Her beskriver vi en enkel og rimelig metode som gjør det mulig å kvantifisere klebende tumorceller til lymfeknute (LN) kryoseksjoner. LN-tilhenger tumorceller identifiseres lett ved lysmikroskopi og bekreftes av en fluorescensbasert metode, noe som gir en vedhesindeks som avslører tumorcellebindende affinitet til LN parenchyma.
Tumordrenerende lymfeknuter (LAN) er ikke bare filtre for tumorprodusert avfall. De er en av de vanligste regionale stedene for midlertidig residens av spredte tumorceller hos pasienter med ulike typer kreft. Påvisning av disse LN-bosatte tumorcellene er en viktig biomarkør forbundet med dårlig prognose og adjuvant terapi beslutninger. Nyere musemodeller har indikert at LN-bosatte tumorceller kan være en betydelig kilde til ondartede celler for fjerne metastaser. Evnen til å kvantifisere adhesivity av tumorceller til LN parenchyma er en kritisk måler i eksperimentell forskning som fokuserer på identifisering av gener eller signalveier som er relevante for lymfatisk / metastatisk formidling. Fordi LN er komplekse 3D-strukturer med en rekke utseender og komposisjoner i vevsseksjoner avhengig av delens plan, er deres matriser vanskelige å gjenskape eksperimentelt in vitro på en fullt kontrollert måte. Her beskriver vi en enkel og rimelig metode som gjør det mulig å kvantifisere klebende tumorceller til LN kryoseksjoner. Ved hjelp av seriedeler av samme LN tilpasser vi den klassiske metoden utviklet av Brodt for å bruke ikke-radioaktive etiketter og teller direkte antall adhering tumorceller per LN overflateareal. LN-tilhenger tumorceller er lett identifisert av lys mikroskopi og bekreftet av en fluorescensbasert metode, noe som gir en vedhesjonsindeks som avslører cellebindende affinitet til LN parenchyma, som er tankevekkende bevis på molekylære endringer i affinitetbindingen av integrins til deres korrelerln-ligands.
Kreftmetastase er hovedårsaken til behandlingssvikt og det dominerende livstruende aspektet ved kreft. Som postulert for 130 år siden, den metastatiske spredningen resultater når en elite av spredte tumorceller (DTCs, “frø”) skaffe spesifikke biologiske evner som tillater dem å unngå primære steder og etablere ondartet vekst på fjerne steder (“jord”)1. Nylig har flere nye konsepter om “frø og jord” relasjoner dukket opp, for eksempel induksjon av premetastatiske nisjer (konseptualisert som en “fruktbar jord” som trengs for “frø” for å trives), selvsåing av primære svulster av DTCer, “frø” dvale i sekundære organer og parallell progresjonsmodell av metastase2.
For de fleste solide maligniteter kan DTCer bo og oppdages i mange mesenchymale organer, som benmarg og lymfeknuter (LAN) hos pasienter med eller uten tegn på klinisk metastase. Fordi tumordrenerende LN-er er den første plasseringen av den regionale spredningen av DTCer, er LN-status en viktig prognoseindikator og er ofte forbundet med adjuvant terapibeslutninger3. For noen tumortyper er korrelasjonen mellom LN-status og verre utfall sterk, inkludert hode og nakke4,5, bryst6, prostata7, lunge8, gastrisk9, kolorektal10,11 og skjoldbruskkjertelkreft12.
LNer er små ovale organer i lymfesystemet, som er dekket med retikulære celler og vedlagt med lymfatiske kar. Disse organene er helt nødvendige for immunsystemets funksjon13. LNer fungerer som tiltrekkende plattformer for immunsirkulerende celler, og bringer lymfocytter og antigenpresenterende celler sammen14. LNs tiltrekker seg imidlertid også sirkulerende tumorceller. Over flere tiår ble LN-er avbildet som passive transportruter for metastatiske tumorceller. Nyere studier har imidlertid indikert at tumorceller også kan styres mot LN-er ved kjemotaktisk (chemokiner) og/eller haptotaktiske (ekstracellulære matriseelementer) signaler utskilt av lymfeendotelet15. Som eksempler forenkler overuttrykk av CCR7-reseptoren i tumorceller veiledning av metastatiske melanomceller mot tumordrenerendeLN-er 16. I tillegg gir ekstracellulære LN-proteiner et selvklebende stillas for rekruttering og overlevelse av sirkulerende tumorceller17. Faktisk gir tumordrenerende LNer fruktbar jord for såing av DTCer, som kan opprettholdes i proliferative eller sovende tilstander ved spesifikke LN mikromiljøsignaler18. Den endelige skjebnen til disse LN-bosatte DTCs er kontroversiell; noen arbeider tyder på at disse cellene er passive indikatorer på metastatisk progresjon19, mens andre foreslår at de er mer sannsynlig ei grunnleggere av resistens (ved selvsåing primære steder) og / eller fungere som cellulære reservoarer for metastaser (spre “frø” for høyere kreftvekst)20,21. Nylig, ved hjelp av prekliniske modeller, har det blitt vist at en brøkdel av disse LN-bosatte DTCene aktivt invaderte blodkar, gikk inn i blodsirkulasjonen og koloniserte lungene21.
Tatt i betraktning at tilstedeværelsen av kreftceller i LN er en markør for kreft aggressivitet og invasivitet, i denne studien, optimaliserte vi en klassisk metode utviklet av Brodt22 for å kvantitativt måle tumorcellevedheking til LN in vitro. Bruken av en fluorescensbasert analyse tillot oss å utvikle en rimelig, rask, følsom og miljøvennlig (ikke-radioaktiv) protokoll for påvisning av klebende endringer mellom tumorceller og LN kryoseksjoner. Ved hjelp av MCF-7 brystkreftceller som uttrykker ulike nivåer av NDRG4 genuttrykk og rotte LN frosne seksjoner for å eksemplifisere metoden, viste vi at denne protokollen tillot en god sammenheng mellom tumorcellevedheking til LN in vitro og LN metastase observert hos brystkreftpasienter24.
Lymfatisk systemformidling av kreftceller krever en rekke komplekse celledrevne hendelser. De initierer med celleavløsning fra primær svulst og ombygging av den ekstracellulære matrisen (ECM) arkitektur, og støttes av vedvarende chemotaxis og aktiv migrasjon gjennom afferent lymfater på vei til sentinel LNer. Hvis kreftceller holder seg og overlever i LN-er, kan de lett spre seg til andre sekundære organer. Her beskriver vi en enkel metode for rask og rimelig funksjonell analyse av spesifikke selvklebende interaksj…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Rosana De Lima Pagano og Ana Carolina Pinheiro Campos for teknisk hjelp. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra: FAPESP – São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) og Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
2-propanol | Merck | 109634 | |
Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
Isofluran 100 mL | Cristália | ||
Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
RPMI | Gibco | 31800-022 | |
Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |