten cellen op afdekkingen handmatig gekwantificeerd met behulp van een kalibratieschaal om het lymfekliergebied en de fluorescerende microscopie te schatten op het direct tellen van cellen. (D) NDRG4 knockdown in MCF-7 borsttumorcellen verhoogt lymfeklierhechting. Representatieve beelden van rode fluorescerende MCF-7 cellen (NDRG4-positieve of NDRG4-negatieve DiIC18-gelabelde cellen) 30 min na het zaaien op 5 μm rattenlymfekliersecties. De LN-lijmindex wordt uitgedrukt als het aantal aanhangende tumorcellen per ln-gebied (cellen/mm2). Schaalbalk = 200 μm. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lymfatische systeem verspreiding van kankercellen vereist een verscheidenheid van complexe cel-gedreven gebeurtenissen. Ze initiëren met celonthechting van primaire tumor en de remodelleren van de extracellulaire matrix (ECM) architectuur, en worden ondersteund door aanhoudende chemotaxis en actieve migratie via de afferente lymfoïden op weg naar de sentinel LN's. Als kankercellen zich hechten en overleven in LNs, kunnen ze zich gemakkelijk verspreiden naar andere secundaire organen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor een snelle en goedkope functionele analyse van specifieke lijminteracties tussen tumorcellen en bevroren LN's.
Structureel, LNs zijn discrete spons-achtige massa's van dichte en uitgebreide netwerken van ECM vezels, vaak aangeduid als "reticulaire vezels", die fungeren als paden voor celmigratie en als leidingen voor snelle levering van oplosbare factoren (antigenen en / of chemokines) binnen de LN parenchyma27. De bewaarde reticulaire vezels van de bevroren LN's van de test ondersteunen haptotactische signalen en bieden steigers voor tumorcelhechting in vitro. Deze vezels bestaan voornamelijk uit structurele eiwitten, zoals collageen I en III, en door secundaire ECM-elementen, zoals fibronectine, tenascine, laminine, vitronectine en heparansulfaat proteoglycanen28,29. Na celhechting bieden de meeste van deze LN-afgeleide ECM-factoren moleculaire signalen die de overleving van cellen (proliferative of dormancy states) of celdood (anoikis) bepalen door middel van integrin-gemedieerde signalen.
Hier demonstreren we de test met xenogene rat LN's en een menselijke borsttumorcellijn. Als alternatief kunnen andere bronnen van LAN's worden gebruikt. De samenstelling van ratten-, muis- of menselijke LN's omvat dezelfde structurele en functionele eiwitten die deel uitmaken van de inheemse zoogdiere ECM, die allemaal vergelijkbare bindende plaatsen behouden die nodig zijn voor celhechting23. Belangrijk is dat de enige kritieke stap is het gebruik van opeenvolgende segmenten van dezelfde LN per experiment om regionale variaties in ecm-samenstelling van elke LN-sectie te minimaliseren, wat op zijn beurt de celhechtingsgraad kan dicteren.
Een nadeel van de test is dat het niet de eerste stappen van lymfeverspreiding recapituleert, alleen als gevolg van de kleefkracht van tumorcellen aan LNs. Zo leidt het zaaien van minder agressieve borsttumorcellen op LN-secties, zoals de MCF-7 (figuur 2) of de T47D tumorcellijnen24,tot een sterke hechting aan LN-secties in vitro, op vergelijkbare niveaus dan de waargenomen voor de hoge agressieve MDA-MB-231 tumorcellen (gegevens niet weergegeven). Het is echter bekend dat orthotopische MCF-7 xenograft tumoren niet kunnen sentinel LNs bereiken, terwijl MDA-MB-231 tumoren spontaan metastaseren naar hen30. Het is duidelijk dat het belangrijkste knelpunt voor MCF-7 cellen LN-metastasevorming zich in stappen voordoet voordat ze LN's bereiken en zich eraan houden, zoals het onvermogen van MCF-7-cellen die efficiënt ontsnappen aan de primaire tumoren. Dus, de sterkte van de test hier beschreven is niet vast te stellen directe correlaties met LN-gemetastaseerde potentieel, maar is een eenvoudige methode om de lijm eigenschappen van een tumorcel kwantificeren in een meer realistische ECM in vitro. Door het gebruik van bevroren weefsels vertegenwoordigen de cryosecties de natuurlijke complexiteit van LN's in termen van structuur en samenstelling, wat onmogelijk zou zijn om te recreëren met behulp van synthetische technieken, met name die met behulp van gezuiverde ECM-eiwitten.
Aanvullende beperkingen van de methode zijn (1) het staat niet toe dat het chemotactische potentieel van factoren die door LN's worden afgescheiden, wordt geëvalueerd en dat (2) het niet informeert over de vraag of de celspecifieke hechting aan LN-secties het gevolg is van preferentiële binding met ECM-eiwitten, cellen of andere structuren die in LN-secties aanwezig zijn. Wij waren echter van mening dat deze aanpak relevant kon zijn en serieus moet worden overwogen voor bepaalde toepassingen, maar buiten het bereik van dit specifieke manuscript vielen. In een recente studie identificeerden we bijvoorbeeld het n-Myc downstream-gereguleerde gen 4 (NDGR4) als een mechanistische biomarker van LN metastase bij borsttumoren24. Mechanistisch, tumorcellen ontbreekt NDRG4 expressie verhogen hechting aan cryosecties van LAN's door de voorkeur aan de assemblage van β1-integrin receptoren aan de voorkant van borsttumorcellen. Bovendien, met behulp van extra controles, zoals gerechten bekleed met gezuiverde ECM eiwitten, ontdekten we dat differentiële hechting aan LN secties is een gevolg van selectieve associatie met vitronectine24.
Ten slotte is het vermeldenswaard dat deze methode niet beperkt is tot LNs-secties en kan worden ingesteld om celhechting aan verschillende levende organen te beoordelen, zoals cryosecties van milt of longen. Uitgezaaide cellen vertonen organotropisme en metingen van kleefkracht in bevroren delen van verschillende organen in vitro, kunnen een nuttig middel zijn om orgaanspecifieke kankerverspreiding te voorspellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Rosana De Lima Pagano en Ana Carolina Pinheiro Campos voor technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van: FAPESP - São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) en Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
